锌吸附菌株的应用及锌吸附菌株的培养方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种锌吸附菌株的应用，及所述锌吸附菌株的培养方法。

背景技术：

锌是一种在地球上储量较为丰富的重金属资源。我国锌矿资源储量位居世界第二，锌资源广泛应用于现代工业化生产如冶炼、制药及食品行业之中。锌是人体不可缺少的元素，它广泛存在人体肌肉及骨骼中，但是含量甚微，如果超量就会发生严重后果。含锌废水的排放对人体健康和工农业活动具有严重危害，具有持久性、毒性大、污染严重等危害，一旦进入环境后不能被生物降解，大多数参与食物链循环，并最终在生物体内积累，破坏生物体正常生理代谢活动，危害人体健康。随着人类对重金属的开采、冶炼、加工等生产活动的日益增加，产生的重金属废水无论是从数量上还是种类上都大大增加，造成了严重的环境污染和资源浪费。因此含锌废水的治理仍是世界环保领域的重大研究课题。

目前，国内外根据其处理手段的不同，可分为物化法和生物法，根据锌在溶液中存在的形态不同，常用的处理方法分两类：第一类是使废水中呈溶解状态的锌；第二类是使废水中的重金属在不改变其他化学形态的条件下进行浓缩和分离，具体有反渗透法、电渗析法、蒸发浓缩法。通常采用第一种方法，第二种方法只有在特殊情况下才采用。从90年代开始，世界各国致力于研究微生物法处理含锌废水。通过对比传统的物理方法，这些方法不同程度上存在投资大，运行费用高，治理后的水难以达标，污泥产量大等问题。微生物法投资少，且没有二次污染，但是现有技术中的微生物法普遍处理效率不高，对锌离子的吸附率不高，导致其应用一直受限，无法扩大生物法市场的应用范围。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明通过提供锌吸附菌株新的具体应用、该锌吸附菌株的培养方法，以及可用于锌吸附来解决前述需求，尤其是对于城市污染中的黑臭水体具有很好的治理作用，该方法绿色环保，成本低，耗时时间短，操作方便，通过这种采用生物治理的方法，48小时锌离子吸附降解率可高达98％左右，黑臭水体中的锌离子重金属浓度可以降到非常低，同时对cod和总磷等指标均具有一定降解作用，故该菌株在水污染处理重金属锌离子方面具备巨大潜能，应用前景广阔。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种分离的锌吸附菌株在锌吸附方面具有很好的应用，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno:15930；保藏时间为：2018年06月11日。

该菌株的菌落形态描述特征为：直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，菌落小短杆状，菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐，颜色呈浅乳黄色，中央略凸起。

本申请提供的革兰氏阴性杆菌(pseudomonasprotegens)，菌株名为bnn-1，从黑臭底泥中分离得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno:15930；保藏时间为：2018年06月11日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，检测为存活菌株并保藏。

本发明还提供了上述锌吸附菌株的培养方法，所述培养方法为将所述锌吸附菌株在包含营养肉汤培养基的培养体系中培养。

优选地，培养体系为硫酸锌母液添加到营养肉汤培养基中，灭菌所得；

优选地，灭菌的温度为110-120℃，灭菌的时间为10-20min；

更优选地，115℃灭菌15min。

优选地，所述硫酸锌母液的配制方法包括：将znso4·7h2o与水搅拌混合均匀，即得；

优选地，所述硫酸锌母液的浓度为3-7g/l，更优地为5g/l。

优选地，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨8-12g/l，牛肉粉1-4g/l，氯化钠3-6g/l，葡萄糖0.5-3g/l；

优选地，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖1g/l。

优选地，所述培养体系中，锌离子的浓度控制在50mg/l以上。

优选地，所述锌离子的浓度为60-70mg/l之间。

优选地，所述步骤(b)中，培养温度为28-35℃之间，培养时间为24-48h。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1的锌吸附菌株在营养肉汤培养基的生产曲线的测定结果。

本申请提供的锌吸附菌株(pseudomonasprotegens)，菌株名为bnn-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno:15930；保藏时间为：2018年06月11日，检测为存活菌株并保藏。

具体实施方式

本发明涉及一种对重金属锌吸附效果优异的锌吸附菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno:15930；保藏时间为：2018年06月11日。

