脯氨酸光学探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及光学探针技术领域，尤其涉及一种脯氨酸光学探针及其制备方法和应用。

背景技术：

脯氨酸作为20种天然氨基酸之一，广泛的分布于各种动植物中。在植物体中，脯氨酸积累是一个非常常见并且重要的现象。当植物受到外界环境的危害时，植物体内的脯氨酸含量会发生剧烈增加，这一现象产生的机制以及其在植物体中的生理作用仍然没有被研究清楚。而在哺乳动物细胞中，脯氨酸作为一个非必须氨基酸其生理作用在一开始并没有被广泛的认知，仅仅是作为一个蛋白质合成的原料并且由于其结构的特殊使其对蛋白质的骨架结构的维持有着重要的作用。但近年来，随着脯氨酸代谢通路对于细胞内ros的调控作用的发现，人们逐渐的又将目光重新的聚焦到了哺乳动物细胞中脯氨酸及其代谢通路的研究上。

哺乳动物中脯氨酸代谢主要是在细胞胞质和线粒体中进行的，主要是脯氨酸通过线粒体上的转运蛋白质进入线粒体中，通过线粒体内膜上的一个脯氨酸氧化酶(pox/prodh)将脯氨酸氧化脱氢后生成δ1-吡咯啉-5-羧酸(p5c)，而p5c穿梭回胞质并且通过胞质中的pycr(p5c还原酶)转变回脯氨酸。这样就形成了一个脯氨酸代谢的循环。δ1-吡咯啉-5-羧酸(p5c)在胞质中可以与gsa(谷氨酸-γ-半醛)形成一个互变异构平衡，最后gsa一方面可以通过p5cdh脱氢生成谷氨酸进入三羧酸循环进行代谢而另一方面则是可以通过鸟氨酸转氨酶生成鸟氨酸进入尿素循环进行代谢。总的来说就是pox和pycr(p5cdh)对p5c和脯氨酸在胞质和线粒体之间的相互转化的调节形成的代谢通路我们称之为脯氨酸循环(liuw等，biofactors.2012,38(6):398-406；liuw等autophagy.2012,8(9):1407-1409；liuw等，cancerres.2012,72(14):3677-3686)。

近年来研究发现脯氨酸氧化酶(pox)基因能通过促进细胞周期停滞、诱导细胞分化及促进细胞的凋亡等途径负性调节肿瘤细胞的生长，并在多种肿瘤中发现其表达的异常。脯氨酸在pox的作用下氧化脱氢生成p5c的同时也消耗adp产生atp以及一个自由电子，该电子在线粒体内的电子呼吸链中传递的过程中伴随着ros(反应活性氧)的生成，而ros则是对细胞的凋亡，增殖以及细胞周期有着至关重要的调控(liuy等，cancerres.2009,69(16):6414-6422；phangjm等，szabadosl等，trendsplantsci.2010,15(2):89-97；pandharej等，jbiolchem.2006,281(4):2044-2052；liuy等，oncogene.2006,25(41):5640-5647)。

正是由于脯氨酸具有上述重要的作用，因此脯氨酸含量的检测也尤为重要。脯氨酸的常用检测方法包括酸性茚三酮显色法(chen等,applieenvironmentalmicrobiology2006,72:4001–4006)、分光光度计(hortalama等，jamchemso2003,125(1):20-21；puf等，analchem2010,82(19):8211-8216)、高效液相色谱法(waduds等，journalofchromatographyb,analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences2002,767(2):369-374)等。

但是这些方法并不适用于活细胞研究，存在很多缺陷：需要经过耗时的样品处理过程，例如细胞破碎、分离提取纯化等；不能在活细胞和亚细胞器中进行原位、实时、动态、高通量和高时空分辨率的检测。本领域仍需要能在细胞内、外实时定位、定量、高通量检测脯氨酸的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测脯氨酸的探针和方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种脯氨酸光学探针，包含脯氨酸敏感多肽或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于脯氨酸敏感多肽或其功能变体的序列内。脯氨酸敏感多肽或其功能变体被光学活性多肽或其功能变体分为第一部分和第二部分。在一个实施方式中，本发明光学探针对脯氨酸敏感。

本发明提供了一种脯氨酸光学探针，包括脯氨酸敏感多肽b和光学活性多肽a，其中光学活性多肽a位于脯氨酸敏感多肽b的序列内，将脯氨酸敏感多肽b分为第一部分b1和第二部分b2，形成b1-a-b2式的探针结构。

在一个实施方式中，脯氨酸敏感多肽包括脯氨酸结合蛋白或其功能变体。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白源自农杆菌，例如agrobacteriumfabrum。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白源自atu2422-gaba受体蛋白或其类似物。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白包括atu2422-gaba受体蛋白或其功能变体。在一个具体实施方式中，脯氨酸结合蛋白具有seqidno:1所示的序列或其功能变体，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列。

在一个实施方式中，光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体。在一个实施方式中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋白(如seqidno:2所示的cpyfp)、橘黄色荧光蛋白(如seqidno:3所示的cpmorange)、红色荧光蛋白(如seqidno:4或8所示的mkate，如seqidno:5所示的mcherry)、绿色荧光蛋白(如seqidno:6所示的cpgfp)、蓝色荧光蛋白(如seqidno:7所示的cpbfp)、苹果红荧光蛋白(如seqidno:9所示的cpmapple)。优选地，光学活性多肽是cpyfp。在一个实施方式中，荧光蛋白具有seqidno:2-9中任一所示的序列。

在一个实施方式中，光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头，例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中，接头位于光学活性多肽的n端和/或c端。在一个实施方式中，本发明光学探针不包含接头。在一个实施方式中，光学探针如下所示：脯氨酸敏感多肽的第一部分b1-光学活性多肽a-脯氨酸敏感多肽的第二部分b2。

在一个实施方式中，本发明光学探针还包含定位序列，用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。

本发明所述光学活性多肽可以位于或融合到脯氨酸敏感多肽的任何位置。在一个实施方式中，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的选自以下的区段内：残基117-123、残基249-259和残基323-330，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。在一个实施方式中，光学活性多肽置换脯氨酸敏感多肽的选自以下的区段内的一个或多个氨基酸：残基117-123、残基249-259和残基323-330，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。

在一个实施方式中，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的选自以下的位点：117/118，117/119，117/120，117/121，118/119，118/120，118/121，119/120，119/121，120/121，120/122，120/123，121/122，121/123，122/123，249/250，249/251，249/252，249/253，249/254，249/255，249/256，249/257，249/258，249/259，250/251，250/252，250/253，250/254，250/255，250/256，250/257，250/258，250/259，251/252，251/253，251/254，251/255，251/256，251/257，251/258，251/259，252/253，252/254，252/255，252/256，252/257，252/258，252/259，253/254，253/255，253/256，253/257，253/258，253/259，254/255，254/256，254/257，254/258，254/259，255/256，255/257，255/258，255/259，256/257，256/258，256/259，257/258，257/259，258/259，323/330，324/330，325/330，326/327，326/328，326/329，326/330，327/328，327/329，327/330，328/329，328/330和329/330。本文中，如果以“x/y”形式表示的位点中的两个数字是连续的整数，则表示光学活性多肽位于该数字所述的氨基酸之间。例如位于位点117/118表示光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的氨基酸117与118之间。如果以“x/y”形式表示的位点中的两个数字不是连续的整数，则表示光学活性多肽置换该数字所示氨基酸之间的氨基酸。例如位于位点249/259表示光学活性多肽置换脯氨酸敏感多肽的氨基酸250-258。优选地，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的下述位点：120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330。

