一种维拉卡肽的制备方法与流程

本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种维拉卡肽的制备方法。

背景技术：

继发性甲状旁腺功能亢进(shpt，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肠吸收不良综合征、fanconi综合征和肾小管酸中毒、维生素d缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的甲状旁腺激素(pth)，以提高血钙、血镁和降低血磷的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。

维拉卡肽是由kaipharmaceuticals,inc.开发的一种新颖的拟钙剂(calcimimeticagent)，能够抑制甲状旁腺激素的分泌。维拉卡肽可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素水平的降低。

维拉卡肽有3个d构型的精氨酸、2个d构型的丙氨酸、1个d构型的精氨酰胺、1个l构型半胱氨酸与1个d构型半胱氨酸(n段被乙酰基封闭)构成，其中d构型半胱氨酸与l构型半胱氨酸以二硫键连接在一起(n-acetyl-d-cysteinyl-d-alanyl-d-arginyl-d-arginyl-d-arginyl-d-alanyl-d-argininamide,disulfidewithl-cysteine)，其结构式i所示：

该化合物合成的关键在于二硫键的构建，常规的肽合成中使用的构建二硫键的方法包括空气氧化法，碘/醋酸体系氧化法，双氧水氧化法等，这类方法仅适合于环肽的二硫键的构建，但是维拉卡肽需要进行分子间巯基的氧化反应，若按照常规的二硫键构建方法进行反应，将无法得到理想收率和纯度的最终产物。

同时，精氨酸(arg)属于困难氨基酸，非常容易产生[-d-arg]的缺失肽，而维拉卡肽序列在中含有3个连续的d-arg残基，极易产生缺失肽杂质[-1-d-arg]-维拉卡肽、[-2-d-arg]-维拉卡肽和[-3-d-arg]-维拉卡肽。这些杂质与目标肽的极性相近，不易分离，增加产品分离纯化的难度。

因此，在维拉卡肽的制备过程中需要解决二硫键的构建困难和易产生缺失肽的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供一种维拉卡肽的制备方法。本发明提供的维拉卡肽的制备方法能够解决二硫键的构建困难和易产生缺失肽的问题，适于工业化大批量的生产，且所得维拉卡肽的产率高，纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种维拉卡肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)在缩合体系作用下，以fmoc保护的氨基树脂为载体，将全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段进行缩合，得到具有式(a)所示结构的维拉卡肽-氨基主链肽树脂；所述缩合按照维拉卡肽主链肽从c端至n端的顺序进行；

所述全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段的缩合顺序为：fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(mmt)-oh；

(2)将所述维拉卡肽-氨基主链肽树脂和去mmt保护溶液混合，进行脱mmt保护反应，得到具有式(b)所示结构的脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂；

(3)将所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基活化后与boc-l-cys-oh混合，进行偶联反应，得到具有式(c)所示结构的全保护维拉卡肽-氨基树脂；

(4)将所述全保护维拉卡肽-氨基树脂和裂解试剂混合进行裂解反应，得到维拉卡肽。

优选的，所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段由以下方法制备得到：

(i)将fmoc-d-arg(pbf)-oh和hosu在dcc的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-osu；

(ii)将所述fmoc-d-arg(pbf)-osu和h-d-arg(pbf)-oh在碱催化剂的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh；

(iii)将所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh和hosu在dcc的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu；

(iv)将所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu和h-d-arg(pbf)-oh在碱催化剂的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。

优选的，所述步骤(ii)和步骤(iv)中的碱催化剂为na2co3。

优选的，所述步骤(1)具体为：

i)将fmoc氨基树脂溶胀后，在去fmoc保护溶液作用下进行脱fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂；

ii)将所述全保护氨基酸、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段与缩合体系混合，进行活化反应，得到活化的氨基酸和三肽片段；

iii)将所述活化的氨基酸和三肽片段与所述脱保护的氨基树脂混合，进行缩合反应，得到维拉卡肽-氨基主链肽树脂；

所述步骤i)和步骤ii)没有时间顺序的限制。

优选的，所述缩合体系包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂为dic/hobt、pybop/hobt/diea或hatu/hobt/diea；所述反应溶剂为dmf、dcm、nmp和dmso中的一种或几种；

所述全保护氨基酸、缩合剂与fmoc氨基树脂的摩尔比为2～5:2～5:1。

优选的，所述氨基树脂为rinkamide树脂、rinkamidembha树脂和rinkamideam树脂中的一种或几种；所述氨基树脂的取代度为0.2～1.0mmol/g。

