本发明涉及一种制备pca3定量检测标准品的方法。
背景技术：
在我国现阶段，前列腺癌筛查主要内容如下：推荐对于50岁以上，或者是有前列腺癌家族史的45岁以上男性，在充分告知筛查风险的前提下，进行以psa(psa检测)检测为基础的前列腺癌筛查，以期早期发现降低死亡率。psa作为临床上广泛使用的前列腺癌标志物，虽然能够有效诊断部分前列腺癌患者，但良性前列腺增生、前列腺炎以及前列腺按摩、经直肠超声检查等均会导致psa水平异常升高，且有许多研究表明，当psa处于灰区即4～10ng/ml时，诊断率仅为25％。所以psa的肿瘤特异性不高，学者们一直在寻找新的前列腺癌特异性肿瘤标志物。
其中长链非编码rna前列腺癌抗原3(prostatecancerantigen3，pca3)：pca3是一种在前列腺癌中表达的因子。已被美国fda批准作为诊断前列腺癌的标志物。pca3作为前列腺癌特异性基因，主要表达于前列腺癌细胞中，而在正常组织、良性前列腺增生或其他组织肿瘤中则无表达或者极少表达。在psa升高的患者中，使用尿液中pca3作为诊断标志物比使用psa、血清游离psa等更能提高前列腺癌的诊断准确率。eau指南也推荐在初始前列腺穿刺阴性，但仍怀疑前列腺癌的患者中进行pca3检测。而传统的前列腺穿刺活检虽然灵敏度较高，但特异性较低，易出现不必要的阴性穿刺，故需要寻找一种能够有效诊断前列腺癌的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种制备pca3定量检测标准品的方法，该方法制备的pca3定量检测标准品可用于阳性质控品，也可用于绝对定量测定尿液中pca3含量。
实现本发明目的的技术方案是：一种制备pca3定量检测标准品的方法，包括以下步骤：
步骤一：对pca3dna进行合成；
步骤二：pcr扩增；
步骤三：pcr产物纯化；
步骤四：体外转录得到rna；
步骤五：转录产物纯化；
步骤六：rna标准品定量。
所述步骤二中25ul反应体系为：
所述步骤二具体包括以下步骤：
s1，将pcr反应所需的成分配置完成后，在pcr仪上于95℃预加热5min，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环；
s2，扩增循环：在每一个循环中，先于95℃保持10s使模板变性，然后将温度降到55℃保持10s，使引物与模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成dna,完成一个循环，重复此循环共进行35次，使扩增的dna片段大量累积；
s3，在72℃保持10min，使产物延伸完整，然后12℃环境下保存。
所述步骤三的具体步骤为：收集→上柱→洗涤→洗脱。
所述步骤四具体为：将t7酶混合液的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用；然后配制反应体系，用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，在pcr仪器中37℃孵育2小时。
所述步骤四配制的反应体系为：
所述步骤五具体为：首先室温解冻，然后加异丙醇沉淀rna，然后加无水乙醇清洗3次，再干燥5-10分钟，最后加无菌水溶解。
所述步骤六具体为：通过nanodrop微量分光光度计测定rna浓度，分装保存在-80℃冰箱备用；然后对该标准品进行10倍梯度稀释，运用实时荧光定量pcr方法，做出标准曲线。
采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：通过本发明制备的pca3定量检测标准品，可作为阳性质控品，也可以做标准曲线，用实时荧光定量方法对待测品进行基因拷贝数定量，并且灵敏度和特异性均较高。
具体实施方式
(实施例1)
本实施例的制备pca3定量检测标准品的方法，包括以下步骤：
步骤一：对pca3dna进行合成，合成的序列编码为pca3-1；
步骤二：pcr扩增；定义上下游引物编码分别为pca3-f和pca3-r，其25ul反应体系为：
pcr扩增程序具体包括以下步骤：
s1，将pcr反应所需的成分配置完成后，在pcr仪上于95℃预加热5min，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环；
s2，扩增循环：在每一个循环中，先于95℃保持10s使模板变性，然后将温度降到55℃保持10s，使引物与模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成dna,完成一个循环，重复此循环共进行35次，使扩增的dna片段大量累积；
s3，在72℃保持10min，使产物延伸完整，然后12℃环境下保存。
步骤三：pcr产物纯化，具体步骤为：收集→上柱→洗涤→洗脱。
步骤四：体外转录得到rna，具体为：将t7酶混合液的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用；然后配制反应体系，用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，在pcr仪器中37℃孵育2小时。前述反应体系为：
步骤五：转录产物纯化；具体为：首先室温解冻，然后加异丙醇沉淀rna，然后加无水乙醇清洗3次，再干燥5-10分钟，最后加无菌水溶解。
步骤六：rna标准品定量；具体为：通过nanodrop微量分光光度计测定rna浓度，分装保存在-80℃冰箱备用；然后对该标准品进行10倍梯度稀释，运用实时荧光定量pcr方法，做出标准曲线。
通过本实施例的制备pca3定量检测标准品的方法制备的pca3定量检测标准品，可作为阳性质控品，也可以做标准曲线，用实时荧光定量方法对待测品进行基因拷贝数定量，并且灵敏度和特异性均较高。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。