本发明属于水产动物抗病育种领域，具体涉及一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用。
背景技术：
对虾养殖在我国水产养殖中占有重要的地位，高峰时每年的对虾产量达160万吨，其中占主导地位的是凡纳滨对虾(南美白对虾)。该品种原产于中南美洲，于上世纪80年代引入我国，经过近30年的发展，已经成为我国乃至世界最重要的对虾养殖品种。然而，近年来，由于病害问题导致产量大规模减少，其中重要的一种疾病是急性肝胰腺坏死综合症，报道显示该疾病的主要致病原为副溶血弧菌。
针对急性肝胰腺坏死综合症目前缺乏有效的应对措施，尽管通过环境调控可以达到一定的防控效果，但是对于基础设施的投入较大，成本较高且效果并不十分理想。通过遗传选育对品种进行改良，培育抗弧菌的新品种是控制弧菌病害的一种有效且根本的方法。然而对于抗性性状，通过传统选育方式选育准确率低、效果差，随着分子标记技术的发展，越来越多的与抗性相关的分子标记被发掘，利用分子标记或者抗性基因进行抗性品种的标记或者基因辅助选育具有选育准确率高、选育效果好、不受环境影响等优势。而鉴定抗弧菌相关基因和分子标记是进行抗性分子标记辅助选育的关键。
本发明旨在提供一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用，从而为对虾抗弧菌新品种的选育提供技术支持，为提高对虾养殖成活率，解决弧菌对产业带来的危害提供有力支撑。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用，为加快对虾抗弧菌品种的遗传选育提供新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用，具体包括，(1)提取对虾育种群体的候选个体基因组dna；(2)通过pcr扩增测序、snp芯片、snapshot等分型方法对seqidno.001-012所示的12个snp标记进行分型，获得每个标记的分型信息(3)选择保留上述snp标记优势等位基因位点纯合或优势等位基因位点较多的个体进行留种(4)根据留种个体上述12个snp标记的分型结果，开展分子标记辅助选配，进而实现12个标记优势等位基因聚合，显著提高对虾选育群体的抗弧菌性状。
序列表
(a)序列特征
长度：276核苷酸
类型：核苷酸
链型：单链
(b)分子类型：dna
表1，序列描述：
本发明公开了对虾抗弧菌相关的一组snp标记组合，包含12个抗性相关snp标记，其具有seqidno.1-12所示的序列，利用这些抗性snp标记，本发明公开了一种对虾抗弧菌分子标记辅助选育的方法，包括(1)提取凡纳滨对虾育种群体的候选个体基因组dna；(2)通过pcr扩增和一代测序等方法对12个snp标记进行snp分型；(3)选择保留上述snp标记优势等位基因位点纯合或优势等位基因位点较多的个体进行留种；(4)根据留种个体上述12个snp标记的分型结果，开展分子标记辅助选配，进而实现12个标记优势等位基因聚合，显著提高对虾选育群体的抗弧菌性状。该方法较传统选育准确率高，可显著加快遗传选育进展，对培育抗弧菌新品种，提高对虾养殖成活率具有重要的意义。
本发明所具有的优点：本发明所提供的抗弧菌分子标记辅助育种方法较传统选育具有多方面的优势，该方法不需要进行弧菌感染测试，选择的个体直接留种繁殖后代，较传统的家系测定方法准确率高，操作简单，利于育种企业和科研单位在实际生产中进行应用，加快抗性品种的培育进展。
具体实施方式
实施例1：对虾抗弧菌相关分子标记的获得
(1)对虾材料和弧菌感染测试
用于进行弧菌测试的材料为凡纳滨对虾“广泰1号”，取自于海南广顺泰普海洋育种有限公司，用于实验的材料在26±1℃的海水中充气暂养三天。用于弧菌感染的副溶血弧菌取自急性肝胰腺坏死症死亡的虾，副溶血弧菌在氯化钠质量浓度为2.0％的tsb培养基中扩培，之后使用pcr引物vppira-284f：tgactattctcacgattggactg和vppira-284r：cacgactagcgccattgtta检测piravp，并使用vppirb-392f：tgatgaagtgatgggtgctc和vppirb-392r：tgtaagcgccgtttaactca检测pirbvp的毒性质粒，每尾虾的注射剂量为2.5×104cfu/g。同时选择了两批材料作为重复，第一批材料包含236尾虾，第二批材料包含270尾虾，取60尾注射pbs作为对照组。所有的材料注射弧菌后记录死亡时间，死亡虾冻存在-80度冰箱保存。实验共计持续8天，在第8天还未死亡的虾收集起来作为抗性遗传材料，其中第一批材料最终存活了112只，第二批材料存活了37只。
(2)抗性和敏感材料的选择和dna提取
两个实验群体分别取最先死亡的60尾虾作为敏感组，第一批材料取最终存活材料中随机选择60尾作为抗性组，第二批材料选择最终存活的37尾和最晚死亡的23尾共计60尾作为抗性组，所有的材料使用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取凡纳滨对虾个体肌肉组织的dna，通过核酸浓度测定仪nanodrop1000测定dna浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。
