一种马泰勒虫鉴别检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种动物寄生虫的鉴别检测试剂盒，特别是一种马泰勒虫鉴别检测试剂盒，及非疾病检测目的使用方法。

背景技术：

马梨形虫病(equinepiroplasmosis)是由马泰勒虫(theileriaequi)或驽巴贝斯虫(babesiacaballi)寄生于马属动物红细胞内所引起的一种蜱传性血液原虫病。临床表现为高热、贫血、黄疸、出血和呼吸困难等症状，若诊治不及时，死亡率较高。该病呈全球性分布，热带和亚热带地区多发，在我国的马梨形虫病在多个省份均有零星的报道。xu等(2003)利用elisa方法对采集自吉林省的111份马血清的流行病学调查结果显示，马泰勒虫和驽巴贝斯虫阳性率分别为34％和32％，混合感染率为12％。wang等(2013)利用建立的elisa方法对我国10省份1990份血清进行流行病学调查，结果显示驽巴贝斯虫平均抗体阳性率为51.16％，马泰勒虫抗体阳性率为11.51％，混合感染率为7.64％。有报道称，马梨形虫病的死亡率为10％(李朝君等，1997)。上述研究表明，马梨形虫病东北、西北、华北等地区均有流行，而且给养马户造成了大的经济损失。

为了该病进行有效的预防和针对性的控制，建立有效的检测方法尤为必要。目前马梨形虫诊断技术有最为经典的血涂片染色镜检和淋巴结穿刺检测法，还有基于免疫学和分子生物学技术发展而来的间接荧光抗体、酶联免疫吸附试验、pcr、环介导恒温扩增技术、荧光定量pcr等。血涂片染色镜检操作简便，应用广泛。但是血涂片制作要求较高，镜检也需要一定的经验，故容易出现漏检和误检。淋巴结穿刺作为辅助性诊断方法，在实际诊断中已很少使用。间接荧光抗体、酶联免疫吸附试验、pcr、环介导恒温扩增技术、荧光定量pcr等方法具有高敏感性和高特异性的特点，但操作相对复杂，有的还需要昂贵的设备。

技术实现要素：

本发明提供一种可克服现有技术不足，用于检测鉴别检测马泰勒虫的试剂盒。

本发明的马泰勒虫鉴别检测试剂盒中包括有:两条外围引物seqidno.1和seqidno.2、一条交叉引物seqidno.3、一条fitc标记的探针引物seqidno.4和一条生物素标记的探针引物seqidno.5。

为方便使用，本发明的马泰勒虫鉴别检测试剂盒中还包括有：10×isothermalamplificationbuffer、100mmmgso4、2.5mmdntpmix，bstdna聚合酶，以及免疫层析试纸条。

本发明是在对比分析了马泰勒虫和驽巴贝斯虫18srrna基因序列后，在变异的区段设计用于马泰勒虫的交叉扩增引物，和相应的探针引物，建立一种鉴别检测马泰勒虫的方法，即：从待检马血中提取血液基因组dna，然后以将该dna用本发明试剂盒的引物进行恒温扩增，取扩增产物滴至免疫层析试纸条的吸收垫上，随后将试纸条插入到含有层析缓冲液的容器内静置3～5min，根据质控线和检测线显色与否判定被检样品是否感染马泰勒虫。

本发明的优点在于：

1)特异性强，本发明检测试剂盒的扩增引物中包括有fitc标记的探针引物he-2a和生物素标记的探针引物he-3a识别马泰勒虫的特异序列区，保证了该方法的特异性，与驽巴贝斯虫没有交叉反应；

2)敏感性高，本发明以多拷贝的18srrna为靶基因，极大地提高了检测方法的灵敏度，每个反应体系中大于1个拷贝的质粒标准品即可被检测出；

3)本发明操作简便、快速：整个检测过程在一个小时内全部完成，对操作人员操作技能要求低，只需要具备普通pcr操作的人员均可进行本操作。反应全过程只需要一小时，结果检测只需要1-2分钟，特别适合马泰勒虫病的现场快速检测；

4)使用范围广：交叉引物扩增不需要昂贵的荧光定量pcr仪或pcr仪，只要有提供恒温的设备，如水浴锅、干烤箱等均可进行本检测，适用于基层临床样品的检测和流行病学调查；