该菌株具有很强的锌吸附能力，尤其是对于城市污染中的黑臭水体具有很好的治理作用，48小时锌离子吸附降解率可高达98％左右，黑臭水体中的锌离子重金属浓度可以降到非常低，同时对cod和总磷等指标均具有一定降解作用，故该菌株在水污染处理重金属锌离子方面具备巨大潜能，应用前景广阔。

本发明请求保护上述保藏编号的锌吸附菌株在锌吸附方面的应用，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的锌吸附能力的突变菌株。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将锌吸附菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。

本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一锌吸附菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的锌吸附菌株。

所述组合物用于工业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是工业方面常常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。

本发明还提供了一种锌吸附菌株的培养方法，具体包括如下步骤：

将所述锌吸附菌株在包含营养肉汤培养基的培养体系中培养，所述培养体系为硫酸锌母液添加到营养肉汤培养基中，灭菌所得。

优选地，灭菌的温度为110-120℃，灭菌的时间为10-20min；

更优选地，115℃灭菌15min。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述硫酸锌母液的配制方法包括：将znso4·7h2o与水搅拌混合均匀，即得；

优选地，所述硫酸锌母液的浓度为3-7g/l，更优地为5g/l。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨8-12g/l，牛肉粉1-4g/l，氯化钠3-6g/l，葡萄糖0.5-3g/l；

优选地，所述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖1g/l。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述富集培养基与所述分离培养基中，锌离子的浓度控制在50mg/l以上。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述锌离子的浓度为60-70mg/l之间。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(b)中，培养温度为28-35℃之间，培养时间为24-48h。

上述分离纯化方法中的锌吸附菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno:15930；保藏时间为：2018年06月11日。该菌株在之前的申请中已经保藏过。

其实，最开始初步筛选菌株时采用的是营养肉汤培养基从黑底臭泥中分离得到的菌株形成的黑臭底泥样品，该样品中的菌株既含有优异的锌吸附效果，又含有优异的氨氮降解效果，为了强化该菌株某一方面的效果，后续又采用了特定的富集培养基以及分离培养基进行了复筛。

当复筛时，强化具有锌吸附功能的菌株时，所采用的富集培养基以及分离培养基均是基础营养肉汤培养基添加一定量的硫酸锌母液，两个培养基中的锌离子浓度没有确切的要求，一般是控制在50mg/l以上，更优地为浓度为60-70mg/l之间，还可以为55mg/l、57mg/l、58mg/l、65mg/l等。

当复筛时，强化具有氨氮降解功能的菌株时，具体的分离纯化方法按照如下步骤进行：

(a)将黑臭底泥样品接种于富集培养基上，培养驯化得到混合菌液；

(b)将所述混合菌液接种到氨氮分离培养基上，采用稀释涂布的方法，多次划线直至得到形态单一的菌落。

优选地，所述步骤(a)中，培养温度为25-30℃之间，培养时间为20d以上。

优选地，所述步骤(a)中，培养温度为28℃恒温，培养时间为21d。

优选地，所述步骤(a)中，所述富集培养基的组成为：葡萄糖8g/l-12g/l、硫酸铵1g/l-3g/l、氯化钠0.5g/l-1.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l-1.5g/l、硫酸镁0.5g/l-1.5g/l、溶剂为水。

优选地，富集培养基的组成为：葡萄糖10g/l、硫酸铵2g/l、氯化钠1.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、硫酸镁1.0g/l、溶剂为水。

上述富集培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基(再添加10g/l～20g/l的琼脂)。

实际操作时，富集用培养基的组成为：葡萄糖10.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。

优选地，氨氮分离培养基组成为：葡萄糖4g/l-7g/l、硫酸铵0.1g/l-0.3g/l、氯化钠0.5g/l-1.5g/l、磷酸氢二钾0.3g/l-0.7g/l、硫酸镁0.1g/l-0.3g/l、溶剂为水。

更优地，氨氮分离培养基组成为：葡萄糖5g/l、硫酸铵0.25g/l、氯化钠1.0g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、硫酸镁0.25g/l、溶剂为水。

实际操作时，锌吸附用分离培养基的组成为：葡萄糖5.0g，硫酸铵0.25g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，水1000ml。

上述氨氮分离培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基(再添加10g/l～20g/l的琼脂)。

