一种用于HSV-2核酸检测的试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种特异性检测单纯疱疹病毒2型核酸检测的taqman-mgb探针、引物、试剂盒及检测方法，适用于单纯疱疹病毒2型的定性定量检测。

背景技术：

单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus,hsv）属于疱疹病毒属α疱疹病毒科，是线性双链dna病毒，人类是单纯疱疹病毒唯一的自然宿主，分为2个血清型，即hsv-1和hsv-2，两者基因组序列同源性约为50%。hsv感染部位广泛，但两种亚型hsv在临床表现和传播途径及流行病学特征方面存在较大差异。hsv-1型主要引起生殖器以外的皮肤、口腔粘膜、扁桃体、鼻前庭的热性疱疹和溃疡以及眼角膜炎等。而hsv-2型主要引起生殖器官和腰部以下的感染。孕妇感染hsv-2后，可导致流产，胎儿发育迟缓，先天性畸形，智力障碍，视网膜脉络膜炎等，还可在分娩过程中由母亲传染给婴儿，从而导致新生儿疱疹，导致新生儿死亡或神经系统后遗症等。因此，早期快速准确检测和诊断分析hsv2感染对指导临床治疗、评估疾病的发展和预后（尤其是孕妇患者）具有积极意义。

目前临床检测技术主要包括病毒培养法、血清学和分子生物学检测法。直接病毒培养法技术复杂、耗时费力、对标本的运送、保存要求高、易污染、敏感性差而不适合临床快速诊断。免疫学检测法目前已被临床广泛使用，如elisa、ria和ifa等，但此法不是直接对病原体进行检测，多伴有非特异性反应，且受到感染时间的限制。感染早期未机体未产生抗体或抗体滴度较低时可导致假阴性，而感染患者在治愈后的很长一段时间内仍保持抗体高水平阳性可导致假阳性，均可导致临床误诊，因此仅以抗体检测结果不能准确判定单纯疱疹病毒感染情况和用药前后体内病毒拷贝数的变化情况。采用pcr方法检测标本中的hsv-2核酸，可显著提高检出率和准确性，但普通的pcr技术鉴定需要测序和比对，导致速度慢、成本高、易污染、结果分析步骤繁琐和操作要求高等缺陷。

pcr检测技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速准确，并可定量分析准确知道用药前后患者体内病毒拷贝数的变化等优点，得到了快速发展和临床的青睐。taqman-mgb探针法，在靶序列的特异性探针5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个mgb淬灭基团（小沟结合物）。通过靶序列特异性pcr引物、dna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性水解探针释放荧光报告基团，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性定量分析。基于实时荧光pcr检测技术的taqman-mgb探针法具有以下优点：（1）闭管操作，避免pcr产物污染；（2）快速，没有扩增后处理，直接读取检测结果；（3）实时监控，数据更真实，有效避免了传统终点法的弊端；（4）自动化程度高，荧光检测过程和结果分析全自动；（5）特异性高，靶序列特异性引物直接检测病原体核酸、靶序列特异性探针避免了sybrgreen等传统染料法的非特异性荧光信号；（6）高分辨率，mgb探针是无荧光本底的小沟结合物，取代了普通taqman探针的可发光淬灭基团；（7）高稳定性，mgb结合后，探针tm值提高，增加杂交稳定性和特异性；（8）应用更广，探针tm值提高使得探针长度设计可缩短，使得无法设计普通taqman探针的靶基因可采用taqman-mgb探针检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，尤其是当下采用taqman探针的淬灭基团（例如dabcyl、bhq1、bhq2）本身会发光而导致荧光本底噪音大分辨率低，本发明主要特点是在检测探针3’端标记本身不发光的小沟结合物（例如mgb），提供一种快速检测、特异性好、分辨率高的hsv-2检测单纯疱疹病毒2型核酸的taqman-mgb探针、引物、试剂盒及检测方法，从而满足快速准确检测的需求。

本发明通过以下技术方案加以实现：

用于单纯疱疹病毒2型检测的特异性荧光探针hsv2-p，其荧光探针序列为：5’-tccccagagcctgct-3’；所述单纯疱疹病毒2型荧光探针的两端分别进行修饰，5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记“特殊基团”即小沟结合物；标记的报告荧光素或荧光染料为fam或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料，例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；“特殊基团”为任何无荧光本底的小沟结合物，例如mgb。

用于单纯疱疹病毒2型检测的特异性引物对hsv2-f和hsv2-r，所述引物对的序列为：hsv2-f：5’-ctaccacgcgtcgcttttg-3’；hsv2-r：5’-ataaacgtgcggcccgtaa-3’。

