环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用与流程

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用。

背景技术：

核酸检测是生物医学研究中一种广泛应用的重要方法，其在感染性病原体诊断的应用中具有重要的临床价值。pcr作为核酸检测中的金标准方法，具有高度的特异性及敏感性等优点，但其操作复杂，对仪器及人员的要求都较高，限制了其在床旁检测及现场快速检测中的应用。

为了克服pcr方法的缺陷，一大类等温核酸扩增方法相继出现，如重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导等温扩增技术(lamp)、链替代扩增技术(sda)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(had)及交叉引物扩增(cpa)等。这些方法在恒温的条件下进行反应，对仪器的要求显著下降，适宜于现场快速检测。目前监测这些恒温扩增反应进程的手段主要是应用嵌入式荧光染料的方法，然而这是一种非模板依赖的检测方法，容易导致假阳性结果，影响检测的特异度，进而产生误诊。

fen1(flapendonucleasei)是一种结构特异性的多功能核酸酶，具有5’→3’flap核酸内切酶(fen)、缺口核酸内切酶(gen)和核酸外切酶(exo)三种酶切活性。fen1与大多数人们所知的识别特定核酸序列的限制性内切酶不同，fen1所识别的dna底物与其序列无关，而只识别特定的dna结构。

bstdna聚合酶具有5’→3’聚合酶活性，但没有3’→5’外切酶活性，该酶介导的等温扩增具有快速、灵敏、特异性强等优点。

儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中轮状病毒、星状病毒及腺病毒是造成感染的常见病原体，目前用于诊断这些病毒的方法主要包括免疫学方法及以pcr为基础的核酸检测方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备，专业的技术人员以及易出现假阳性或假阴性结果。

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。

轮状病毒(rotavirus，简称rv)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴儿与幼儿腹泻的单一主因，几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。然而，每一次感染后人体免疫力会逐渐增强，后续感染的影响就会减轻，因而成人就很少受到其影响。

星状病毒(astrovirus，简称as)现在被认为是引起免疫系统不发达的儿童以及老年人出现急性病毒性胃肠炎的重要病原之一。在粪便和上皮细胞中存在病毒颗粒表明该病毒在人的胃肠道中复制并繁殖。人类感染星状病毒的主要症状是腹泻、恶心、呕吐和发烧。一些研究表明，该病毒引起的急性病毒性胃肠炎的潜伏期大约是三到四天。

在pcr中常用的taqman探针法具有高度的特异性，然而等温扩增反应中常用的bstdna聚合酶缺乏剪切探针的能力，故类似taqman探针的高特异性检测方法在等温扩增中难以实施。

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的目的之一，在于提供一种由bstdna聚合酶、结构特异性核酸内切酶fne1和环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法。

本发明的又一目的，在于提供一种具有高灵敏度、高特异性的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系中包含bstdna聚合酶、结构特异性核酸内切酶fne1和环形荧光探针。

本发明的另一目的，在于提供一种利用上文所述的等温核酸扩增体系在制备检测儿童腹泻病原体的试剂中的应用。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，发现为了在等温扩增中实现探针法的信号监测，必须引入一种具有剪切探针能力的核酸酶，且这种核酸酶的反应温度及适宜缓冲液条件需要与bstdna聚合酶相同或相近。本发明人采用结构特异性核酸内切酶fen1与bstdna聚合酶组合，开发了一种新型的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法(circularfluorescentprobemediatedisothermalnucleicacidamplification，cfpa)，并将其应用于常见的儿童腹泻病原体(如轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒)的诊断，从而完成了本发明。即，本发明如下所述：

本发明提供了一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括将待检测核酸样品在结构特异性核酸内切酶、dna聚合酶和环形荧光探针的作用下进行核酸扩增的步骤。

其中，所述结构特异性核酸内切酶为fen1，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶，所述环形荧光探针包含正向环形荧光探针和反向环形荧光探针，所述待检测核酸样品为轮状病毒或星状病毒；优选的，所述环形荧光探针标记荧光基团和淬灭基团，其中所述荧光基团选自fam、hex、vic、tet、cy5、texasred、joe或tfam；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra、dabcyl、eclipse或mgb。

根据本发明所述的等温核酸扩增方法，其特征在于：(i)当所述待检测核酸样品为轮状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记fam荧光基团，在seqidno：1的第11位碱基和seqidno：2的第12位碱基上分别标记tamra淬灭基团；(ii)当所述待检测核酸样品为星状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：3和seqidno：4所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记hex荧光基团，在seqidno：3的第9位碱基和seqidno：4的第8位碱基上分别标记bhq1淬灭基团。

本发明还提供了一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述体系包括结构特异性核酸内切酶、dna聚合酶和环形荧光探针，优选的，所述等温核酸扩增体系中还进一步包括待检测核酸样品。

