一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于酶提取技术领域。具体地，涉及一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂及其制备方法和应用。

背景技术：

低聚果糖(fos)是一种天然活性物质，是具有调节肠道菌群、增殖双歧杆菌，促进钙吸收等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂-促生物质。目前，fos的工业生产可以蔗糖为底物，利用微生物发酵生产的β—果糖基转移酶(β-fructosyltransferase)或β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase)进行分子间果糖基转移反应进行生产。工业上，主要以霉菌发酵生产果糖基转移酶，且果糖基转移酶是霉菌的胞内酶。胞内酶的提取比胞外酶要复杂，且因为霉菌菌丝体细胞壁比较厚，含有几丁质或纤维素的结构，较细菌或酵母强度高，需要采用特殊的设备或特殊的溶剂使细胞破碎，然后才能进行下一步的分离纯化操作以获得有效的酶蛋白，但现有机械破碎或者溶剂破壁效果不好，容易失活。

传统细胞破碎工艺包括机械破碎法、化学法破碎或者酶法破壁。机械破碎法如超声破碎，它是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而将液体中的固体颗粒或细胞组织破碎，最终释放酶蛋白。超声波破碎处理量较大，在此过程中会产生热效应、空穴效应、机械效应、热效应，他们对生物大分子蛋白质活性都有一定影响，为避免酶活损失，需要谨慎控制过程条件。此外，超声波破碎法需要特殊的设备、操作复杂、能耗大、所得酶杂质多、酶活性易受影响；化学提取法则因为细胞壁破碎能力有限而提取速度低、效率差，且由于化学试剂或生化试剂的添加容易形成新的污染，给分离纯化增添麻烦；另外，现有技术中，对于霉菌胞内蛋白的提取往往存在能耗高、酶活低，纯化困难、成本高、污染环境的问题。

深度共熔溶剂是一类由氢键受体与氢键供体按一定比例混合而成的室温下为液体的绿色溶剂。所用原料绿色可再生、合成方便、成本低，且其物理化学性质会随着氢键受体与氢键供体种类比例的改变而调整，已广泛用于各种活性物质的提取中，如生物质木质素组分的提取、黄酮类有效物质的提取、花青素的提取等领域。cn105777696a公开了一种利用深度共溶剂提取花青素的方法，具体通过季铵盐与氢键供体按摩尔比1:(10～19)混合，具体地，所述季铵盐为氯化胆碱、四甲基氯化铵、丁基三甲基氯化铵、四乙基氯化铵、三丁基甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵和四丁基氯化铵中的至少一种；所述氢键供体为乙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和乳酸中的至少一种。然而，目前尚未见有能够用于提取黑曲霉菌丝体胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂的相关报道。

因此，寻找一种快速、简便、廉价的基于深度共溶剂的胞内果糖基转移酶提取方法具有很高的实用价值。

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂。

本发明的第二个目的是提供上述深度共熔溶剂的制备方法。

本发明第三个目的是提供由上述方法制备得到的深度共熔溶剂在提取霉菌胞内果糖基转移酶中的应用。

本发明第四个目的是提供一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂由季铵盐和/或两性离子与氢键供体按终摩尔比(1～3)：(1～9)制成。

本发明以季铵盐和/或两性离子与氢键供体为深度共熔溶剂，通过调节季铵盐和/或两性离子与氢键供体的比例使深度共熔溶剂能够可选择、可控地破坏霉菌细胞壁，进而促进霉菌胞内果糖基转移酶释放。

所述深度共熔溶剂绿色环保、可再生、可重复利用，能够有效破坏霉菌细胞壁，同时维持或提高果糖基转移酶的活性和稳定性，促进胞内果糖基转移酶的释放。

优选地，所述季铵盐为氯化胆碱。

优选地，所述两性离子为甜菜碱。

优选地，所述氢键供体为木糖醇、葡萄糖、氨基酸、乙二醇、苹果酸或乳酸中的任意一种或几种。

本发明通过选择合适的深度共熔溶剂合成原料或者调节氢键受体与供体的比例获得合适的溶剂，最终可选择、可控地破坏黑曲霉细胞壁，从而促进胞内果糖基转移蛋白的高效释放，同时可维持酶分子的构象和活性，实现快速、高效地获得果糖基转移酶。

同时，本申请请求保护上述深度共熔溶剂的制备方法，将上述季铵盐和/或两性离子与氢键供体在60～120℃，130～170rpm条件下搅拌1～4h，至混合物变澄清，冷却至室温，即得。