优选的，所述步骤i)中溶胀用溶胀剂为dcm或dmf；所述去fmoc保护溶液为哌啶和dmf的混合液。

优选的，所述步骤(2)中的去mmt保护溶液为tfa的dcm溶液，所述去mmt保护溶液中tfa的体积含量为1～3％。

优选的，所述步骤(3)中脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基的活化方法为：

将所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂与活化剂混合，进行活化反应，得到cys侧链巯基活化的维拉卡肽-氨基主链肽树脂；所述活化剂为2,2'-二硫二吡啶。

优选的，所述步骤(4)中的裂解试剂为tfa、苯甲硫醚、tis、edt和h2o的混合溶剂，所述混合溶剂中tfa、苯甲硫醚、tis、edt和h2o的体积比为80～90:10～5:5～2:5～2:1。

本发明提供了一种维拉卡肽的制备方法，本发明使用fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh为原料，将d-arg残基以d-arg-d-arg-d-arg三肽片段的形式接入，有效地避免了缺失肽杂质[-1-d-arg]-维拉卡肽、[-2-d-arg]-维拉卡肽和[-3-d-arg]-维拉卡肽的产生；同时，本发明将脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基活化后再与boc-l-cys-oh进行偶联反应，可以成功的构建维拉卡肽的二硫键，且本发明提供的制备方法合成效率高，适合工业化大规模生产。实施例结果表明，使用本发明的制备方法所得维拉卡肽的收率可达79.3％，纯度可达98.50％。

附图说明

图1为本发明实施例6所得维拉卡肽的质谱图。

具体实施方式

本发明所使用缩写的具体含义见表1：

表1各缩写的具体含义

本发明提供了一种维拉卡肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)在缩合体系作用下，以fmoc保护的氨基树脂为载体，将全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段进行缩合，得到具有式(a)结构的维拉卡肽-氨基主链肽树脂；所述缩合按照维拉卡肽主链肽从c端至n端的顺序进行；

所述全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段的缩合顺序为：fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(mmt)-oh；

(2)将所述维拉卡肽-氨基主链肽树脂和去mmt保护溶液混合，进行脱mmt保护反应，得到具有式(b)结构的脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂；

(3)将所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基活化后与boc-l-cys-oh混合，进行偶联反应，得到具有式(c)所示结构的全保护维拉卡肽-氨基树脂；

(4)将所述全保护维拉卡肽-氨基树脂和裂解试剂混合进行裂解反应，得到维拉卡肽。

在本发明中，所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段优选由以下方法制备得到：

(i)将fmoc-d-arg(pbf)-oh和hosu在dcc的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-osu；

(ii)将所述fmoc-d-arg(pbf)-osu和h-d-arg(pbf)-oh在碱催化剂的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh；

(iii)将所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh和hosu在dcc的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu；

(iv)将所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu、h-d-arg(pbf)-oh在碱催化的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。

在本发明中，所述步骤(i)中fmoc-d-arg(pbf)-oh、hosu与dcc的摩尔比优选为1:1.0～1.5:1.0～1.5，更优选为1:1.1:1.1。

在本发明中，所述步骤(i)中偶联反应的溶剂优选为thf，本发明对所述溶剂的用量没有特殊要求，能够使反应顺利进行即可；在本发明中，所述步骤(i)中的偶联反应优选包括依次进行的低温反应阶段和室温反应阶段，所述低温反应阶段的温度优选为0℃，时间优选为0.5～2h，更优选为1h；所述室温反应阶段的温度优选为25℃，时间优选为3h；在本发明中，所述dcc为偶联反应的缩合试剂。

在本发明的具体实施例中，优选先将fmoc-d-arg(pbf)-oh、hosu溶于溶剂中，得到混合液；将dcc溶于溶剂中，得到dcc溶液；然后向所得混合液中滴加dcc溶液，在冰水浴条件下进行低温反应，低温反应完成后，将反应液温度升至室温，开始进行室温反应。在本发明中，所述低温反应的时间以所述dcc溶液滴加完毕开始计算；所述室温反应的时间自升温至室温反应阶段的温度时开始计算。