在示例性实施方式中，本发明b1-a-b2式光学探针可为当cpyfp位于atu2422的120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330时形成的探针，如seqidno:10-15所示。在一个实施方式中，本发明光学探针具有seqidno:10-15所示序列或由其组成。

本发明还提供具有一个或多个突变的脯氨酸敏感多肽，包括具有一个或多个突变的脯氨酸结合蛋白。所述氨基酸突变包括氨基酸的修饰、取代、缺失或序列的截短。在一个实施方式中，所述突变可选自脯氨酸敏感多肽的f77，a100，t102，d121，y150，d226，g227和y275等位点的突变。示例性地，所述突变选自脯氨酸敏感多肽的f77s，f77y，f77c，f77l，f77p，f77h，f77q，f77w，f77i，f77t，f77n，f77k，f77r，f77v，f77a，f77d，f77e，f77m，f77a，a100s，a100y，a100c，a100l，a100p，a100h，a100q，a100w，a100r，a100i，a100t，a100n，a100k，a100m，a100v，a100f，a100d，a100e，a100g，t102s，t102y，t102c，t102l，t102p，t102h，t102q，t102w，t102r，t102i，t102a，t102n，t102k，t102m，t102v，t102f，t102d，t102e，t102g，d121s，d121y，d121c，d121l，d121p，d121h，d121q，d121w，d121i，d121t，d121n，d121k，d121r，d121v，d121a，d121f，d121e，d121m，d121a，y150s，y150t，y150c，y150l，y150p，y150h，y150q，y150w，y150r，y150i，y150a，y150n，y150k，y150m，y150v，y150f，y150d，y150e，y150g，d226s，d226t，d226c，d226l，d226p，d226h，d226q，d226w，d226r，d226i，d226a，d226n，d226k，d226m，d226v，d226f，d226y，d226e，d226g，g227s，g227t，g227c，g227l，g227p，g227h，g227q，g227w，g227r，g227i，g227a，g227n，g227k，g227m，g227v，g227f，g227y，g227e，g227d，y275s，y275t，y275c，y275l，y275p，y275h，y275q，y275w，y275r，y275i，y275a，y275n，y275k，y275m，y275v，y275f，y275g，y275e和y275d。在一个实施方式中，上述突变选自f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n和y275f。在一个实施方式中，本文所述脯氨酸敏感多肽在seqidno:1所示的序列，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列中包含选自以下位点处的突变：f77，a100，t102，d121，y150，d226和y275。

本发明光学探针中的脯氨酸敏感多肽(例如脯氨酸结合蛋白)可包含一个或多个氨基酸突变。在一些实施方式中，光学探针中的脯氨酸敏感多肽包括本文所述具有一个或多个突变的脯氨酸结合蛋白。所述突变包括氨基酸的修饰、取代、缺失或截短。在一个实施方式中，所述突变选自脯氨酸敏感多肽的f77，a100，t102，d121，y150，d226，g227和y275等位点的突变。示例性地，所述突变选自脯氨酸敏感多肽的f77s，f77y，f77c，f77l，f77p，f77h，f77q，f77w，f77i，f77t，f77n，f77k，f77r，f77v，f77a，f77d，f77e，f77m，f77a，a100s，a100y，a100c，a100l，a100p，a100h，a100q，a100w，a100r，a100i，a100t，a100n，a100k，a100m，a100v，a100f，a100d，a100e，a100g，t102s，t102y，t102c，t102l，t102p，t102h，t102q，t102w，t102r，t102i，t102a，t102n，t102k，t102m，t102v，t102f，t102d，t102e，t102g，d121s，d121y，d121c，d121l，d121p，d121h，d121q，d121w，d121i，d121t，d121n，d121k，d121r，d121v，d121a，d121f，d121e，d121m，d121a，y150s，y150t，y150c，y150l，y150p，y150h，y150q，y150w，y150r，y150i，y150a，y150n，y150k，y150m，y150v，y150f，y150d，y150e，y150g，d226s，d226t，d226c，d226l，d226p，d226h，d226q，d226w，d226r，d226i，d226a，d226n，d226k，d226m，d226v，d226f，d226y，d226e，d226g，g227s，g227t，g227c，g227l，g227p，g227h，g227q，g227w，g227r，g227i，g227a，g227n，g227k，g227m，g227v，g227f，g227y，g227e，g227d，y275s，y275t，y275c，y275l，y275p，y275h，y275q，y275w，y275r，y275i，y275a，y275n，y275k，y275m，y275v，y275f，y275g，y275e和y275d。在一个实施方式中，本发明光学探针中的氨基酸敏感多肽可包含选自以下的突变：f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n和y275f。

在一个实施方式中，本发明光学探针包含脯氨酸敏感多肽或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于脯氨酸敏感多肽或其功能变体的序列内，所述脯氨酸敏感多肽包含选自以下位点处的突变：f77，a100，t102，d121，y150，d226和y275，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。在上述实施方式中，脯氨酸敏感多肽可在seqidno:1所示的序列，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列中包含选自以下位点处的突变：f77，a100，t102，d121，y150，d226和y275。

在示例性实施方式中，本发明b1-a-b2式光学探针可为atu2422的121/122位点融合有cpyfp并且具有f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n或y275f突变时形成的探针，如seqidno:16-24所示。在一个示例性实施方式中，本发明光学探针具有seqidno:16-24所示序列或由其组成。

本发明提供的光学探针包含氨基酸序列seqidno:10-24中任一或其变体。在一个实施方式中，本发明提供的光学探针包含与氨基酸序列seqidno:10-24中任一有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列。在优选实施方式中，本发明提供的光学探针包含与氨基酸序列seqidno:10-24中任一实质上相似或相同的序列。在更优选的实施方式中，本发明提供的光学探针包含seqidno:23或由其组成。

本发明还提供融合多肽，包含本文所述光学探针和其它多肽。在一些实施方式中，本文所述光学探针还包含与之融合的其它多肽。本文所述其他多肽不影响光学探针的性质。在一些实施方式中，其他多肽位于所述光学探针的n端和/或c端。在一些实施方式中，其他多肽包括将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。本文所述融合多肽中的光学探针和其它多肽之间可具有接头。

本文所述亚细胞器包括细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、细胞膜、高尔基体、溶酶体和过氧化物酶体等。在一些实施方式中，用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签包括6组氨酸(6*his)、谷胱甘肽硫转移酶(gst)、flag。

本发明还提供编码本文所述光学探针或融合多肽的核酸序列或其互补序列。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸序列，其编码seqidno:10-24中任一所示氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明核酸序列包含核苷酸序列seqidno:25-26中任一或其变体。在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含与核苷酸序列seqidno:25-26中任一具有99％、95％、90％、80％、70％或50％相同性的序列。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含与核苷酸序列seqidno:25-26中任一实质上相似或相同的核苷酸序列。

本发明还涉及上述核酸序列的互补序列或其变体，其可包含编码本发明光学探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。

本发明中的氨基酸序列和核酸序列优选以分离形式提供，更优选地被纯化至均质。

本发明还提供包含与表达控制序列操作性连接的本发明所述的核酸序列或其互补序列的表达载体，该核酸序列编码本发明所述光学探针或融合多肽。在一些实施方式中，表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。在一些实施方式中，原核表达载体例如由质粒prsetb与本文所述的核酸序列操作性连接得到。在一些实施方式中，表达控制序列包括复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点。

本发明还提供包含本发明所述表达载体的细胞，该表达载体包含与表达控制序列操作性连接的本发明所述的核酸序列或其互补序列。所述细胞表达本文所述光学探针或融合多肽。

本发明还提供包括本文所述脯氨酸光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的脯氨酸光学探针或融合多肽的检测试剂盒。所述试剂盒检测脯氨酸。