(3)抗性和敏感遗传材料的dna混池构建
针对每个实验群体的材料，将敏感组的60尾虾分别构建两个dna混池，每个dna混池中30尾虾的dna等量混合。采用相同的策略对每个实验群体的抗性组构建2个dna混池，每个dna混池中30尾虾的dna等量混合。每个实验材料共构建2个敏感组dna混池和2个抗性组dna混池。
(4)混合dna高通量snp分型
混池样品的dna分型采用目标区域测序的方法进行，同时扩增508个在基因组上均匀分布的dna片段，之后对上述dna片段进行高通量测序和生物信息学分析，获得每个片段上的snp分型结果，同时，从获得的snp结果文件中提取每个snp位点不同等位基因的测序深度，根据两个等位基因的测序深度估计其等位基因频率。
(5)抗性相关分子标记组合的筛选
分析每个snp位点在抗性组和敏感组材料中的等位基因频率差异，并利用r软件(https://www.r-project.org/)进行卡方检验抗性组和敏感组中的等位基因频率的差异显著水平，取p<0.01作为显著差异阈值。同时分析两个实验材料的snp频率差异，筛选在两批实验材料中差异显著且抗性优势等位基因一致的位点作为抗性snp位点。
通过统计分析和基因注释，一共获得12个与对虾抗弧菌相关的snp标记，如表1所示；12个snp位点在第一批材料(-log10(p1))和第二批材料(-log10(p2))中均呈极显著水平(p<0.01)，如表2所示。
表212个抗性相关位点在第一批和第二批材料的抗性和敏感群体的等位基因频率差异分析
-log10(p1)：snp位点在第一批材料的抗性和敏感组的卡方检验p值取-log10；-log10(p2)：snp位点在第二批材料的抗性和敏感组的卡方检验p值取-log10；p1s1：第一批材料中敏感组1的参考等位基因频率；p1s2：第一批材料中敏感组2的参考等位基因频率；p2s1：第二批材料中敏感组1的参考等位基因频率；p2s2：第二批材料中敏感组2的参考等位基因频率；s-average：敏感组的平均等位基因频率；p1r1：第一批材料中抗性组1的参考等位基因频率；p1r2：第一批材料中抗性组2的参考等位基因频率；p2r1：第二批材料中抗性组1的参考等位基因频率；p2r2：第二批材料中抗性组2的参考等位基因频率；r-average：抗性组的平均等位基因频率。
实施例1：一种对虾抗弧菌分子标记组合在育种中的应用
(1)育种材料的dna提取
针对核心育种群的个体，对每尾个体剪取一条游泳足，并用眼柄环对个体进行标记，使用天根植物基因组dna提取试剂盒提取每个个体的dna，并检测dna浓度和质量。
(2)12个抗性snp位点的基因分型
利用snapshot方法对上述表1中的12个snp位点进行snp分型，获得12个位点的分型数据。
(3)育种群体的分子标记辅助选择
针对seqidno.001标记，选择含有a等位基因的个体，优选aa基因型个体留种；针对seqidno.002标记，选择含有c等位基因的个体，优选cc基因型个体留种；针对seqidno.003标记，选择含有t等位基因的个体，优选tt基因型个体留种；针对seqidno.004标记，选择含有a等位基因的个体，优选aa基因型个体留种；针对seqidno.005标记，选择含有a等位基因的个体，优选aa基因型个体留种；针对seqidno.006标记，选择含有g等位基因的个体，优选gg基因型个体留种；针对seqidno.007标记，选择含有c等位基因的个体，优选cc基因型个体留种；针对seqidno.008标记，选择含有a等位基因的个体，优选aa基因型个体留种；针对seqidno.009标记，选择含有t等位基因的个体，优选tt基因型个体留种；针对seqidno.010标记，选择含有g等位基因的个体，优选gg基因型个体留种；针对seqidno.011标记，选择含有g等位基因的个体，优选gg基因型个体留种；针对seqidno.012标记，选择含有a等位基因的个体，优选aa基因型个体留种；根据上述留种策略，优先选择优势等位基因纯合位点多的个体进行留种，若12个位点中某些位点无纯合个体，则保留杂合个体。
(4)留种群体的分子标记辅助选配
留种个体到下一年性成熟时，综合考虑其他性状的测定数据和育种值后，根据12个抗性标记的基因型数据进行标记辅助选配，选配策略如下：针对某一个位点，优选纯合优势等位基因型进行交配，例如001位点，优选aa型与aa型个体进行交配；针对多个位点，优先选择多个位点均为纯合的个体之间进行交配。
(5)基于抗性分子标记的聚合育种
从上述选配个体交配的后代中进一步通过12个抗性标记进行选择，获得纯合位点数目更多的选育群体，再通过1-2轮的标记辅助选配和选择，获得全部12个标记位点均为纯合的抗性个体，选择的个体对于副溶血弧菌的抗性能力得到显著提高。
该方法的优势是通过本发明提供的12个分子标记，可以不进行弧菌感染就可以个体选择，降低了育种企业的设施需求，利于抗弧菌选育工作的开展，另一方面，通过分子标记辅助选育和选配，能够在短时间内实现抗性优势位点的聚合，加速抗弧菌品种的培育进程。
虽然，上文已经通过具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用
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