步骤(i)的偶联反应完成后，本发明优选对偶联反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将偶联反应液依次进行过滤和第一蒸干，得到蒸干物；将所述蒸干物溶解于dcm中后依次进行过滤和第二蒸干，得粗产物；使用乙酸乙酯为溶剂，将所述粗产物进行重结晶，得到fmoc-d-arg(pbf)-osu。本发明对所述过滤、蒸干和重结晶的具体方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的过滤、蒸干和重结晶操作即可。

得到fmoc-d-arg(pbf)-osu后，本发明优选将所述fmoc-d-arg(pbf)-osu、h-d-arg(pbf)-oh在碱催化剂的作用下进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。在本发明中，所述fmoc-d-arg(pbf)-osu、h-d-arg(pbf)-oh和碱催化剂的摩尔比优选为1：1.2：1.2，所述碱催化剂优选为na2co3；在本发明中，所述步骤(ii)中偶联反应的温度优选为25℃，时间优选为8～12h；所述步骤(ii)中偶联反应的溶剂优选为thf-h2o混合溶剂，本发明对所述溶剂的用量没有特殊要求，能够使反应顺利进行即可。

在本发明的具体实施例中，所述步骤(ii)中偶联反应的步骤具体为：

将h-d-arg(pbf)-oh、碱催化剂溶于thf水溶液中，得到混合液；

将fmoc-d-arg(pbf)-osu溶解于thf中，得到fmoc-d-arg(pbf)-osu溶液；

向所述混合液中滴加fmoc-d-arg(pbf)-osu溶液，进行偶联反应。

在本发明中，溶解h-d-arg(pbf)-oh和碱催化剂用的thf水溶液中thf的体积分数优选为50％；溶解h-d-arg(pbf)-oh和碱催化剂用的thf水溶液和溶解fmoc-d-arg(pbf)-osu用的thf共同构成步骤(ii)中偶联反应的溶剂体系；所述步骤(ii)中偶联的时间自fmoc-d-arg(pbf)-osu溶液滴加完成后开始计算。

步骤(ii)中偶联反应完成后，本发明优选对所得偶联反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将所述偶联反应液依次进行旋蒸、萃取、洗涤、干燥和重结晶，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh固体。

在本发明中，所述旋蒸的温度优选为30～35℃，时间优选为2～5h。本发明通过旋蒸去除偶联反应液中的溶剂。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯，本发明优选在萃取前使用体积分数为15％的柠檬酸将旋蒸液的ph值调至3；在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为饱和nacl溶液；所述干燥用干燥剂优选为无水na2so4。所述重结晶用溶剂优选为乙酸乙酯。

得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh后，本发明优选将fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、hosu与dcc混合，进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu。在本发明中，所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、hosu与dcc的摩尔比优选为1：1.1：1.1；所述步骤(iii)中偶联反应的操作方式以及后处理方式与所述步骤(i)中相同，仅将原料进行替换即可，在此不再赘述。

得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu后，本发明优选将所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu、h-d-arg(pbf)-oh和碱催化剂混合，进行偶联反应，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。在本发明中，所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu、h-d-arg(pbf)-oh和碱催化剂的摩尔比优选为1：1.2：1.2，所述碱催化剂优选为na2co3。在本发明中，所述步骤(iv)中偶联反应的操作方式以及后处理方式与所述步骤(ii)相同，仅将原料进行替换即可，在此不再赘述。

得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh后，本发明在缩合体系作用下，以fmoc保护的氨基树脂为载体，将全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段进行缩合，得到具有式(a)结构的维拉卡肽-氨基主链肽树脂。在本发明中，所述缩合具体优选为：

i)将fmoc氨基树脂溶胀后，在去fmoc保护溶液作用下进行脱fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂；

ii)将所述全保护氨基酸、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段与缩合体系混合，进行活化反应，得到活化的氨基酸和活化的三肽片段；

iii)将所述活化的氨基酸和三肽片段与所述脱保护的氨基树脂混合，进行缩合反应，得到维拉卡肽-氨基主链肽树脂；

所述步骤i)和步骤ii)没有时间顺序的限制。

本发明将fmoc氨基树脂溶胀后，在去fmoc保护溶液作用下进行脱fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂。在本发明中，所述氨基树脂优选为rinkamide树脂、rinkamidembha树脂和rinkamideam树脂中的一种或几种；所述氨基树脂的取代度优选为0.2～1.0mmol/g，更优选为0.4～0.8mmol/g。在本发明中，所述溶胀用溶胀剂优选为dcm和/或dmf；所述溶胀剂体积与fmoc氨基树脂的质量比优选为10ml：1g，所述溶胀的时间优选为0.5h。本发明优选在溶胀后对所述fmoc氨基树脂进行洗涤，所述洗涤用洗涤剂优选为dmf。