本发明提供制备本文所述光学探针的方法，包括：提供包含表达本文所述光学探针或融合多肽的载体的细胞，在所述细胞表达的条件下培养所述细胞，和分离光学探针或融合多肽。

在一个实施方式中，制备本文所述脯氨酸光学探针或融合多肽的方法包括：1)将编码本文所述脯氨酸光学探针的表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离脯氨酸光学探针。

本发明还提供检测样品中脯氨酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与样品接触，和检测光学活性多肽的变化。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位进行。所述样品例如血液。

本文还提供定量样品中脯氨酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与样品接触，检测光学活性多肽的变化，和根据光学活性多肽的变化定量样品中的脯氨酸。

本发明还提供筛选化合物(例如药物)的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与候选化合物接触，检测光学活性多肽的变化，和根据光学活性多肽的变化筛选化合物。所述方法可以高通量地筛选化合物。

本发明还提供本文所述脯氨酸光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的脯氨酸光学探针或融合多肽在脯氨酸实时定位中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的脯氨酸光学探针易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测脯氨酸，省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本申请所提供的脯氨酸光学探针对脯氨酸的最高响应达到对照的4倍以上，并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测，并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中脯氨酸定量检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为实施例1所述的示例性脯氨酸光学探针的sds-page图；

图2为实施例2所述的示例性的包含cpyfp和脯氨酸结合蛋白的脯氨酸光学探针对脯氨酸响应变化图；

图3为实施例3所述的示例性的包含cpgfp和脯氨酸结合蛋白的脯氨酸光学探针对脯氨酸响应变化图；

图4为实施例4所述的示例性的包含cpbfp和脯氨酸结合蛋白的脯氨酸光学探针对脯氨酸响应变化图；

图5为实施例5所述的示例性的包含cpmapple和脯氨酸结合蛋白的脯氨酸光学探针对脯氨酸响应变化图；

图6为实施例6所述的示例性的在脯氨酸结合蛋白的位点120/121，121/122，121/123，324/330，325/330或326/330融合有cpyfp的脯氨酸光学探针对不同浓度脯氨酸的滴定曲线；

图7a为实施例6所述的示例性的在脯氨酸结合蛋白的位点121/122融合有cpyfp的脯氨酸光学探针对20种氨基酸的特异性检测的柱状图；

图7b为实施例6所述的，与荧光蛋白融合到脯氨酸结合蛋白的n端或者c端所得到的融合蛋白相比，荧光蛋白位于脯氨酸结合蛋白的位点121/122的探针对脯氨酸的特异性的柱状图；

图8为实施例7所述的示例性的在脯氨酸结合蛋白的位点121/122融合有cpyfp并且在f77、a100、t102、d121、y150、d226、g227或y275位点具有突变的脯氨酸光学探针对脯氨酸响应的柱状图；

图9为实施例8所述的示例性脯氨酸光学探针的荧光光谱性质图；

图10为实施例8所述的示例性脯氨酸光学探针对不同浓度脯氨酸的滴定曲线；

图11为实施例8所述的示例性脯氨酸光学探针对20种氨基酸的特异性检测的柱状图；

图12为实施例9所述的示例性脯氨酸光学探针在哺乳动物细胞中的亚细胞器定位照片；

图13为实施例9所述的对示例性脯氨酸光学探针在哺乳动物细胞中不同亚细胞器内的脯氨酸跨膜运输进行动态监测的示意图；

图14为实施例10所述的示例性脯氨酸光学探针在活细胞水平进行高通量化合物筛选的点图；

图15为实施例11所述的示例性脯氨酸光学探针对小鼠和人血液中的脯氨酸进行定量的柱状图。

具体实施方式

在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。

本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”x的组合物可仅由x组成或可含有其它物质，例如x+y。

本文所用术语“脯氨酸敏感多肽”或“脯氨酸响应多肽”指对脯氨酸产生响应的多肽，所述响应包括与敏感多肽的相互作用相关的多肽的化学，生物学，电学或生理学参数的任何响应。响应包括小的变化，例如，多肽的氨基酸或肽片段的方向的变化以及例如多肽的一级，二级或三级结构的变化，包括例如质子化，电化学势和/或构象的变化。“构象”是分子中包含侧基的分子的一级，二级和三级结构的三维排列；当分子的三维结构发生变化时，构象发生变化。构象变化的实例包括从α-螺旋转变为β-折叠或从β-折叠转变为α-螺旋。可以理解的是，只要荧光蛋白部分的荧光被改变，可检测到的改变不需要是构象改变。本文所述脯氨酸敏感多肽还可包括其功能变体。脯氨酸敏感多肽的功能变体包括但不限于可以与脯氨酸相互作用从而发生与亲本脯氨酸敏感多肽相同或相似变化的变体。

本发明所述脯氨酸敏感多肽包括但不限于脯氨酸结合蛋白或与其有90％以上同源性的变体。本发明所述氨基酸结合蛋白可来源于农杆菌，例如agrobacteriumfabrum。本发明示例性氨基酸结合蛋白atu2422是abc转运蛋白家族，由两个结构域组成，两个结构域之间由三个柔性氨基酸肽链进行连接。脯氨酸结合蛋白可以感应脯氨酸浓度的变化，在脯氨酸浓度动态变化的过程中脯氨酸结合蛋白的空间构象也会发生改变。

本文所用术语“光学探针”是指与光学活性多肽融合的脯氨酸敏感多肽。发明人发现，脯氨酸敏感多肽例如脯氨酸结合蛋白专一性地对生理浓度的脯氨酸结合后所产生的构象变化会引起光学活性多肽(例如荧光蛋白)的构象变化，进而导致光学活性多肽的光学性质发生改变。借助不同脯氨酸浓度下测定的荧光蛋白的荧光绘制标准曲线，可以检测并分析脯氨酸的存在和/或水平。示例性atu2422蛋白如seqidno:1所示。当描述本发明光学探针时(例如描述光学活性多肽所处的位点或突变位点时)，提及的氨基酸残基编号参考seqidno:1。但是，本领域技术人员知晓其他类似的脯氨酸结合蛋白的相应残基编号。

在本发明的光学探针中，光学活性多肽(例如荧光蛋白)可操作地融合到脯氨酸敏感多肽中。基于蛋白质的“光学活性多肽”是具有发射荧光能力的多肽。荧光是光学活性多肽的一种光学性质，其可用作检测本发明的光学探针的响应性的手段。如本文所用，术语“荧光性质”是指适当激发波长下的摩尔消光系数，荧光量子效率，激发光谱或发射光谱的形状，激发波长最大值和发射波长最大值，两个不同波长激发的振幅，两个不同波长的发射振幅比，激发态寿命或荧光各向异性。活性和无活性状态之间的这些性质中的任何一个的可测量的差异足以用于本发明的荧光蛋白底物在活性测定中的效用。可测量的差异可通过确定任何定量荧光性质的量来确定，例如，特定波长处的荧光量或荧光在发射光谱上的积分。优选地，选择蛋白质底物以具有在未激活和活化的构象状态下容易区分的荧光特性。本文所述光学活性多肽还可包括其功能变体。光学活性多肽的功能变体包括但不限于可以发生与亲本光学活性多肽相同或相似荧光性质变化的变体。