优选地，所述步骤(b)中，培养温度为28-35℃之间，培养时间为24-48h。

更优地，培养温度为30℃恒温。

上述方法通过富集、分离纯化的方法从黑臭底泥中最终得到目标菌种，后续对该菌种进行了生长曲线的测定以及对其锌吸附效果进行了评定，具体可见下述实施例以及实验例的具体过程。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

锌吸附菌株的培养方法具体包括如下步骤：

1)配制锌吸附母液：将znso4·7h2o与水搅拌混合均匀，浓度为7g/l；

2)营养肉汤培养基：蛋白胨12g/l，牛肉粉1g/l，氯化钠6g/l，葡萄糖0.5g/l，溶剂为水，配制锌吸附富集用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度70mg/l，110℃10min灭菌后备用，同时配制分离用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度60mg/l，120℃20min灭菌后备用；

3)将黑臭底泥样品(营养肉汤培养基从海臭底泥中培养初筛得到)在上述富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行三代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温30℃；

4)将菌液接种到上述分离用培养基上，从耐受驯化三次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在35℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；

5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。

实施例2

锌吸附菌株的培养方法具体包括如下步骤：

1)配制锌吸附母液：将znso4·7h2o与水搅拌混合均匀，浓度为3g/l；

2)营养肉汤培养基：蛋白胨8g/l，牛肉粉4g/l，氯化钠3g/l，葡萄糖3g/l，溶剂为水，配制锌吸附富集用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度65mg/l，115℃15min灭菌后备用，同时配制分离用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度50mg/l，115℃15min灭菌后备用；

3)将黑臭底泥样品(营养肉汤培养基从海臭底泥中培养初筛得到)在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行四代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温25℃；

4)将菌液接种到上述分离用培养基上，从耐受驯化四次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在28℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；

5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。

实施例3

锌吸附菌株的培养方法具体包括如下步骤：

1)配制锌吸附母液：将znso4·7h2o与水搅拌混合均匀，浓度为5g/l；

2)营养肉汤培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖1g/l，溶剂为水，配制锌吸附富集用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度60mg/l，115℃15min灭菌后备用，同时配制分离用培养基，按照比例将锌吸附母液添加到营养肉汤培养基中，锌离子的浓度50mg/l，115℃15min灭菌后备用；

3)将黑臭底泥样品(营养肉汤培养基从海臭底泥中培养初筛得到)在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行四代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温25℃；

4)将菌液接种到上述分离用培养基上，从耐受驯化四次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在30℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；

5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s，后续菌株的培养方法可以采用营养肉汤培养基也可采用锌离子耐受培养基，锌离子的添加方式与分离纯化方法中的培养基基本无异。

实验例1

对本发明实施例1的锌吸附菌种在营养肉汤中中活化3代后，再进行生长曲线测定。活化跟生长曲线测定都在恒温摇床上进行，培养温度为30℃，摇床转速为150rpm，每2-4h取样，测在600nm条件下的吸光值。具体生长曲线的测定结果如图1所示，图中横坐标的单位为h。

实验例2

将本发明实施例3筛选得到的锌吸附菌种按照5％的接种量接种到9个不同程度的污染样品中，其中样品序号10的污染样品中不接菌，作为空白对照。恒温培养24-48h，结束培养，用hj700-2014法测培养液中锌离子的残留量，根据公式吸附率降解率＝培养前前锌离子浓度含量-培养后中锌离子浓度含量/培养前锌离子浓度的含量×100％，具体结果见下表1所示。

表1不同样品降解程度

以上9个样品均来自污水污泥样品，锌离子吸附率最高的达到了98％左右，最低的也达到了85％，而且通过重复样品进行检测后，菌种的吸附率最终都可以稳定在80％以上，吸附锌离子效果优异，同时发现对污水污泥样品中的cod和总磷等指标也具有一定的降解作用。

通过将其他实施例的菌种进行上述试验也能够得到相同的试验结果。

本发明具有以下至少一种优点：采用实验室可操作性强的分离手段，在实验室模拟现场的处理方式，并在实验室做了不同浓度的氨氮，设置的浓度高于实际的浓度，有利于今后的实际应用；另外该菌株采用的高效手段的驯化方法，增强了菌株在恶劣环境中的耐受程度，在今后的实际应用中，比没有经过驯化的菌种适应性更强。对今后的现实应用减少了使用风险。该菌株的降解效率比市场上现有的菌剂降解效率更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。