在本发明中，所述去fmoc保护溶液优选为哌啶和dmf的混合液；所述混合液中哌啶和dmf的体积比优选为1：4。在本发明中，所述脱fmoc保护优选包括依次进行的第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，具体为：将去保护溶液加入到溶胀氨基树脂固体中，进行脱fmoc保护，得到第一脱fmoc保护氨基树脂；再将去保护溶液加入到所述第一脱fmoc保护氨基树脂中，进行第二次脱fmoc保护，得到脱fmoc保护氨基树脂。在本发明中，所述第一次脱fmoc保护的温度优选为15～35℃，时间优选为5min；所述第二次脱fmoc保护的温度优选为15～35℃，时间优选为10min。本发明采用两次脱fmoc保护，可以保证氨基树脂完全脱fmoc保护。

完成脱fmoc保护后，本发明优选将所述脱保护的氨基树脂洗涤至中性，所述洗涤用洗涤剂优选为dmf。

本发明优选将所述全保护氨基酸、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段与缩合体系混合，进行活化反应，得到活化的氨基酸和活化的三肽片段。在本发明中，所述缩合体系优选包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂优选为dic/hobt、pybop/hobt/diea或hatu/hobt/diea；所述反应溶剂优选为dmf、dcm、nmp和dmso中的一种或几种。在本发明中，所述活化反应的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃；所述活化反应的时间优选为5～10min，更优选为6～8min。

得到脱保护的氨基树脂和活化的氨基酸和活化的三肽片段后，本发明优选将所述活化的氨基酸和活化的三肽片段与所述脱保护的氨基树脂混合，进行缩合反应，得到维拉卡肽-氨基主链肽树脂。在本发明中，所述缩合按照维拉卡肽主链肽从c端至n端的顺序进行；所述全保护氨基酸和fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段的缩合顺序为：fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(mmt)-oh。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃；所述缩合反应的时间优选为1～5h，更优选为3～4h。在本发明中，所述全保护氨基酸、缩合剂与fmoc氨基树脂的摩尔比优选为2～5：2～5：1，更优选为3～4：3～4：1。

本发明优选使用茚三酮反应显色的方法监控缩合反应进程，所述茚三酮反应显色的方法具体为：取少量缩合反应产物至于试管中，使用dmf洗涤两次，在试管中加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min，再用dmf洗涤两次后，观察缩合反应产物颜色，若树脂为黄色，则说明此氨基酸或肽片段缩合完全，可进行下一个氨基酸或肽片段的缩合；若树脂为蓝色，则说明此氨基酸或肽片段未缩合完全，需要重新缩合。

本发明使用fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh为原料，将d-arg残基以d-arg-d-arg-d-arg三肽片段的形式接入，有效的避免了缺失肽杂质[-1-d-arg]-维拉卡肽、[-2-d-arg]-维拉卡肽和[-3-d-arg]-维拉卡肽的产生。

在本发明中，所述fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh三肽片段的制备使用的是液相合成法，所述维拉卡肽-氨基主链肽树脂的制备使用的是固相合成法，本发明通过固液结合方式进行维拉卡肽生产，能够提高生产效率，适合规模化工业生产。

得到具有式(a)结构的维拉卡肽-氨基主链肽树脂后，本发明将所述维拉卡肽-氨基主链肽树脂和去mmt保护溶液混合，进行脱mmt保护反应，得到具有式(b)结构的脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂。在本发明中，所述去mmt保护溶液优选为tfa的dcm溶液，所述去mmt保护溶液中tfa的体积含量优选为1～3％，更优选为1.5～2.5％。在本发明中，所述脱mmt保护反应的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃；所述脱mmt保护反应的时间优选为5～10min，更优选为6～8min。

完成脱mmt保护反应后，本发明优选将得到的产物依次进行洗涤和烘干，得到所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂；所述洗涤用洗涤剂优选为dcm和/或dmf。

得到具有式(b)结构的脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂后，本发明将所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基活化后与boc-l-cys-oh混合，进行偶联反应，得到全保护维拉卡肽-氨基树脂。在本发明中，所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基的活化方法优选为：