“接头”或“连接区”指在本发明多肽、蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核苷酸序列。示例性地，本发明中脯氨酸敏感多肽与光学活性多肽的连接区氨基端的氨基酸数目选择的是0-3个，羧基端的氨基酸数目选择的是0-2个；当重组光学探针作为基本单元与功能蛋白连接时，可以融合在重组光学探针的氨基酸或羧基端。接头序列可为一个或多个柔性氨基酸组成的短肽链。

本文所用术语“生色团”、“荧光团”与“荧光蛋白”同义，指在激发光照射下发出荧光的蛋白质。荧光蛋白作为生物科学领域的基础检测手段，例如生物技术领域常用的绿色荧光蛋白gfp及由该蛋白突变衍生出的环状重排的蓝色荧光蛋白(cpbfp)、环状重排的绿色荧光蛋白(cpgfp)、环状重排的黄色荧光蛋白(cpyfp)等；还有本技术领域常用的红色荧光蛋白rfp，及由该蛋白衍生出来的环状重排的蛋白，如cpmapple，cpmorange，cpmkate等。示例性荧光蛋白的序列如seqidno:2-9中任一所示。

绿色荧光蛋白gfp最初是从维多利亚发光水母(aequoreavictoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kda。gfp是由12条β-折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽(ser65-tyr66-gly67)。当在氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。gfp产生荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。gfp有两个激发峰，395nm的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光。示例性cpgfp如seqidno:6所示

黄色荧光蛋白yfp衍生自绿色荧光蛋白gfp，其氨基酸序列与gfp同源性高达90％以上，yfp相比于gfp关键改变在于第203位氨基酸由苏氨酸突变为酪氨酸(t203y)。相比于原始的avgfp，yfp的主激发峰的波长红移至514nm而发射波长则改变为527nm。在此基础上对yfp第65位氨基酸进行定点突变(s65t)可获得荧光增强型黄色荧光蛋白eyfp。cpyfp是将gfp的原始n端和c端通过一段柔性的短肽链连接，在原始gfp近生色团位置制造一个新的n端和c端，将原第145～238位氨基酸部分作为新蛋白的n端，原第1～144位氨基酸作为新蛋白的c端，两片段间通过5～9个具有柔性的短肽链连接获得。在本发明中，近生色团位置优选为y144和n145位氨基酸处；所述具有柔性的短肽链优选为vdggsggtg或ggsgg。示例性cpyfp的序列如seqidno:2所示。

红色荧光蛋白rfp最初是从海洋中的珊瑚中提取的，野生的rfp是寡聚体蛋白不利于生物体的融合表达，随后在rfp的基础上进一步衍生出了不同颜色波段的红色荧光蛋白，其中最常用的是mcherry和mkate等。示例性cpmkate如seqidno:4或8所示。示例性mcherry如seqidno:5所示。

在其他实施方式中，荧光蛋白还可以为氨基酸序列如seqidno:7所示蓝色荧光蛋白cpbfp、氨基酸序列如seqidno:3所示橘黄色荧光蛋白cpmorange、氨基酸序列如seqidno:9所示苹果红荧光蛋白cpmapple中的一种或多种。

本发明所述的脯氨酸光学探针包括脯氨酸敏感多肽b，例如脯氨酸结合蛋白或其变体，和光学活性多肽a，例如荧光蛋白。光学活性多肽a插入到脯氨酸敏感多肽b中，将b分为b1和b2两个部分，形成b1-a-b2式的探针结构；脯氨酸敏感多肽b和脯氨酸相互作用导致光学活性多肽a的光学信号变强。

在本发明的光学探针中，光学活性多肽可以位于或融合到脯氨酸敏感多肽的任何位置。在一个实施方式中，光学活性多肽以n-c方向位于n-c方向的脯氨酸敏感多肽的任何位置。具体地，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的柔性区域，所述的柔性区域是指蛋白质高级结构中存在的一些特定的如环状结构域等结构，这些结构域相比于蛋白质的其他高级结构具有更高的移动性和柔性，并且该区域可以在该蛋白质和配体结合后，空间结构构象发生动态变化。本发明中所述的柔性区域主要指脯氨酸结合蛋白中的融合位点所在区域，如氨基酸残基117-123、249-259和317-330区域。示例性地，光学活性多肽位于脯氨酸结合蛋白的氨基酸序列的选自以下的位点处：117/118，117/119，117/120，117/121，118/119，118/120，118/121，119/120，119/121，120/121，120/122，120/123，121/122，121/123，122/123，249/250，249/251，249/252，249/253，249/254，249/255，249/256，249/257，249/258，249/259，250/251，250/252，250/253，250/254，250/255，250/256，250/257，250/258，250/259，251/252，251/253，251/254，251/255，251/256，251/257，251/258，251/259，252/253，252/254，252/255，252/256，252/257，252/258，252/259，253/254，253/255，253/256，253/257，253/258，253/259，254/255，254/256，254/257，254/258，254/259，255/256，255/257，255/258，255/259，256/257，256/258，256/259，257/258，257/259，258/259，323/330，324/330，325/330，326/327，326/328，326/329，326/330，327/328，327/329，327/330，328/329，328/330和329/330。在优选实施方式中，光学活性多肽位于脯氨酸结合蛋白的氨基酸序列的120/121，121/122，121/123，324/330，325/330或326/330处。如seqidno:10～15所示。

提到某多肽或蛋白时，本发明所用术语“变体”或“突变体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能、但序列不同的变体。这些变体包括但并不限于：在所述多肽或蛋白的序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸，以及在其羧基末端和/或氨基末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。不希望受理论限制，氨基酸残基发生改变而不改变多肽或蛋白质的总体构型和功能，即功能保守突变。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的多肽或蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的多肽或蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖e结合蛋白、蛋白a、如6his或flag的标签，或xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。多肽或蛋白的变体可包括：同源序列、保守性变体、等位变体、天然突变体、诱导突变体。这些变体还可包含与所述多肽或蛋白的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的多肽或蛋白。

本发明光学探针可包含具有突变的脯氨酸敏感多肽。所述突变例如选自f77，a100，t102，d121，y150，d226，g227和y275等位点的突变。示例性地，所述突变选自f77s，f77y，f77c，f77l，f77p，f77h，f77q，f77w，f77i，f77t，f77n，f77k，f77r，f77v，f77a，f77d，f77e，f77m，f77a，a100s，a100y，a100c，a100l，a100p，a100h，a100q，a100w，a100r，a100i，a100t，a100n，a100k，a100m，a100v，a100f，a100d，a100e，a100g，t102s，t102y，t102c，t102l，t102p，t102h，t102q，t102w，t102r，t102i，t102a，t102n，t102k，t102m，t102v，t102f，t102d，t102e，t102g，d121s，d121y，d121c，d121l，d121p，d121h，d121q，d121w，d121i，d121t，d121n，d121k，d121r，d121v，d121a，d121f，d121e，d121m，d121a，y150s，y150t，y150c，y150l，y150p，y150h，y150q，y150w，y150r，y150i，y150a，y150n，y150k，y150m，y150v，y150f，y150d，y150e，y150g，d226s，d226t，d226c，d226l，d226p，d226h，d226q，d226w，d226r，d226i，d226a，d226n，d226k，d226m，d226v，d226f，d226y，d226e，d226g，g227s，g227t，g227c，g227l，g227p，g227h，g227q，g227w，g227r，g227i，g227a，g227n，g227k，g227m，g227v，g227f，g227y，g227e，g227d，y275s，y275t，y275c，y275l，y275p，y275h，y275q，y275w，y275r，y275i，y275a，y275n，y275k，y275m，y275v，y275f，y275g，y275e和y275d。在一个实施方式中，所述突变选自f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n和y275f。