优选地，所述季铵盐和/或两性离子与氢键供体的搅拌时间为2～4h，以使季铵盐和/或两性离子与氢键供体能够充分混合。

基于上述深度共熔溶剂能够破坏霉菌细胞壁进而获得具有较高活性的果糖基转移酶。因此，本发明还请求保护上述深度共熔溶剂在提取霉菌胞内果糖基转移酶中的应用。

此外，本发明还请求保护一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，具体包括以下步骤：将上述深度共熔溶剂的水溶液与发酵72～96h的黑曲霉菌丝体混合，于30～65℃、140～160rpm条件下提取0.5～4h，然后过滤或离心分离后透析48～72h、冷冻干燥，即得果糖基转移酶。

上述利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，提取过程简便、能耗低、条件温和，对黑曲霉菌丝体中的果糖基转移酶的提取效率高，所得果糖基转移酶纯度高、杂蛋白少、酶蛋白活性高、活性损失小。

本申请中，深度共熔溶剂的水溶液中，深度共熔溶剂与水的质量比需要控制在一定范围内，以使黑曲霉菌丝体能够被充分破壁，又不浪费深度共熔溶剂。

优选地，所述黑曲霉的质量分数为0.5～6.5％。

优选地，所述深度共熔溶剂的水溶液中，深度共熔溶剂与水的质量比为1：(1～9)。

优选地，所述提取时间为0.5～3h。

更优选地，上述提取条件为40～60℃，140～160rpm，以使果糖基转移酶被充分提取。

为得到纯度和活性较高的果糖基转移酶，需要控制透析袋的透析时间。

优选地，所述透析时间为48～72h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所用深度共熔溶剂绿色环保、可再生、可重复利用，能够有效破坏霉菌细胞壁并可调控破坏程度，同时有效维持或提高果糖基转移酶的活性和稳定性，促进胞内果糖基转移酶的释放；利用上述深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶，提取过程简便、能耗低、条件温和，对黑曲霉菌丝体中的果糖基转移酶的提取效率高，所得果糖基转移酶纯度高、杂蛋白少、酶蛋白活性高、活性损失小，提取粗酶活可达1000～1400u/g菌丝体。

说明书附图

图1-实施例1用深度共熔溶剂提取前后的菌体形态图；其中图a、图b、图c为提取前的菌体形态；图d、图e、图f为提取后的菌体形态。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一、方法

一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)深度共熔溶剂的制备：将氯化胆碱与木糖醇按1：1的终摩尔比混合，于100℃，150rpm条件下搅拌3h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温即得能够用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂；

(2)果糖基转移酶的提取：精确称量5g深度共熔溶剂的水溶液(10～50％w/w)于烧瓶中，并向其中加入200mg发酵84h后的黑曲霉菌丝体，向烧瓶中加入搅拌子并置于磁力搅拌器上搅拌，在45℃，150rpm条件下提取2h，随后冷却至室温，将提取混合物过滤，收集提取液，于透析袋中透析60h，再透析干净的提取液冷冻干燥即得果糖基转移酶。

二、结果

经过深度共熔溶剂提取前后黑曲霉菌丝体的菌体形态如图1所示，从图1可以看出，黑曲霉菌丝体在经深度共熔溶剂提取前细胞壁完整，且表面光滑、无褶皱，经深度共熔溶剂提取后菌丝体细胞壁被破坏，出现开裂和部分褶皱与坍塌现象，说明深度共熔溶剂能够有效的破坏黑曲霉菌丝体的细胞壁，利于胞内果糖基转移酶蛋白的渗出。

实施例2

一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)深度共熔溶剂的制备：将氯化胆碱与乙二醇按1：2的终摩尔比混合，于60℃，130rpm条件下搅拌1h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温即得能够用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂；

(2)果糖基转移酶的提取：精确称量5g深度共熔溶剂的水溶液(10～50％w/w)于烧瓶中，并向其中加入250mg发酵96h后的黑曲霉菌丝体，向烧瓶中加入搅拌子并置于磁力搅拌器上搅拌，在30℃，140rpm条件下提取4h，随后冷却至室温，将提取混合物过滤，收集提取液，于透析袋中透析48h，再透析干净的提取液冷冻干燥即得果糖基转移酶。

实施例3

一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)深度共熔溶剂的制备：将甜菜碱与乳酸按3：1的终摩尔比混合，于120℃，170rpm条件下搅拌4h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温即得能够用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂；

(2)果糖基转移酶的提取：精确称量5g深度共熔溶剂的水溶液(10～50％w/w)于烧瓶中，并向其中加入250mg发酵96h后的黑曲霉菌丝体，向烧瓶中加入搅拌子并置于磁力搅拌器上搅拌，在55℃，160rpm条件下提取0.5h，随后冷却至室温，将提取混合物过滤，收集提取液，于透析袋中透析72h，再透析干净的提取液冷冻干燥即得果糖基转移酶。