将所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂中与活化剂混合，进行活化反应，得到cys侧链巯基活化的维拉卡肽-氨基主链肽树脂。在本发明中，所述活化反应的方程式如式(d)所示；

在本发明中，所述活化剂优选为2,2'-二硫二吡啶；所述脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂与活化剂的质量比优选为3.1：1；所述活化时间优选为2h。本发明优选使用搅拌的方式进行混合。

活化反应完成后，本发明优选对所得活化产物依次进行洗涤和干燥，得到所述cys侧链巯基活化的维拉卡肽-氨基主链肽树脂；本发明对所述洗涤和干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的洗涤和干燥方式即可。

在本发明中，所述cys侧链巯基活化的维拉卡肽-氨基主链肽树脂与boc-l-cys-oh的摩尔比优选为1:5；所述偶联反应的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃；所述偶联反应的时间优选为3h。偶联反应完成后，本发明优选对所得全保护维拉卡肽-氨基树脂依次进行洗涤和干燥，本发明对所述洗涤和干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的洗涤和干燥方式即可。本发明通过将脱mmt维拉卡肽-氨基主链肽树脂的cys侧链巯基活化后再与boc-l-cys-oh进行偶联反应，可以成功的构建维拉卡肽的二硫键。

得到全保护维拉卡肽-氨基树脂后，本发明将所述全保护维拉卡肽-氨基树脂和裂解试剂混合进行裂解反应，得到维拉卡肽。在本发明中，所述裂解试剂优选为tfa、苯甲硫醚、tis、edt和h2o的混合溶剂，所述混合溶剂中tfa、苯甲硫醚、tis、edt和h2o的体积比优选为80～90：10～5：5～2：5～2：1，更优选为84～86：9～6：4～3：1；所述裂解试剂与所述全保护维拉卡肽-氨基树脂的体积比优选为5～10：1，更优选为6～8：1。在本发明中，所述裂解反应的温度优选为25℃，所述裂解反应的时间优选为3h。本发明通过裂解反应可以将全保护维拉卡肽-氨基树脂裂解成氨基树脂和全保护维拉卡肽，并切除全保护维拉卡肽的侧链保护基。

裂解反应完成后，本发明优选对所得裂解反应液进行后处理；所述后处理优选为：将所述裂解液抽滤得到滤液，将所述滤液加至预冷的乙醚中依次进行沉淀和离心，再用乙醚将离心产物洗涤后真空干燥，得到维拉卡肽固体。在本发明中，所述滤液与预冷的乙醚的体积比为1：5～10；所述预冷的乙醚的温度优选为0～15℃。本发明利用维拉卡肽不溶于乙醚的性质，当滤液加入到预冷的乙醚中时，维拉卡肽可析出形成沉淀，与其他液态杂质分离。本发明对所述离心、洗涤和干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的方式即可。

得到维拉卡肽固体后，本发明优选对所得维拉卡肽固体进行纯化。在本发明中，所述纯化的方式优选为色谱纯化法。在本发明中，所述色谱纯化法所用系统优选为novaseprp-hplc系统，在本发明中，所述色谱纯化法的色谱波长优选为220nm，色谱柱优选为反相c18柱，流动相优选为tfa和乙腈混合溶液，所述混合溶液中tfa的体积含量优选为1％。

纯化后，本发明优选对所得纯化物依次进行浓缩和干燥，得到维拉卡肽纯品；在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥。

下面结合实施例对本发明提供的维拉卡肽的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh的制备：

1)fmoc-d-arg(pbf)-osu的合成：

将0.1molfmoc-d-arg(pbf)-oh和0.11molhosu溶于0.2lthf中，置于冰水浴，得混合液i；将0.11moldcc溶于0.1lthf中，并滴加至混合液i中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加dcm溶解过滤、蒸干，得固体i；加乙酸乙酯将固体i溶解后进行重结晶，得到fmoc-d-arg(pbf)-osu。

2)fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh的合成：

将0.12molh-d-arg(pbf)-oh和0.12molna2co3溶于0.2l体积分数50％thf/h2o溶液，得混合液ii；将fmoc-d-arg(pbf)-osu溶于thf中，并滴加至混合液ii中，25℃反应8h后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调ph至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和nacl溶液洗涤3次，加无水na2so4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体ii；用乙酸乙酯将固体ii溶解后、进行重结晶，得到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。