在示例性实施方式中，本发明b1-a-b2式光学探针可为atu2422的121/122位点融合有cpyfp并且具有选自f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n和y275f的突变时形成的探针，如seqidno:16-24所示。

本发明提供的光学探针包含氨基酸序列seqidno:10-24中任一或其变体。在一个实施方式中，本发明提供的光学探针包含与氨基酸序列seqidno:10-24中任一有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列。在优选实施方式中，本发明提供的光学探针包含与氨基酸序列seqidno:10-24中任一实质上相似或相同的序列。在更优选的实施方式中，本发明提供的光学探针包含seqidno:23或由其组成。

在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是blast和blast2.0算法，分别可参见altschul等(1977)nucleicacidsres.25:3389和altschul等(1990)j.mol.biol.215:403。

本文所用术语“功能变体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与原始多肽或蛋白(例如脯氨酸结合蛋白或荧光蛋白)相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的多肽或蛋白(例如脯氨酸结合蛋白或荧光蛋白)的功能变体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些功能变体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述类似物与原始多肽或蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变体。诱导变体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。

所述类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的脯氨酸敏感多肽并不限于上述列举的代表性蛋白、变体、衍生物和类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

本发明还提供了上述脯氨酸光学探针的制备方法，包括以下步骤：1)将编码本文所述脯氨酸光学探针的核酸序列纳入表达载体；2)将表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离脯氨酸光学探针。

本发明所用术语“核酸”或“核苷酸”可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。提到核酸时，本文所用术语“变体”可以是天然发生的等位变体或非天然发生的变体。这些核苷酸变体包括简并变体、取代变体、缺失变体和插入变体。如本领域所知的，等位变体是一个核酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如pcr)。

本发明光学探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、人工合成法或重组法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的核苷酸序列设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当核苷酸序列大于2500bp时，优选的进行2～6次pcr扩增，然后将各次扩增的片段按正确次序拼接在一起。本发明对所述的pcr扩增的程序和体系没有特殊限定，采用本领域常规的pcr扩增程序和体系即可。还可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离和纯化得到有关多肽或蛋白。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。在本发明中，在光学探针的核苷酸序列小于2500bp时，可采用人工合成方法来合成。所述人工合成方法为本领域常规的dna的人工合成方法，无其他特殊要求。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其功能变体、衍生物或类似物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。可通过突变pcr或化学合成等方法将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明在获得编码光学探针的核苷酸序列后，将编码所述光学探针的核苷酸序列纳入表达载体，得到重组表达载体。本文所用的术语“表达载体”和“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的原核或真核载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定表达，这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件，可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件，包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等，表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在本发明中适用的重组载体包括但不限于细菌质粒。在重组表达载体中，“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltr和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。在一个实施方式中，表达载体可采用市售的prsetb载体，无其他特殊要求。示例性地，采用bamhi和ecori分别对编码所述光学探针的核苷酸序列和表达载体进行双酶切，然后将二者的酶切产物连接得到重组表达载体。本发明对酶切和连接的具体步骤和参数没有特殊限定，采用本领域常规的步骤和参数即可。

在获得重组表达载体后，将该载体转化到宿主细胞中，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。本发明所述的宿主细胞是指能够接收和容纳重组dna分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。具体的可为大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇s2或sf9的昆虫细胞，cho、cos、hek293、hela细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用。在本发明实施例中所用的示例性宿主细胞为大肠杆菌jm109-de3菌株。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明所述的转移到宿主细胞的方法为本领域常规的方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，所述方法优选的为cacl2法或mgcl2法处理，所用的步骤为本领域公知。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明在将表达载体转入宿主细胞后，对转入表达载体的宿主细胞进行扩增表达培养，分离得到脯氨酸光学探针。所述宿主细胞扩增表达培养采用常规的方法即可。根据所用的宿主细胞种类，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。

在本发明中，光学探针在细胞内、细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。本发明对分离所述脯氨酸荧光蛋白的方法没有特殊限定，采用本领域常规的融合蛋白的分离方法即可。这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但并不限于：常规的复性处理、盐析方法、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在一个实施方式中，利用his标签的亲和层析法进行光学探针的分离。

本发明还提供了所述脯氨酸光学探针在脯氨酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用。在一个方面，所述的脯氨酸光学探针优选与细胞不同部位的信号肽连接，转入到细胞中，通过检测细胞中荧光信号的强弱，进行脯氨酸的实时定位；通过脯氨酸标准滴加曲线进行相应脯氨酸的定量检测。本发明所述的脯氨酸标准滴加曲线是根据脯氨酸光学探针在不同浓度脯氨酸的情况下的荧光信号绘制而成。本发明所述脯氨酸光学探针直接转入细胞中，在脯氨酸实时定位和定量检测过程中，不需要耗时的样品处理过程，更加准确。本发明脯氨酸光学探针在进行高通量化合物筛选时，将不同的化合物添加到细胞培养液中，测定脯氨酸含量的变化，从而筛选出对脯氨酸含量变化有影响的化合物。在本发明中所述的脯氨酸光学探针在脯氨酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用，均是非诊断和治疗目的，不涉及疾病的诊断和治疗。

在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。

实施例

下面结合实施例对本发明提供的脯氨酸光学探针进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

i.实验材料和试剂

实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版)，章静波，徐存拴等译；j.s.博尼费斯农，m.达索等的《精编细胞生物学实验指南》，章静波等译。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例中所用的基于prsetb-cpyfp，prsetb-脯氨酸结合蛋白质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建，prsetb质粒载体购自invitrogen公司。所有用于pcr的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的taqdna聚合酶购自东盛生物，pfudna聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primestardna聚合酶购自takara公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dntp。bamhi、bglii、hindiii、ndei、xhoi、ecori、spei等限制性内切酶、t4连接酶、t4磷酸化酶(t4pnk)购自fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。转染试剂lip2000kit购于invitrogen公司。脯氨酸等氨基酸均购自sigma公司。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自sigma-aldrich公司。hepes盐，氨苄青霉素(amp)和嘌呤霉素购自ameresco公司。96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自grenier公司。

实施例中所用的dna纯化试剂盒购自bbi公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株mach1购自invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自gehealthcare公司。

实施例中用到的主要仪器包括：bioteksynergy2多功能酶标仪(美国bio-tek公司)，x-15r高速冷冻离心机(美国beckman公司)，microfuge22r台式高速冷冻离心机(美国beckman公司)，pcr扩增仪(德国biometra公司)，超声破碎仪(宁波新芝公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，荧光分光光度计(美国varian公司)，co2恒温细胞培养箱(sanyo)，倒置荧光显微镜(日本尼康公司)。

ii.分子生物学方法和细胞实验方法

ii.1聚合酶链式反应(pcr)：

1.目的片段扩增pcr：

该方法主要用于基因片段扩增和菌落pcr鉴定阳性克隆。所述pcr扩增的反应体系如表1所示，扩增程序如表2所示。

表1.pcr扩增反应体系

表2.pcr扩增程序

2.长片段(>2500bp)扩增pcr：

本发明中使用的长片段扩增，主要是反向pcr扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向pcr引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。长片段扩增pcr反应体系如表3所示，扩增程序如表4或表5所示。

表3.长片段(>2500bp)扩增pcr反应体系

表4.长片段(>2500bp)扩增pcr扩增程序

表5.长片段(>2500bp)扩增pcr扩增程序

ii.2核酸内切酶酶切反应：

对质粒载体进行双酶切的体系如表6所示，其中n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μl量。

表6.质粒载体双酶切体系

ii.3dna片段5’端磷酸化反应

从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而pcr产物没有，故需对pcr产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团dna分子才能发生连接反应。磷酸化反应体系如表7所示，其中t4pnk为t4多聚核苷酸激酶的简写，用于对dna分子的5’端磷酸基团的加成反应。