实施例4

一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)深度共熔溶剂的制备：将甜菜碱与葡萄糖按1：9的终摩尔比混合，于100℃，140rpm条件下搅拌2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温即得能够用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂；

(2)果糖基转移酶的提取：精确称量5g深度共熔溶剂的水溶液(10～50％w/w)于烧瓶中，并向其中加入150mg发酵96h后的黑曲霉菌丝体，向烧瓶中加入搅拌子并置于磁力搅拌器上搅拌，在40℃，140rpm条件下提取3h，随后冷却至室温，将提取混合物过滤，收集提取液，于透析袋中透析72h，再透析干净的提取液冷冻干燥即得果糖基转移酶。

对比例1

超声波破碎法提取工业霉菌发酵菌丝体胞内果糖基转移酶。

(1)提取酶蛋白：将500ml乙酸盐缓冲液(50mmol/l，ph＝5.5)加入烧瓶中，加入250mg发酵至96h后的黑曲霉菌丝体，并将所得酶于冰浴中进行超声破碎操作，具体操作为：超声破碎仪探头置于液面下约1cm处，以65w功率超声破碎1s，间隔3s，超声100次。

(2)硫酸铵沉淀：随后过滤提取混合物，收集提取液，分别用饱和度为25％、35％、45％、55％、65％和75％的沉淀蛋白，于4℃静置1小时至沉淀完全，分别将上述沉淀溶于1ml缓冲液中，透析除去硫酸铵，浓缩并冷冻干燥即得果糖基转移酶。

对比例2

0.3％tritonx-100缓冲液溶解提取工业霉菌发酵菌丝体胞内果糖基转移酶。

提取酶蛋白：精确称量100mg发酵84h后的黑曲霉菌丝体于磨口锥形瓶中，向其中加入500ml含0.3％tritonx-100缓冲液(50mmol/l，ph＝5.5)，混匀后，于冰浴条件下孵育50min，随后将提取混合物过滤，收集提取液，加入丙酮沉淀蛋白，收集沉淀后干燥获得果糖基转移酶。

对比例3

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，所用深度共熔溶剂由甜菜碱与羧酸组成。

对比例4

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，所用深度共熔溶剂由四甲基氯化铵与乙二醇组成。

对比例5

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，所用深度共熔溶剂中，所述季铵盐和/或两性离子与氢键供体的终摩尔比为1：10。

对比例6

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，所用深度共熔溶剂中，所述季铵盐和/或两性离子与氢键供体的终摩尔比为4：1。

性能测定

分别选择实施例1～4、对比例1～6得到的果糖基转移酶进行蛋白含量与酶活性测定，具体方法如下：

分别将实施例1～4、对比例1～6得到的果糖基转移酶溶于10ml乙酸盐缓冲液中(50mmol/l，ph＝5.5)制备成相应的酶溶液，以考马斯亮蓝法测定蛋白含量；以蔗糖为底物，hplc法测定糖基转移酶活性。

实施例1～4、对比例1～6所得果糖基转移酶的蛋白含量及酶活性测定结果如下表1：

表1实施例1～4、对比例1～6所得果糖基转移酶的蛋白含量及酶活性测定

由上表1可以看出，与对比例1～6相比，由实施例1～4制备得到的果糖基转移酶的蛋白含量及酶活性更高，说明利用本申请所用深度共熔溶剂能够有效破坏霉菌细胞壁，同时有效维持或提高果糖基转移酶的活性和稳定性，促进胞内果糖基转移酶的释放；利用本发明所述深度共熔溶剂制备得到的果糖基转移酶纯度高、杂蛋白少、酶蛋白活性高、活性损失小，提取粗酶活可达1000～1400u/g菌丝体。

另外，本申请发明人按本申请实施例1所述方法，分别以甜菜碱与氨基酸、甜菜碱与苹果酸、甜菜碱与木糖醇、甜菜碱与乙二醇、氯化胆碱与葡萄糖、氯化胆碱与氨基酸、氯化胆碱与乙二醇、氯化胆碱与苹果酸、氯化胆碱与乳酸、甜菜碱和氯化胆碱与木糖醇、甜菜碱和氯化胆碱与葡萄糖、甜菜碱和氯化胆碱与氨基酸、甜菜碱和氯化胆碱与乙二醇、甜菜碱和氯化胆碱与苹果酸、甜菜碱和氯化胆碱与乳酸为原料制备深度共熔溶剂，并将其用于提取霉菌胞内果糖基转移酶。结果表明利用上述深度共熔溶剂成功提取到了与实施例1类似的具有较高纯度和酶活性的果糖基转移酶。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。