3)fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu的合成：

将0.1molfmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh和0.11molhosu溶于2lthf中，至于冰水浴，得混合液iii；将0.11moldcc溶于0.1lthf中，并滴加至混合液iii中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后；将反应液过滤、蒸干，再加dcm溶解过滤、蒸干，得fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu。

4)fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh的合成：

将0.12molh-d-arg(pbf)-oh和0.12molna2co3溶于0.2l体积分数50％thf/h2o溶液，得混合液iv；将fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-osu溶于thf中，并滴加至混合液iv中，25℃反应8h后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调ph至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和nacl溶液洗涤3次，加无水na2so4过夜干燥，蒸干溶剂，得fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh。

实施例2

维拉卡肽-氨基主链肽树脂的制备：

1)fmoc氨基树脂溶胀：取20g替代度为0.5mmol/g的rinkamidembha树脂，加入200mldcm或dmf将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂后，再用dmf洗涤树脂两次，抽干溶剂，得氨基树脂固体i。

2)fmoc氨基树脂脱fmoc保护：向步骤1)制得的氨基树脂固体i中，加入200ml体积比为1:4的哌啶和dmf组成的去保护溶液，在25℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，第一次脱fmoc保护时间为5min，第二次脱fmoc保护时间为10min后，再用dmf洗涤氨基树脂ph至7，抽干溶剂，得脱保护的氨基树脂；

3)氨基酸和肽片段活化：分别将fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(mmt)-oh各30mmol与缩合体系：30mmolhobt和30mmoldic，用适量的dmf溶解，在25℃条件下反应5min，得活化后的氨基酸和肽片段。

4)缩合：将步骤3)制得的活化后的氨基酸和活化后的肽片段加至步骤2)制得的脱除fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控缩合反应进程，逐步缩合活化后的保护氨基酸和肽片段：按照阿巴帕肽主链肽序从c端至n端依次缩合的全保护氨基酸和肽片段顺序为fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(mmt)-oh；最终得维拉卡肽-氨基主链肽树脂n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamidembha树脂，树脂37.06g，增重率95％。

上述茚三酮显色方法：取少量树脂至于试管中，dmf洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min后，再用dmf洗涤两次后，观察树脂颜色。

实施例3

mmt保护基的脱除：

将实施例2制得的维拉卡肽-氨基主链肽树脂加入到反应柱中，加入dmf溶胀30min，抽掉dmf，加入dmf洗涤两次，再加入dcm洗涤两次；加入400ml2％tfa/dcm溶液反应5min，抽掉溶液，然后再加入400ml5％tfa/dcm溶液反应2min，树脂用400mldcm洗3遍，再用dmf洗3遍。树脂收缩抽干，得到34.34g树脂片段：n-ac-d-cys-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamidembha树脂。

实施例4

全保护维拉卡肽-氨基树脂合成：

称取11.00g2,2'-二硫二吡啶，溶于400mldmf中，缓慢加入实施例3的34.34g树脂片段：n-ac-d-cys-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamidembha树脂中，搅拌反应2小时，抽干反应液，树脂用dmf洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到cys侧链巯基活化的肽树脂片段：n-ac-d-cys(spyridine)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamidembha树脂。

称取11.05gboc-l-cys-oh和2.0mldipea加入400mldmf中，缓慢加入n-ac-d-cys(spyridine)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamidembha树脂，室温反应3小时。偶联结束，抽干反应液，用dmf洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到全保护维拉卡肽-氨基树脂35.52g。

实施例5

产品裂解：

向实施例4制得的全保护维拉卡肽-氨基树脂中加入其10倍体积的裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥得到维拉卡肽。其中裂解试剂为tfa、苯甲硫醚、tis、edt和h2o的混合溶剂，其中体积比为：tfa:苯甲硫醚:tis:edt:h2o＝90:5:2:2:1。

得到白色维拉卡肽固体10.32g，粗肽纯度91.8％，粗肽收率为98.5％。

实施例6

粗肽的纯化：

取实施例5制备得到的维拉卡肽粗肽2.00g，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色维拉卡肽固体1.61g，收率为80.5％，经检测hplc纯度98.50％，总收率79.3％。所得维拉卡肽产品质谱如图1所示，[m]+1：1048.545，维拉卡肽的理论精确分子量为：1047.529，样品质谱结果与理论分子量相符。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。