一种进行篮式反应器内细胞消化的方法与流程

本发明是关于一种进行篮式反应器内细胞消化的方法，具体地说，是关于一种应用消化液进行片状载体vero细胞消化实现篮式反应器培养工艺的逐级放大的反应器细胞培养技术。

背景技术：

细胞培养工艺一直是疫苗生产中的重要环节，主要有传统的转瓶培养、细胞工厂培养和反应器细胞培养技术。

传统的转瓶培养法劳动强度大、占用场地多、单位体积提供细胞生长的表面积小、瓶间差异较难控制等，不适合大规模化生产。

细胞工厂是采用聚苯乙烯材料经特殊的表面处理后使细胞易于贴附生长，经焊接技术制作成多层，兼具密封性与牢固性，常规分为单层、双层、10层和40层的规格，单层培养面积约600cm²，而一个15l转瓶的培养面积约为1800cm²，即1个40层细胞工厂的培养面积相当于14个转瓶的培养面积，但相同培养面积下细胞工厂的占用空间却为转瓶的1/4，可有效节省空间，实现在有限空间内提高产能的目的。同时减少了人工操作的工作量，降低污染风险。但细胞工厂有一定局限性，其本身是塑料材质，处理工艺复杂且容易破裂，任何一层细胞工厂破裂导致染菌都会对该工厂其他层的细胞造成浪费；在细胞工厂的操作过程中会有数次开启盖子连接管路的时间，将细胞暴露于外界环境中，有染菌的危险；传代与培养不在同一空间中进行，需要转运细胞工厂多次，转运过程中增加了污染或磕碰的危险；操作上较繁琐，搬运40层细胞工厂时劳动强度大，耗时长，空间利用不充分。而且培养过程中只能通过显微镜观察顶层细胞的生长状态，很难进行工厂内每层细胞生长状态的质量控制，如对ph值、温度、溶氧等进行实时的调控，胰酶消化时时间控制不好会造成细胞损伤。此外，细胞工厂不能重复使用，一次性消耗品经济成本较高，不利于提高生产效益。

篮式反应器又称固定床生物反应器，通过固定床(内有填充材料，聚酯切片disc载体，简称片状载体)使培养基循环，细胞长在填充物的表面或内部。液体循环过程中流经床层，细胞被截留在载体中，其剪切力低，对细胞损伤小，通过分批或连续灌流的方式，可延长细胞培养的时间。篮式反应器与微载体反应器之间最本质的区别是支撑细胞贴壁生长的载体不同：微载体为葡聚糖实心球形，细胞仅能在表面生长，需依靠搅拌保持悬浮运动状态，而搅拌带来的剪切力会影响细胞的生长因此微载体反应器的转速不宜过高；而篮式反应器的片状载体由聚酯纤维和聚丙烯构成，聚酯纤维有利于细胞贴附生长；聚丙烯主要用于结构支架，使载体呈网状蜂窝结构，细胞可附着于载体表面和内部生长，内部结构有利于保护细胞免受剪切力的影响，在0～160rpm条件下，产生的剪切力对细胞几乎没有影响，细胞相对静止，且片状载体在培养液中悬浮性好很少发生粘连从而大大提高附着面积，适合于高密度细胞培养，进而收获更多的病毒，有效增加疫苗的产量，降低成本。然而，篮式反应器的独特设计带来诸多优势的同时，也带来了该类反应器不能直接取样观察细胞状态、细胞在线消化实现反应器规模放大的局限和技术瓶颈，特别是，片状载体是蜂窝状的高密度生长体，如采用传统消化方法，需持续40-50分钟，大部分细胞因过度消化而死亡，细胞团聚，无法实现逐级在线放大。对这些技术问题，业界多采用以细胞工厂直接提供细胞种子的途径来解决，如10台150l篮式反应器需要约300～400个40层细胞工厂，但这从厂房面积、操作人员、无菌工艺都不可能实现规模化生产，严重制约了该类型反应器在疫苗行业的广泛应用。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种进行篮式反应器细胞消化的方法，实现篮式反应器逐级在线放大。

为达上述目的，本发明提供了一种应用消化液进行篮式反应器细胞消化的技术，其中主要是应用消化液(胰蛋白酶消化液或triple消化液)消化在反应器中采用片状载体培养4～8天的vero细胞，后经细胞悬液转移接种继续培养。

具体地，本发明提供了一种进行篮式反应器内细胞消化的方法，该方法包括：

(1)将篮式反应器内细胞生长液排空，加入pbs溶液，控制温度36.5±1℃、ph7.2～7.4、do40％～70％，搅拌速度50～90rpm，浸泡5～15min，排出pbs溶液；