进一步地，本发明一种用于hsv-2检测的试剂盒，还包括pcr反应液和阴性质控品。

进一步地，所述的阴性质控品为灭菌超纯水ddh20，所述的阳性质控品为含有单纯疱疹病毒2型hsv-2靶基因gg序列质粒溶液，所述靶基因gg序列为：5’-ctaccacgcgtcgcttttgctccccagagcctgctggtggggattacgggccgcacgtttat-3’。

进一步地，所述的单纯疱疹病毒2型hsv-2阳性质控品是通过在puc57质粒载体中插入所述靶基因gg序列（即包含单纯疱疹病毒2型hsv-2特异性引物对扩增产物片段的序列）重组制得。所述的单纯疱疹病毒2型hsv-2阳性质控品所含地重组质粒puc57-hsv2-gg浓度为1ng/μl。

进一步地，所述pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分。

根据本发明，所述检测单纯疱疹病2型hsv-2的反应体系为20μl，包括pcr反应液（2x）10μl，正向引物hsv2-f0.8μl（10μm），反向引物hsv2-r0.8μl（10μm），荧光探针hsv2-p0.8μl（10μm），参比荧光roxreferencedyeii（50x）0.4μl，被检测样本地dna提取物2-5μl，ddh2o补至20μl。

根据本发明，所述试剂盒的实时荧光pcr扩增的反应时间和温度为：95℃，5min，1个循环；95℃，10s，60℃，50s，40个循环并收集荧光信号。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本试剂盒不仅具有实时荧光pcr的taqman探针法的快速准确、特异性高、重复性好、自动化、灵敏度高等全部优点；此外，mgb探针是无荧光本底的小沟结合物，取代了普通taqman探针的可发光淬灭基团（例如dabcyl、bhq1、bhq2），降低了本底荧光信号噪音，具有更高的分辨率；mgb结合后，探针tm值提高，增加杂交稳定性和特异性；应用更广，探针tm值提高使得探针长度设计可缩短，使得无法设计普通taqman探针的靶基因可采用taqman-mgb探针检测，同时较短的探针可降低成本。因而，能充分满足临床检测需求，具有广泛的市场应用潜力。

附图说明

图1为单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测的taqman-mgb荧光探针hsv2-p的质检hplc图；

图2为单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测的特异性上游引物hsv2-f的质检hplc图；

图3为单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测的特异性下游引物hsv2-r的质检hplc图；

图4为puc57质粒载体构成示意图；

图5为单纯疱疹病毒2型hsv-2靶基因gg的重组质粒puc57-hsv2-gg构成示意图；

图6为单纯疱疹病毒2型hsv-2靶基因gg的重组质粒puc57-hsv2-gg的ndei酶切凝胶电泳鉴定图。m：dnamarkeriii；1：经ndei酶切后的puc57-hsv2-gg质粒；2：未做任何处理的puc57-hsv2-gg质粒；

图7为单纯疱疹病毒2型hsv-2的阳性质控品、阴性质控品、空白对照和12种病原体的核酸提取物的实时荧光pcr检测图。图中s型曲线为hsv-2阳性质控品，其余包括单纯疱疹病毒1型hsv-1、解脲/生殖/人型支原体、淋球菌、沙眼衣原体、人乳头瘤病毒、结核分枝杆菌、巨细胞病毒、eb病毒、肺炎支原体、乙肝病毒、白色念珠菌、登革热病毒核酸提取物均未扩增；

图8为单纯疱疹病毒2型hsv-2的阳性质控品的实时荧光pcr检测图。图中从左至右的曲线分别对应单纯疱疹病毒2型hsv-2阳性质控品的浓度从高到低（1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl）；

图9为图8对应的标准曲线图；

图10为单纯疱疹病毒2型hsv-2的阳性质控品实时荧光pcr扩增后的产物凝胶电泳图。m：dl500dnamarker；-：阴性质控品扩增结果；b：空白对照扩增结果；s6-1：阳性质控品的浓度从低到高（10^-5ng/μl、10^-4ng/μl、10^-3ng/μl、10^-2ng/μl、10^-1ng/μl、1ng/μl）的扩增结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，并给出具体实施方式。

实施例1：目标片段、引物和探针的设计

1、通过ncbi数据库查找单纯疱疹病毒2型hsv-2的virionglycoproteing（gg）基因序列（genebankid为z86099.2），通过gg基因的同源性比对验证，筛选出单纯疱疹病毒2型hsv-2特异性gg基因靶序列。