其中，所述结构特异性核酸内切酶为fen1，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶，所述环形荧光探针包含正向环形荧光探针和反向环形荧光探针，所述待检测核酸样品为轮状病毒或星状病毒；优选的，所述环形荧光探针标记荧光基团和淬灭基团，其中所述荧光基团选自fam、hex、vic、tet、cy5、texasred、joe或tfam；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra、dabcyl、eclipse或mgb；更优选的，(i)当所述待检测核酸样品为轮状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示；(ii)当所述待检测核酸样品为星状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：3和seqidno：4所示。

进一步的，在本发明所述的等温核酸扩增体系中还包含荧光染料，所述荧光染料选自hex、cy5、vic、cy3或ned。在所述等温核酸扩增体系中还包括：tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4、tween-20和dntps。优选的，所述各成分的浓度为：18-22mm(优选为20mm)tris-hcl(ph8.8，25℃)，8-12mm(优选为10mm)kcl，8-12mm(优选为10mm)(nh4)2so4，7-10mm(优选为8mm)mgso4，0.1％tween-20，0.8-1.4μμ(优选为1.2μμ)正向/反向环形荧光探针，2-6u(优选为4u)bstdna聚合酶(例如bst2.0warmstartdna聚合酶)，0.5-0.8u(优选为0.6u)fen1，dntps(each1.4mm)。

所述等温核酸扩增体系的反应条件为：60～65℃，50～70min；优选为63℃，60min。

本发明还提供了含有上文所述等温核酸扩增体系的试剂盒。

本发明还提供了利用上文所述的等温核酸扩增体系在制备检测儿童腹泻病原体的试剂中的应用。其中，所述儿童腹泻病原体包括轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的环形探针介导的等温核酸扩增方法具有以下有益效果：

1)通过一对环形探针，在目标核酸序列存在的情况下，形成可以被fen1识别并剪切的重叠结构，使环形探针上的荧光和淬灭基团分离，形成高特异性的可检测的荧光信号。

2)本发明提供的环形探针介导的等温核酸扩增方法创新的使用了fen1酶，在等温扩增领域实现了探针法的信号监测方式，具有高度的特异性和敏感性，并且具有良好的检测限，最低检测限为10拷贝/反应。

3)经大规模临床验证，本发明提供的环形探针介导的等温核酸扩增方法能够同时检测dna和rna样本，应用范围广泛；并且所述方法的诊断效能与传统金标准方法相比无显著差异，说明本发明提供的cfpa方法在核酸分析、临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1为cfpa方法的基本原理示意图。

图2为cfpa方法基本原理的实验验证结果。其中a为轮状病毒的检测结果；b为星状病毒的检测结果；c为单fam标记和双fam标记的探针扩增结果；d为扩增产物电泳结果，其中泳道m为dnamarker，泳道1-2为轮状病毒阳性产物电泳结果，泳道3-4为星状病毒阳性产物电泳结果，泳道5为轮状病毒阴性产物电泳结果，泳道6为星状病毒阴性产物电泳结果；e为d中所述电泳结果的泳道1中产物的焦磷酸测序结果。

图3为cfpa用于检测轮状病毒cdna样本的结果图。其中a-d分别为敏感性、特异性、最低检测限及样本浓度的对数值(logc)与tt值的线性关系的结果图。

图4为cfpa用于检测轮状病毒rna样本的结果图。其中a-f分别为敏感性、特异性、最低检测限、样本浓度的对数值(logc)与tt值的线性关系、高中低浓度重复试验的稳定性、高中低浓度重复试验的sd和c.v.值的结果图。

图5为大规模临床样本实验评估cfpa法用轮状病毒诊断的诊断效能的结果。其中a为cfpa方法与金标准pcr方法用于轮状病毒诊断效果比对的结果；b和c分别为受试者工作曲线(roc)分析cfpa方法和金标准pcr方法诊断效能的结果图；d为cfpa方法的抗干扰物能力的结果图。

具体实施方式

实施例1cfpa方法的基本原理

本发明将结构特异性核酸内切酶fen1与bstdna聚合酶组合，开发了一种新型环形探针介导的等温核酸扩增方法(cfpa)，该方法的基本原理参见图1。

针对靶序列上的上、下游分别设计一个环形探针，其中正向和反向环形探针的5’端标记荧光基团(f)，在附近的碱基上标记淬灭基团(q)。步骤(1)中正向荧光探针的后半部分首先与模板结合延伸，在bstdna聚合酶的链置换作用下，探针的前半部分与延伸产物中的序列互补配对，在一端形成环状结构如步骤(2)所示。步骤(3)当反向环形探针与模板配对延伸至该环形区域时，环形区域茎干部分的碱基会被逐个替换，形成fen1酶可识别的重叠结构。在fen1酶的作用下该重叠结构区域被剪切，进而荧光基团和淬灭基团分离，出现可检测的信号。与此相同，步骤(4-5)中标记在反向荧光探针上的荧光基团，也会在目的序列存在时，依相同的机理被fen1酶剪切。