表7.磷酸化反应体系

ii.4目的片段和载体的连接反应

不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了三种连接方法

1.平末端短片段和线性化载体的平末端连接

该方法的原理是pcr获得的平末端产物在t4pnk作用下对dna片段的5’末端进行磷酸化反应后，与线性化的载体在peg4000和t4dna连接酶的作用下连接获得重组质粒。同源重组连接体系如表8所示。

表8.平末端片段连接反应体系

2.含有粘性末端的dna片段和含有粘性末端载体片段的连接

通过限制性内切酶切割的dna片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。连接反应体系如表9所示，其中pcr产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1-6:1之间。。

表9.粘性末端连接反应体系

3.反向pcr引入定点突变后5’端磷酸化的dna片段产物自身环化的连接反应

将5’端磷酸化的dna片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。自身环化连接反应体系如表10所示。

表10.自身环化连接反应体系

ii.5感受态细胞的制备与转化

感受态细胞的制备：

1.挑取单菌落(如mach1)接种于5mllb培养基中，37℃摇床过夜。

2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mllb培养基中，37℃，220rpm培养3至5小时，直到od600达到0.5。

3.冰浴预冷细胞2小时。

4.4℃，4000rpm离心10分钟。

5.弃上清，用5ml预冷的缓冲液重悬细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50ml。

6.冰浴45分钟。

7.4℃4000rpm离心10分钟，用5ml冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。

8.每个ep管中放100μl菌液，-80℃或液氮冻存。

重悬缓冲液:cacl2(100mm)、mgcl2(70mm)、naac(40mm)

储存缓冲液:0.5mldmso、1.9ml80％甘油、1ml10×cacl2(1m)、1ml10×mgcl2(700mm)、1ml10×naac(400mm)、4.6mlddh2o

感受态细胞的转化：

1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。

3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5分钟。

4.加入500μllb，于37℃恒温摇床上200rpm培养1小时。

5.将菌液4000rpm离心3分钟，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。

ii.6蛋白质的表达，纯化和荧光检测

1.将表达载体(例如以prsetb为基础的脯氨酸光学探针表达载体)转化到jm109(de3)细胞中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250ml锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至od＝0.4-0.8，加入1/1000(v/v)的iptg(1m)，18℃诱导表达24-36小时。

2.诱导表达完成后，4000rpm，30分钟离心收菌，加入50mm的磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎至菌体澄清。9600rpm，4℃离心20分钟。

3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白，镍柱亲和层析后的蛋白再通过自装的脱盐柱获得溶解在20mmmops缓冲液(ph7.4)或者磷酸盐缓冲液pbs中的蛋白。

4.纯化的蛋白经过sds-page鉴定后，使用测定缓冲液(100mmhepes，100mmnacl，ph7.3)或者磷酸盐缓冲液pbs稀释探针成终浓度为5-10μm的蛋白溶液。用测定缓冲液(20mmmops，ph7.4)或者磷酸盐缓冲液pbs将脯氨酸配制成终浓度为1m的储液。

5.取100μl5μm的蛋白溶液，37℃温育5分钟，分别加入脯氨酸混匀后至终浓度为100mm，利用多功能荧光酶标仪测定蛋白在340nm下的光吸收。

6.取100μl1μm的蛋白溶液，37℃温育5分钟，加入脯氨酸滴定，测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。

7.取100μl1μm的蛋白溶液，37℃温育5分钟，加入脯氨酸，测定蛋白的吸收光谱和荧光光谱。对样品的吸收光谱和荧光光谱的测定通过分光光度计和荧光分光光度计完成。

ii.7哺乳动物细胞的转染和荧光检测

1.将pcdna3.1+为基础的脯氨酸光学探针质粒通过转染试剂lipofectamine2000(invitrogen)转染到hela中，置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。待外源基因充分表达24～36h后进行荧光检测。

2.诱导表达完成后，将贴壁的hela细胞，用pbs冲洗三次，置于hbss溶液中分别进行荧光显微镜和酶标仪检测。

实施例1：脯氨酸结合蛋白质粒

通过pcr扩增土壤农杆菌基因中的脯氨酸结合蛋白(此处atu2422)基因，pcr产物凝胶电泳后回收后用bamhi和ecori酶切，同时对prsetb载体进行相应的双酶切。用t4dna连接酶连接后，用产物转化machi，转化的machi涂布于lb平板(氨苄青霉素100ug/ml)，置于37℃培养过夜。将生长machi转化子进行质粒抽提后，进行pcr鉴定。阳性质粒经过测序正确后进行后续的质粒构建。

实施例2：不同融合位点的cpyfp光学探针的表达和检测

本实施例中，以prsetb-atu2422为基础选择下述位点融合cpyfp，得到相应prsetb-atu2422-cpyfp质粒：117/118，117/119，117/120，117/121，118/119，118/120，118/121，119/120，119/121，120/121，120/122，120/123，121/122，121/123，122/123，249/250，249/251，249/252，249/253，249/254，249/255，249/256，249/257，249/258，249/259，250/251，250/252，250/253，250/254，250/255，250/256，250/257，250/258，250/259，251/252，251/253，251/254，251/255，251/256，251/257，251/258，251/259，252/253，252/254，252/255，252/256，252/257，252/258，252/259，253/254，253/255，253/256，253/257，253/258，253/259，254/255，254/256，254/257，254/258，254/259，255/256，255/257，255/258，255/259，256/257，256/258，256/259，257/258，257/259，258/259，323/330，324/330，325/330，326/327，326/328，326/329，326/330，327/328，327/329，327/330，328/329，328/330或329/330。

利用pcr产生cpyfp的dna片段，对该dna片段使用5’末端的加磷操作后灭活，同时通过反向pcr扩增产生含有不同断裂位点的prsetb-脯氨酸结合蛋白线性化载体，将线性化的prsetb-atu2422和5’末端磷酸化的cpyfp片段在peg4000和t4dna连接酶的作用下连接产生重组质粒，将这些平板在kodak多功能活体成像系统，挑取在fitc通道激发下有黄色荧光的克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。

经过测序正确后，将重组质粒转化到jm109(de3)中诱导表达，并纯化蛋白质，通过sds-page电泳大小在68kda附近。该大小符合prsetb-atu2422-cpyfp表达出的含his-tag纯化标签的atu2422-cpyfp融合蛋白质的大小。结果如图1所示。

将纯化的atu2422-cpyfp融合蛋白质进行脯氨酸响应筛选，将含有100mm脯氨酸的融合荧光蛋白质的检测信号除以无脯氨酸的融合荧光蛋白质的检测信号。结果如图2所示，检测结果显示对脯氨酸响应超过2倍的光学探针有在120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330位点(如seqidno10-15所示)或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施融合的光学探针。

实施例3：不同融合位点的cpgfp光学探针的表达和检测

按照实施例2中的方法将cpyfp替换为cpgfp，构建脯氨酸绿色荧光蛋白荧光探针。如图3所示，检测结果显示对脯氨酸响应超过2倍的光学探针有在120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施融合的光学探针。

实施例4：不同融合位点的cpbfp光学探针的表达和检测

按照实施例2中的方法将cpyfp替换为cpbfp，构建脯氨酸蓝色荧光蛋白荧光探针。如图4所示，检测结果显示对脯氨酸响应超过2倍的光学探针有在120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施融合的光学探针。