(2)加入消化液，控制温度36.5±1℃、ph7.2～7.4、do40％～70％，搅拌速度50～90rpm，消化10～30min，排出消化液；

(3)加入生长液，控制温度36.5±1℃、ph7.2～7.4、do40％～70％，搅拌速度100～200rpm，搅拌5～15min，进行细胞悬液收获。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，所述篮式反应器为基于片状载体与固定床相结合的篮式反应器。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，所述细胞为vero细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，步骤(1)中，监测篮式反应器内细胞生长液培养基葡萄糖代谢情况，待细胞葡萄糖消化速率达到峰值时，将篮式反应器内细胞生长液排空，加入pbs溶液进行浸泡。以vero细胞为例，通常情况下，在反应器中采用片状载体培养4～8天后，可采用本发明的方法进行消化。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，步骤(1)中，pbs溶液的浓度为0.01～0.03m，优选为0.02m，加入量为淹没片状载体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，所述消化液为胰蛋白酶消化液或triple消化液。更具体地，本发明使用的胰蛋白酶可商购获得，所述胰蛋白酶消化液为胰蛋白酶用0.01～0.03m优选0.02mpbs配制为质量体积比为0.1-0.5％的溶液。所述triple消化液可商购获得，例如可购自gibico公司，triple消化液的使用方式可参照厂家说明书进行。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，步骤(2)中，胰蛋白酶消化液或triple消化液的加入量为淹没片状载体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，步骤(2)中，待细胞密度大于2×10⁴～8×10⁴个/ml时，排出消化液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，步骤(3)中，待细胞数量为细胞接种数量的3～10倍时，进行细胞悬液收获。

根据本发明的具体实施方案，本发明的进行篮式反应器内细胞消化的方法中，每次排出篮式反应器内液体前，关闭篮式反应器温度、ph、do功能。

本发明中，所述细胞生长液为dmem生长液。

本发明的篮式生物反应器内片状载体上vero细胞消化放大的方法中，未详细提及的反应器的操作方法及其他工艺参数可以参照反应器的说明书确定。

综上所述，本发明探索出了篮式反应器细胞在线消化的基本方式，建立篮式生物反应器内片状载体上vero细胞在线消化放大技术，仅用1台40l篮式反应器提供2～3台150l篮式反应器所需的细胞种子，解决一直以来局限篮式反应器与片状载体不能逐级放大实现生产化、规模化工艺的难题，突破了大规模篮式反应器逐级放大的技术瓶颈，开创了篮式反应器“罐转罐”逐级放大的新模式，成功建立了细胞培养中逐级放大的篮式反应器核心技术，打破了疫苗生产规模及生产量的壁垒，为大规模篮式反应器在疫苗领域的广泛应用提供了可行性。

附图说明

图1：14l篮式反应器细胞葡萄糖代谢曲线。

图2：本发明的进行篮式反应器片状载体细胞消化的方法流程示意图。

图3：40l篮式反应器细胞葡萄糖代谢曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例及附图对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为按照现有技术的常规操作进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

各实施例中，所用pbs溶液的浓度为0.02m。所使用的胰蛋白酶与triple消化液均购自gibico公司，胰蛋白酶使用前用0.02mpbs配制为质量体积比为0.1％的溶液；triple消化液参照厂家说明书的建议使用浓度，用0.02mpbs8倍体积稀释后使用。

实施例一、14l篮式反应器vero细胞消化(胰酶)

将10层细胞工厂生长4-8天形成致密单层的vero细胞经过胰酶消化后的细胞悬液泵入14l篮式反应器继续培养，细胞接种总数为5.2×10⁹个。

每天定时进行14l篮式反应器内葡萄糖代谢检测，并绘制代谢曲线(图1)。待细胞葡萄糖消耗速率达到峰值，采用传统胰酶进行细胞消化，可参见图2所示流程，具体实施如下：

1、关闭篮式反应器温度、ph、do功能，打开反应器出液口，利用正压将反应器内细胞生长液排空。

2、将pbs装置出液端与反应器进料端连接，打开反应器进料口开关，用蠕动泵将0.02mpbs溶液加至10l标线处。关闭进料口开关，开启温度(37℃)、ph(7.3)、do(70％)功能，将搅拌速度设为50rpm，浸泡5min后，关闭温度、ph、do功能，打开反应器出液口，将pbs溶液全部排出。

3、将预热好的胰酶消化液出液端与反应器进料口连接，打开反应器进料口开关，用蠕动泵将胰酶加至10l标线处。同时开启温度(37℃)、ph(7.3)、do(70％)功能，将搅拌速度设为50rpm，25min后，罐内液体出现微浑浊，取样进行细胞计数，细胞密度大于5×10⁴个/ml，关闭温度、ph、do和搅拌功能，利用正压将胰酶全部排出。