5)检测结果已读：扩增产物经试纸条显色后，以肉眼可见的方式来读取，不需要进行专门的检测设备。

附图说明

附图1至4为使用本发明的检测方法进行检测后免疫层析试纸条显色的情况，其中：

图1最佳反应温度的筛选。1为阴性对照，2为55℃，3为58℃，4为61℃；

图2最佳反应时间的筛选。1为阴性对照扩增100min，2为30min，3为40min，4为50min，5为60min，6为80min，7为100min；

图3交叉引物扩增特异性检测。1为马泰勒虫，2为驽巴贝斯虫；

图4交叉引物扩增敏感性试验。1为马泰勒虫质粒10⁵/μl；2为马泰勒虫质粒10⁴/μl；3为马泰勒虫质粒10³/μl；4为马泰勒虫质粒10²/μl；5为马泰勒虫质粒10¹/μl；6为马泰勒虫质粒100/μl；7为阴性对照。

具体实施方式

本发明以下结合实施例进行解说，在以下内容中所述的免疫层析试纸条购自twistdx公司。

实施例1：最佳反应温度和反应时间的筛选

1.马泰勒虫基因组dna提取

取液氮冻存的马泰勒虫虫血200μl，用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作方法参照说明书进行。

2.引物设计

根据马泰勒虫和驽巴贝斯虫18srrna基因序列，比对分析后，在变异的区段设计用于扩增马泰勒虫的交叉扩增引物，扩增长度约为110bp。

置换引物he-5a：5'-ctgcatcgtggttcttcgc-3'(seqidno.1)

置换引物he-4s：5'-gcaaaagcctgcttgaag-3'(seqidno.2)

交叉引物he-2a1s：5'-

tcgagtgatcttcgttgcaaagtaaatgtcgagtc-3'(seqidno.3)

探针引物he-2a：5'-fitc-tcgagtgatcttcgttg-3'(seqidno.4)

探针引物he-3a：5'-bio-gcttagttggggcatg-3'(seqidno.5)

3.交叉引物恒温扩增

扩增体系：

将上述反应管分别在55℃、58℃、61℃进行反应50min，80℃2min灭活。选择最佳反应温度后，进行反应时间的优化，即在选择的最优反应温度下反应30min、40min、50min、60min，80min，100min随后80℃2min灭活。

4.扩增产物检测

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

5.结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果表明(图1)，最佳反应温度选择58℃；反应时间选择50min(图2)。

实施例2：交叉引物扩增的特异性检测

1.马泰勒虫和驽巴贝斯虫基因组dna提取

取液氮冻存的马泰勒虫和驽巴贝斯虫含虫血各200μl用qiaampdnamini-kit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.恒温扩增

以提取的马泰勒虫和驽巴贝斯虫为模板建立如下的扩增体系：

将反应管置于58℃反应50min，80℃2min灭活

3.扩增产物检测

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

4.检测结果判定

质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果见图3，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对马泰勒虫具有良好的特异性，与驽巴贝斯虫没有交叉反应。

实施例3：灵敏度试验

1.马泰勒虫18srrna重组质粒标准品的制备

马泰勒虫18srrna基因扩增。参照文献报道的梨形虫扩增通用引物piro1-s和piro3-as(yangetal.,2014)和扩增条件进行马泰勒虫18srrna基因扩增。

(1)pcr反应体系为：

(2)反应条件

94℃预变性5min，然后94℃30s、55℃30s、72℃90s，35个循环，72℃延伸7min。取5μl扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的pcr产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回收的dna片段与pclone007-t载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

(3)pclone007-t连接产物的转化以

(a)-80℃的超低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的lb液体培养基1ml，37℃150转，培养90min。

(e)取100μl涂布于氨苄抗性的lb平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄抗性的lb液体培养基的1.5mlep管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μl作为模板进行菌液pcr鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的lb液体培养基中进行扩摇。

(4)质粒测序鉴定

经过菌落pcr鉴定为阳性的克隆，送上海生物工程有限公司进行测序鉴定。测序鉴定正确的克隆提取质粒，使用nanodrop2000/2000c(thermoscientific，america)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μl，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μl，以便进行敏感性测试。

2.恒温扩增

制备的梯度稀释的质粒样品，利用如下扩增体系进行敏感性的测试：

将上述反应管分别在58℃进行反应50min，80℃2min灭活。

4.扩增产物分析

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果见图4，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对马泰勒虫具有高灵敏度；可以检测每个反应体系中大于1个拷贝的质粒标准品。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种马泰勒虫鉴别检测试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(置换引物he-5a)

<400>1

ctgcatcgtggttcttcgc19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(置换引物he-4s)

<400>2

gcaaaagcctgcttgaag18

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(交叉引物he-2a1s)

<400>3

tcgagtgatcttcgttgcaaagtaaatgtcgagtc35

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(探针引物he-2a)

<400>4

tcgagtgatcttcgttg17

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(探针引物he-3a)

<400>5

gcttagttggggcatg16