实施例5：不同融合位点的cpmapple光学探针的表达和检测

按照实施例2中的方法将cpyfp替换为cpmapple，构建脯氨酸红色荧光蛋白荧光探针。如图5所示，检测结果显示对脯氨酸响应超过2倍的光学探针有在120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施融合的光学探针。

实施例6：光学探针的性能

对于实施例2中所得的对脯氨酸响应超过2倍的光学探针，即在120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330位点实施融合的6种光学探针，进行进浓度梯度的脯氨酸检测，检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化。融合位点为120/121，121/122，121/123，324/330，325/330和326/330的6种脯氨酸光学探针的kd(结合常数)分别为18.6mm、0.2mm、15.5mm、0.95mm、0.38mm和0.65mm，变化幅度分别为3.0倍、4.5倍、2.0倍、2.9倍、2.6倍和2.0倍，结果如图6所示。

对于融合位点为121/122的探针(atu2422-121/122-cpyfp)，进行其对各氨基酸的特异性检测。同时，以荧光蛋白cpyfp、cpgfp、cpbfp或者cpmapple融合到atu2422的n端或者c端所得到的融合蛋白作为对照，比较融合位点为121/122的探针对脯氨酸的特异性。

结果表明融合位点为121/122的探针对丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸都具有较高的响应，分别为4.3倍、4.5倍、4.0倍、3.2倍、2.4倍和3.0倍，如图7a所示。同时，荧光蛋白融合到atu2422的n端或者c端得到的融合蛋白对脯氨酸没有响应，而融合位点为121/122的探针对脯氨酸有约4.5倍的响应，如图7b所示。

实施例7：突变的cpyfp光学探针的表达和检测

在atu2422-121/122-cpyfp的基础上构建光学探针突变体。通过反向pcr线性化质粒prsetb-atu2422-121/122-cpyfp，引物中含有所要突变位点的碱基序列，对得到的pcr产物在pnk、t4dna连接酶和peg4000的作用下加磷连接，得到f77，a100，t102，d121，y150，d226，g227，y275这8个位点的定点饱和突变质粒，并由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。

结果如图8所示。荧光检测结果显示对脯氨酸响应超过2倍的有f77l，a100g，d121e，d121s，d121t，d121v，d226e，d226n和y275f突变体。

实施例8.光学探针突变体的性能

示例性地，将纯化的脯氨酸光学探针atu2422-121/122-cpyfp-d226n分别进行0mm和500mm脯氨酸处理10分钟后，使用荧光分光光度计进行荧光谱的检测。

对激发光谱的测定：以350nm至510nm的激发范围和530nm的发射波长记录激发光谱，每1nm读取一次。结果显示，探针在约420和490nm处有两个激发峰，如图9a所示。

对发射光谱的测定：固定激发波长分别为420nm和490nm，记录505-600nm的发射光谱，每1nm读取一次。结果显示，探针在添加500mm脯氨酸后，在420nm激发下荧光强度降低为添加0mm脯氨酸的1.2倍；在490nm激发下荧光强度降低为添加0mm脯氨酸的0.23倍。如图9b和9c所示。

对纯化的atu2422-121/122-cpyfp-d226n进行浓度梯度(0～100mm)的脯氨酸检测。对纯化的探针处理10分钟后，检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化。结果如图10所示，脯氨酸光学探针的kd(结合常数)为2.8mm，变化幅度为5倍。

将atu2422-121/122-cpyfp-d226n与20种氨基酸进行反应性检测，结果表明其具有很好的特异性，如图11所示。

实施例9：光学探针的亚细胞器定位和光学探针在亚细胞器内的性能

本实施例中，使用不同的定位信号肽与光学探针atu2422-121/122-cpyfp-d226n融合，将光学探针定位到不同的细胞器中。

用融合不同定位信号肽的光学探针质粒转染hela细胞36小时后，使用pbs冲洗，置于hbss溶液中使用倒置荧光显微镜进行fitc通道下进行荧光检测。结果如图12所示。脯氨酸光学探针通过与不同的特异定位信号肽融合能够定位到包括细胞浆、线粒体、细胞核、高尔基体、过氧化物酶体和溶酶体等亚细胞器中。不同的亚细胞结构中都显示有荧光，并且荧光的分布和强度各不相同。

用胞浆表达的光学探针质粒转染hela细胞36小时后，使用pbs冲洗，置于hbss溶液中检测40min时间段内420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化。结果如图13所示。添加10mm脯氨酸，继续检测20分钟。添加脯氨酸的样品的485/420逐渐增加，最高可以达到2.3倍，而不添加脯氨酸的对照组的485/420为1保持不变。

实施例10：在活细胞中基于光学探针进行高通量化合物筛选

本实施例中，我们使用胞浆表达atu2422-121/122-cpyfp-d226n的hela细胞进行高通量化合物筛选。

经转染的hela细胞使用pbs冲洗，置于hbss溶液中(无脯氨酸)处理1小时，然后使用10μm的化合物处理1小时。各样品中分别滴加脯氨酸。使用酶标仪记录420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值变化。以未用任何化合物处理的样品作为对照进行标准化。结果如图14所示。在使用的2000种化合物中，绝大部分的化合物对脯氨酸进入细胞影响极小。有14种化合物能够提高细胞对脯氨酸的摄取能力，另外有10种化合物能够明显降低细胞对脯氨酸的摄取。

实施例11:光学探针定量检测血液中的脯氨酸

在本实施中，使用纯化的atu2422-121/122-cpyfp-d226n对小鼠和人的血液上清中的脯氨酸进行分析。

将atu2422-121/122-cpyfp-d226n与稀释的血液上清混合处理10分钟后，使用酶标仪检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值。结果如图15所示，小鼠血液中的脯氨酸含量在140μm左右，人血液中的脯氨酸含量在160μm左右。

由以上实施例可知，本发明提供的脯氨酸光学探针，蛋白分子量相对较小且易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、定量检测脯氨酸；并且能够进行高通量的化合物筛选。

其它实施方式

本说明书描述了许多实施方式。然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书获知的不背离本发明的构思和范围的各种改进，也应包括在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110>华东理工大学

<120>脯氨酸光学探针及其制备方法和应用

<130>1913031cncn

<160>26

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>350

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metaspvalvalilealavalglyalaproleuthrglyproasnala

151015

alapheglyalaglnileglnlysglyalagluglnalaalalysasp

202530

ileasnalaalaglyglyileasnglygluglnilelysilevalleu

354045

glyaspaspvalseraspprolysglnglyileservalalaasnlys

505560

phevalalaaspglyvallysphevalvalglyhispheasnsergly

65707580

valserileproalasergluvaltyralagluasnglyileleuglu

859095

ilethrproalaalathrasnprovalphethrgluargglyleutrp

100105110

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115120125

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130135140

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275280285

alaalalysalaalaglyservalgluproglulysvalalagluala

290295300

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325330335

lysglyproaspglylysphethrtyrileglnglnglyser

340345350

<210>2

<211>246

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

tyrasnseraspasnvaltyrilemetalaasplysglnlysasngly

151015

ilelysalaasnphelysilearghisasnvalgluaspglyserval

202530

glnleualaasphistyrglnglnasnthrproileglyaspglypro

354045

valleuleuproaspasnhistyrleuserpheglnservalleuser

505560

lysaspproasnglulysargasphismetvalleuleuglupheval

65707580

thralaalaglyilethrleuglymetaspgluleutyrasnvalasp

859095

glyglyserglyglythrglyserlysglyglugluleuphethrgly

100105110

valvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislys

115120125

pheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylysleu

130135140

thrleulysleuilecysthrthrglylysleuprovalprotrppro

145150155160

thrleuvalthrthrleuglytyrglyleulyscysphealaargtyr

165170175

proasphismetlysglnhisaspphephelysseralametproglu

180185190

glytyrvalglngluargthrilephephelysaspaspglyasntyr

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lysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasnarg

210215220

ilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleugly

225230235240

hislysleuglutyrasn

245

<210>3

<211>242

<212>prt

<213>人工序列

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valsergluargmettyrprogluaspglyvalleulyssergluile

151015

lyslysglyleuargleulysaspglyglyhistyralaalagluval

202530

lysthrthrtyrlysalalyslysprovalglnleuproglyalatyr

354045

ilevalaspilelysleuaspilevalserhisasngluasptyrthr

505560

ilevalgluglncysgluargalagluglyarghisprothrglygly

65707580

argaspgluleutyrlysglyglythrglyglyserleuvalserlys

859095

glyglugluaspasnmetalaileilelysgluphemetargphelys

100105110

valhismetgluglyservalasnglyhisgluphegluileglugly

115120125

gluglygluglyargprotyrglualapheglnthralalysleulys

130135140

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glnphethrtyrglyserlysalatyrilelyshisproalaaspile

165170175

proasptyrphelysleuserpheprogluglypheargtrpgluarg

180185190

valmetasnphegluaspglyglyileilehisvalasnglnaspser

195200205

serleuglnaspglyvalpheiletyrlysvallysleuargglythr

210215220

asnpheproproaspglyprovalmetglnlyslysthrmetglytrp

225230235240

gluala

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<211>250

<212>prt

<213>人工序列

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151015

valtyrtyrvalaspargargleugluargilelysglualaasplys

202530

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leuproserlysleuglyhislysleuasnglyglythrglyglyser

505560

metvalserlysglyglugluleuilelysgluasnmethismetlys

65707580

leutyrmetgluglythrvalasnasnhishisphelyscysthrser

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gluglygluglylysprotyrgluglythrglnthrmetargilelys

100105110

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115120125

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130135140

proaspphephelysglnserpheprogluglyphethrtrpgluarg

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valthrthrtyrgluaspglyglyvalleuthralathrglnaspthr

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serleuglnaspglycysleuiletyrasnvallysileargglyval

180185190

asnpheproserasnglyprovalmetglnlyslysthrleuglytrp

195200205

glualaserthrglumetleutyrproalaaspglyglyleuglugly

210215220

argseraspmetalaleulysleuvalglyglyglyhisleuilecys

225230235240

asnleulysthrthrtyrargserlyslys

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<210>5

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<212>prt

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metvalserlysglyglugluaspasnmetalaileilelysgluphe

151015

metargphelysvalhismetgluglyservalasnglyhisgluphe

202530

gluilegluglygluglygluglyargprotyrgluglythrglnthr

354045

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505560

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65707580

proalaaspileproasptyrleulysleuserpheprogluglyphe

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lystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyvalvalthrval

100105110

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115120125

leuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlyslys

130135140

thrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluaspgly

145150155160

alaleulysglygluilelysglnargleulysleulysaspglygly

165170175

histyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalyslysproval

180185190

glnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuaspilethrser

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hisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglugly

210215220

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<212>prt

<213>人工序列

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asnvaltyrilelysalaasplysglnlysasnglyilelysalaasn

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phelysilearghisasnilegluaspglyglyvalglnleualatyr

202530

histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro

354045

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505560

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65707580

ilethrleuglymetaspgluleutyrlysglyglythrglyglyser

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metvalserlysglyglugluleuphethrglyvalvalproilegln

100105110

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115120125

gluglygluglyaspalathrtyrglylysleuthrleulyspheile

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cysthrthrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthr

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leuthrtyrglyvalglncyspheserargtyrproasphismetlys

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glnhisaspphephelysseralametprogluglytyrileglnglu

180185190

argthrilephephelysaspaspglyasntyrlysthrargalaglu

195200205

vallysphegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysgly

210215220

ileaspphelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyr

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asn

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asnvaltyrilelysalaasplysglnlysasnglyilelysalaasn

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354045

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505560

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65707580

ilethrleuglymetaspgluleutyrlysglyglythrglyglyser

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glusermetvalserlysglyglugluleuphethrglyvalvalpro

100105110

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130135140

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165170175

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180185190

glngluargthrilephephelysaspaspglyasntyrlysthrarg

195200205

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glutyrasn

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<212>prt

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505560

glyserlysthrpheileasnhisthrglnglyileproaspphephe

65707580

lysglnserpheprogluglyphethrtrpgluargvalthrthrtyr

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100105110

glycysleuiletyrasnvallysileargglyvalasnpheproser

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asnglyprovalmetglnlyslysthrleuglytrpglualaserthr

130135140

glumetleutyrproalaaspglyglyleugluglyargalaaspmet

145150155160

alaleulysleuvalglyglyglyhisleuilecysasnleulysthr

165170175

thrtyrargserlyslysproalalysasnleulysmetproglyval

180185190

tyrtyrvalaspargargleugluargilelysglualaasplysglu

195200205

thrtyrvalgluglnhisgluvalalavalalaargtyrcysaspleu

210215220

proserlysleuglyhislysleuasn

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<211>242

<212>prt

<213>人工序列

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valsergluargmettyrprogluaspglyalaleulyssergluile

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202530

lysthrthrtyrlysalalyslysprovalglnleuproglyalatyr

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65707580

metaspgluleutyrlysglyglythrglyglyserleuvalserlys

859095

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valhismetgluglyservalasnglyhisgluphegluileglugly

115120125

gluglygluglyargprotyrglualapheglnthralalysleulys

130135140

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glnphemettyrglyserlysalatyrilelyshisproalaaspile

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proasptyrphelysleuserpheprogluglypheargtrpgluarg

180185190

valmetasnphegluaspglyglyileilehisvalasnglnaspser

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asnpheproproaspglyprovalmetglnlyslysthrmetglytrp

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gluala

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<212>prt

<213>人工序列

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151015

alapheglyalaglnileglnlysglyalagluglnalaalalysasp

202530

ileasnalaalaglyglyileasnglygluglnilelysilevalleu

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glyaspaspvalseraspprolysglnglyileservalalaasnlys

505560

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65707580

valserileproalasergluvaltyralagluasnglyileleuglu

859095

ilethrproalaalathrasnprovalphethrgluargglyleutrp

100105110

asnthrpheargthrcysglyargtyrasnseraspasnvaltyrile

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130135140

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leuserpheglnservalleuserlysaspproasnglulysargasp

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hismetvalleuleugluphevalthralaalaglyilethrleugly

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metaspgluleutyrasnvalaspglyglyserglyglythrglyser

210215220

lysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleu

225230235240

aspglyaspvalasnglyhislyspheservalserglygluglyglu

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phephelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallysphe

325330335

gluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphe

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lysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasnaspasp

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alalysvalalaileilehisasplysthrprotyrglyglnglyleu

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alaaspgluthrlyslysalaalaasnalaalaglyvalthrgluval

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530535540

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glnglnglyser

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serlysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalglu

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alalysvalalaileilehisasplysthrprotyrglyglnglyleu

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ilephephelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallys

325330335

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340345350

phelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasngln

355360365

glnglyglyilealaglylystyrleualaasphisphelysaspala

370375380

lysvalalaileilehisasplysthrprotyrglyglnglyleuala

385390395400

aspgluthrlyslysalaalaasnalaalaglyvalthrgluvalmet

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lysmetlysglualaglyvalserileiletyrtrpglyglyleuhis

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450455460

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glnglyser

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