4、将细胞生长液出液端与反应器进料口连接，打开反应器进料口开关，用蠕动泵将细胞生长液从进料口加至10l标线处。同时开启温度(37℃)、ph(7.3)、do(70％)和搅拌功能，将搅拌速度设为180rpm，搅拌15min，罐内浑浊，取样进行细胞计数，细胞总数为2×10¹⁰个/14l(相当于80个10层细胞工厂细胞总数)且细胞活率为90％以上，进行细胞悬液收获。

5、按照1：6的传代比例接种至40l篮式反应器继续培养4-8天，并监测细胞葡萄糖代谢水平并绘制代谢曲线(图3)。通过14l和40l篮式反应器细胞阶段的葡萄糖代谢曲线对比可以看出，经过消化后转种的细胞代谢正常。

实施例二、40l篮式反应器vero细胞消化(triple)

定时检测40l篮式反应器内培养基葡萄糖代谢情况，待细胞葡萄糖消化速率达到峰值，采用triple消化液进行细胞消化，可参见图2所示流程，具体实施如下：

1、关闭篮式反应器温度、ph、do功能，打开反应器罐底阀，利用罐内正压将将反应器内细胞生长液从罐底排空。

2、将pbs溶液装置出液端与反应器进料端连接，打开反应器进料口阀门，用蠕动泵将pbs溶液加至罐体视窗标线处(30l)，开启温度(37℃)、ph(7.35)、do(70％)功能，将搅拌速度设为50rpm，浸泡10min后，关闭温度、ph、do功能，打开反应器罐底阀，将pbs溶液全部排出。

3、将现配的triple消化液出液端与反应器进料口连接，打开反应器进料口阀门，用蠕动泵将消化液从进料口泵入，加至罐体视窗标线处(30l)。关闭进料口阀门，开启温度(37℃)、ph(7.35)、do(70％)功能，将搅拌速度设为50rpm，15min后，罐内液体出现微浑浊，取样进行细胞计数，细胞密度大于8×10⁴个/ml，关闭温度、ph、do和搅拌功能，将triple消化液全部排出。

4、将细胞生长液出液端与反应器进料口连接，打开反应器进料口阀门，用蠕动泵将消化液从进料口泵入，加至罐体视窗标线处(30l)。关闭进料口阀门，开启温度(37℃)、ph(7.35)、do(70％)和搅拌功能，将搅拌速度设为200rpm，搅拌10min，罐内浑浊，取样进行细胞计数，细胞总数为6×10¹⁰个/40l，细胞总数相当于200个10层细胞工厂；且通过镜下观察，细胞结构没有受到破坏，细胞活率在90％以上，遂进行细胞悬液收获。

该实验技术重复了多次，其细胞扩增倍数均达到3-10倍且细胞生长状态良好，这也为篮式反应器在位规模放大以及工艺的连续性奠定了基础。

本发明通过对细胞在线消化过程的控制参数(温度、ph值、溶氧、转速、时间)的分析摸索，揭示了片状载体细胞消化的机制，提出了基于片状载体细胞在线消化模式来理性设计篮式反应器的科学思想，找到了适合片状载体篮式反应器大量种子细胞供应的途径，突破了以细胞工厂作为细胞种子来源的传统思维，据此开创了篮式反应器“罐转罐”逐级放大的新模式。仅用1台40l篮式反应器即可提供2-3台150l篮式反应器所需的细胞种子，相当于200个10层细胞工厂的产出，减少了人力资源和厂房面积的浪费，减少了敞口暴露污染和交叉污染，细胞质量更均一。该技术的攻克扭转了历来只能够通过增加反应器数量的方式来实现产品的规模放大，解决了大规模篮式生物反应器生产时无法提供大量细胞种子的技术难关，属国内外首创，为大规模篮式反应器在疫苗领域的广泛应用提供了可行性。

对比例一、微载体消化

本对比例中，种子细胞供应方式为采用微载体消化接种到篮式反应器。应用胰酶进行微载体细胞消化首先需待微载体细胞充分沉降后，排出培养液上清。加入pbs溶液，洗涤微载体细胞。漂洗后，加入预热好的胰酶消化微载体细胞。消化期间，取样观察，待80％细胞脱离微载体时，加入细胞培养液终止消化。同时打开搅拌，5min后停止搅拌，通过纳米网和沉降装置进行vero细胞悬液收集(通过纳米网和沉降装置进行vero细胞悬液收集参照文献“vero细胞微载体放大培养技术研究[j].”(毕军，王强，孙文.中国医药生物技术,2016,3:275–277)进行)。

在应用胰酶进行微载体在线消化细胞过程中，胰酶需充分浸泡微载体，胰酶消化作用时间较长，易造成部分细胞表面结构受损。且微载体为实心球形，细胞仅能表面生长，而微载体消化需进行高转速搅拌，剪切力较大，影响细胞活率和细胞的重新贴附。150l篮式反应器相当于传统微载体反应器500-1000l的规模。因此微载体反应器大规模培养模式，还存在着劳动强度高，污染风险大的弊端。