实施例2cfpa方法可靠性的验证

2.1为了验证cfpa方法的可靠性，我们进行了如下实验。首先设计针对轮状病毒和星状病毒的环形探针，合成携带轮状病毒及星状病毒保守序列的质粒分子作为阳性对照，用超纯水作为阴性对照，发现这两种病毒质粒均可成功扩增，且保持良好的特异性(分别参见图2中的a和图2中的b)。

其中，轮状病毒的正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示；在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记fam荧光基团，在seqidno：1的第11位碱基和seqidno：2的第12位碱基上分别标记tamra淬灭基团。

星状病毒的正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如seqidno：3和seqidno：4所示；在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记hex荧光基团，在seqidno：3的第9位碱基和seqidno：4的第8位碱基上分别标记bhq1淬灭基团。

其中，所述阳性对照中的轮状病毒保守序列如seqidno：5所示：

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所述阳性对照中的星状病毒保守序列如seqidno：6所示：

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2.2进一步比较仅在轮状病毒正向探针上标记荧光(反向探针不标记)，及正反向两个探针都标记荧光，观察扩增阳性质粒分子时的荧光值，按照实施例1中所述的cfpa方法的基本原理，正反向探针都标记荧光的扩增荧光值应为仅标记一个荧光的两倍左右(参见图2中c)，实验结果与该理论预期相符合。

2.3通过琼脂糖凝胶电泳表明，泳道1-2为轮状病毒阳性的扩增产物，泳道3-4为星状病毒阳性的扩增产物，泳道5为轮状病毒阴性的扩增产物，泳道6为星状病毒阴性的扩增产物，仅有阳性产物的泳道中出现了明显的产物条带，而阴性产物的泳道中没有扩增出产物条带，这与前述荧光扩增曲线的结果一致(参见图2中d)。进一步选取泳道1中的产物进行胶回收及ta克隆测序，结果表明扩增产物序列与理论预期序列一致，进一步证明了本发明中cfpa的可靠性(参见图2中的e)。

实施例3利用cfpa方法检测轮状病毒cdna和rna

3.1评估cfpa方法检测轮状病毒cdna实际样本的检测性能，在8个轮状病毒阳性和24个轮状病毒阴性样本中，cfpa保持了良好的特异性及敏感性(分别参见图3中的a和图3中的b)。用梯度稀释的阳性质粒样本评估了cfpa方法检测轮状病毒cdna时的最低检测限达到了10copies/reaction(参见图3中的c)，且tt值与样本浓度(copies/μl)的对数值(logc)间呈良好的线性关系(参见图3中的d)。

3.2cfpa方法中使用的bst2.0热启动dna聚合酶同时具有天然的逆转录活性，故该方法具有直接检测rna样本的能力。

轮状病毒是一种rna病毒，我们利用临床样本提取的rna直接进行cfpa检测，其特异性和敏感度仍保持在100％(分别参见图4中的a和图4中的b)，最低检出限达到10copies/reaction(参见图4中的c)，且tt值与样本浓度的对数值(logc)间呈良好的线性关系(参见图4中的d)。

3.3分别选取高(10⁷copies/μl)、中(10⁴copies/μl)、低(10¹copies/μl)三个浓度的轮状病毒质粒样本，重复测量八次，结果显示了cfpa方法良好的稳定性(参见图4中的e)，针对这三个浓度的重复测量，结果c.v.值均小于0.1(参见图4中的f)。

说明了cfpa方法可以同时对dna和rna样本进行检测，具有广阔的应用前景。

实施例4cfpa方法在临床中的应用

最后通过大规模的临床实验，证实cfpa和金标准pcr方法具有可比性。共纳入174例样本，其中轮状病毒感染样本96例，非轮状病毒感染样本78例，与pcr相比，cfpa的灵敏度为96.88％，特异度为100％(参见图5中的a)。

利用graphpadprism7统计学分析软件进行roc曲线分析表明，cfpa方法和金标准pcr方法曲线下的面积分别为0.984和1(z＝1.751；p>0.05)，由此可见，两种方法的诊断效能无统计学差异(分别参见图5中的b和c)。

另外，经验证，在cfpa扩增体系中加入以下多种内源性及外源性干扰物包括：氢化可的松丁酸盐(hyd)；醋酸地塞米松(dex)；醋酸泼尼松龙(pre)；利巴韦林(rib)；阿昔洛韦(acy)；复合酸杆菌(cab)及血红蛋白(hb)，在检测三个不同轮状病毒感染样本时，发现它们对cfpa的干扰有限(参见图5中的d)，不会显著抑制cfpa的进行，保证了该方法在临床复杂样本检测应用中的可靠性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海速创诊断产品有限公司

上海速芯生物科技有限公司

<120>环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用

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