2、使用primerexpress3.0软件，对单纯疱疹病毒2型特异性gg基因靶序列分别设计了特异性引物对和其特异性的探针。所述探针5’端标记报告荧光素或荧光染料（本例标记fam），3’端标记小沟结合物（本例标记mgb）。靶基因序列、引物和探针均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物和探针均为hplc纯化，冻干粉-80℃保存。对特异性引物对和探针进行质检分析，结果如图1、2和3所示。采用ddh20稀释至10μm用于常规使用。

设计出的靶基因序列、探针和引物对分别为：

靶基因序列hsv2-gg：5’-ctaccacgcgtcgcttttgctccccagagcctgctggtggggattacgggccgcacgtttat-3’(seqidno.1)

荧光探针hsv2-p：5’-tccccagagcctgct-3’(seqidno.2)

正向引物hsv2-f：5’-ctaccacgcgtcgcttttg-3’(seqidno.3)

反向引物hsv2-r：5’-ataaacgtgcggcccgtaa-3’(seqidno.4)。

实施例2：pcr反应液，单纯疱疹病毒2型阳性质控品和阴性质控品

1、pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分，可以使用购自杭州擎科梓熙生物技术有限公司的pcr反应液，例如（tse301）2xt5fastqpcrmix(probe)。

2、单纯疱疹病毒2型hsv-2阳性质控品的制备：采用单纯疱疹病毒2型hsv-2特异性引物对扩增人工合成的靶基因序列(seqidno.1)，通过基因工程方法构建puc57-hsv2-gg重组质粒，转导至top10菌进行质粒扩增和提取质粒，此质粒溶液即为单纯疱疹毒2型hsv-2阳性质控品。用于构建md19-t-hsv2-gg重组质粒的puc57质粒载体示意图如图4所示，阳性质控品中的puc57-hsv2-gg重组质粒示意图如图5所示。重组质粒puc57-hsv2-gg的ndei酶切凝胶电泳鉴定结果如图6所示。

3、阴性质控品为ddh20。

4、本发明试剂盒应包括前述探针和引物、pcr反应液，单纯疱疹病毒2型阳性质控品和阴性质控品。

实施例3：检测方法

1、模板dna制备：用无菌生理盐水1ml洗涤分泌物拭子，吸取全部洗涤液转至1.5ml离心管，12000rpm离心5min；去上清，取沉淀加入50μlddh20混匀，100°c恒温处理10min；12000rpm离心5min，取上清液作模板备用。

2、标准曲线制作：单纯疱疹病毒2型hsv-2阳性质控品，稀释浓度至1ng/μl，然后10倍梯度稀释获得6个浓度梯度s1-6，即1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl。采用hsv2-p、hsv2-f和hsv2-r对s1-6在abi7500进行实时荧光pcr检测并生成标准曲线，并将扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图8、图9和图10所示。线性关系良好（r²=0.999）；反应效率高(eff%=91.972％)。

3、pcr扩增：反应体系组分如表1所示，反应程序如表2所示。

表1单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测的扩增体系组成

表2单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测的反应程序

4、结果分析：

反应结束后，基线的选取设置为“自动”。阈值(threshold)设定原则是阈值线刚好超过阴性质控品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点。质量控制：阴性质控品和空白对照的ct值均为>40或“undetermined”，阳性质控品ct值≤35，否则本次实验无效，全部实验应重新进行。待测样本的检测结果分析如表3所示。

表3单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测结果的解释

应用实施例1：

收集单纯疱疹病毒1型hsv-1、解脲/生殖/人型支原体、淋球菌、沙眼衣原体、人乳头瘤病毒、结核分枝杆菌、巨细胞病毒、eb病毒、肺炎支原体、乙肝病毒、白色念珠菌、登革热病毒的阳性临床标本各1例、单纯疱疹病毒2型hsv-2阴性临床标本40例和阳性临床标本40例（已采用中山大学达安基因诊断中心提供的商品化单纯疱疹病毒2型检测试剂盒验证），并提取的dna溶液作为本发明试剂盒的模板进行单纯疱疹病毒2型hsv-2实时荧光pcr检测。结果均无特异性扩增，本试验检测结果分析如表4所示。单纯疱疹病毒2型hsv-2的阳性质控品、阴性质控品、空白对照和12种病原体的核酸提取物的实时荧光pcr检测结果如图7所示。

表4应用实施例检测结果