一种抗氧化活性酵母菌的制备方法及其产品和应用与流程

本发明涉及一种抗氧化活性酵母菌的制备方法，还涉及由该方法制备得到的抗氧化活性酵母菌，该抗氧化活性酵母菌主要可作为添加剂应用在保健品和功能性食品中。本发明属于微生物技术领域。

背景技术：

微量元素是人体内许多酶、激素和维生素等的组成成分，有着非常重要的生理功能。它在体内一旦缺乏或比例失衡，就会引起各种生理、生化的改变，出现某种症状或疾病，许多研究显示微量元素与人的发育、成长、体力、智力、长寿、防病、美容等都有关系。

其中，硒、锌、锗是人体的必需微量元素，参与机体内多种生化代谢，具有抗肿瘤的作用，对人体的生理功能产生直接影响。硒(se)能加速体内过氧化物或自由基的分解，致使肿瘤细胞得不到分子氧的充分供应，起到抑制肿瘤细胞生长的作用，防止不饱和脂肪酸的氧化，增强免疫力，科学界将其誉为人体微量元素中的“抗癌之王”。缺硒会引起机体的重要器官功能失调，导致多种疾病发生，如心脑血管疾病、高血压综合症、胃肠道疾病、肝病等。锌(zn)是构成人体多种蛋白质所必需的元素，能维持细胞膜的稳定性并参与许多酶的代谢，它对免疫功能具有营养和调节作用。缺锌则酶的活性下降，可以引起一系列的生化紊乱，致使很多器官和组织的生理功能异常，生长发育、免疫过程、细胞分裂、智力的发育、药物在体内的作用均受到干扰。锗(ge)在人体中有很强的脱氢能力，能诱发自身干扰素产生、增加nk细胞活性、活化巨噬细胞、防止细胞衰老、增强人体免疫力，具有抗肿瘤、抗炎症、抗病毒等生理作用。有机锗是一种广谱抗癌药，治疗转移性肺癌、肝癌、恶性淋巴癌、生殖系统癌和白血病都有效，因此，有机锗被誉为“人类健康的保护神”。金属硫蛋白(metallothionein，mt)是迄今为止发现清除自由基能力最强的蛋白质，比公认的超氧化物歧化酶(sod)强一万倍，能解除重金属中毒，参与微量元素贮存、运输和代谢，拮抗电离辐射，可用于防治肿瘤、心血管疾病、糖尿病、艾滋病、放射性损伤及延缓衰老等。

随着科学技术的发展，人民保健意识逐步增强。无机微量元素毒性大，吸收率低，有机微量元素吸收迅速且安全。酵母菌微量元素是酵母菌和微量元素的有机结合，有机态的微量元素被机体吸收迅速，通过酵母菌在生长过程中对各元素的自主吸收和转化，对消化道的刺激少。其富含的促消化酶可以激活人体消化系统，从而大大提高了各元素的人体吸收利用率。它除了本身具备微量元素的各项功效外，更增添了酵母菌的效用和营养(助消化、富含蛋白质、多种维生素与矿物质)，且富含多种生物活性物质。

目前，用酵母菌富集微量元素的研究主要集中在富集单一的微量元素上，根据查阅的文献可知，郭雪娜等研制的富锌酵母菌株zgh-374具有较高的富锌能力以及抗锌能力，zgh-374细胞的锌含量可达9mg/g，并可耐受锌的浓度达到400mg/ml。尚若锋等采用生物发酵技术研制富铜酵母菌，试验确定：28℃是酵母菌生长的最佳生长温度，而铜离子浓度同样显著影响酵母菌的生长，其浓度与酵母菌生长负相关，即低浓度可促进酵母菌生长，而高浓度则起抑制作用。目前在国内外报道均有对富硒酵母菌的报导，含量最高达1400μg/g，李明春、张丽等所研制的富硒酵母菌菌株含硒量是800μg/g；王凤琴实验得到的富硒菌株硒含量则仅为604.5μg/g；宋照军等对耐硒的嗜热链球菌株进行梯度浓度的驯化，得到了高富硒的菌种；范秀英、郭雪娜等用化学诱变和细胞融合方法获得了具有高富硒能力的酵母菌zff-28，富硒总含量达到了16810μg/l，是培养条件优化前的1.3倍。白雪丽等通过正交试验得出生产富锗酵母菌的最佳工艺条件，即在麦芽汁培养基中添加3％玉米浆、100mg/kggeo2、糖度10°bx、发酵时间为24h，锗含量达978.4μg/g。国外对硒酵母菌的研究较多，上个世纪末，亚洲等国家已经有富硒酵母菌产品出现在市场上，其中硒含量已超过其它富硒产品，在北美洲、欧洲等国家的商场上也有类似的硒酵母菌产品出售。在国外，对于硒酵母菌的生产方法有所不同，alidemirci等人通过连续发酵的方法生产有机硒酵母菌，其硒含量已经达到1200～1400μg/g。由于生产技术的进步，培养条件的革新，菌种富集能力的提高，含硒量已达到5000μg/g。酵母菌不仅可以富集锌、硒等微量元素，铁酵母菌、铬酵母菌也已被研制出来，此类食品可增强人类膳食营养，增强体质。

随着环境污染加剧，癌症发病率逐年上升。人均寿命的增加，导致人口老龄化问题日趋严重。因此，研制抗癌、抗衰老制品将有广阔的市场前景，产生广泛的社会效益与经济效益。培养生物活性酵母菌，无毒无害，且酵母菌繁殖快、培养设备简单、费用低、易于推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于运用微生物培养技术，以具有富集作用的球拟酵母菌为生物载体，培养同时富含硒、锌、锗、金属硫蛋白的复合酵母菌，通过将无机微量元素转化为有机微量元素，提高微量元素的人体吸收利用率，并降低毒性，该产品可应用于制备具有抗癌、抗衰老的医药或食品等领域。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过逐步提高培养液中添加微量元素浓度的方法选择驯化液驯化酵母菌；运用正交试验筛选富集微量元素能力较强的酵母菌菌株，并确定最佳培养条件；用电感耦合等离子体质谱法检测元素含量；用分光光度法检测金属硫蛋白中的巯基；按国家《食品安全性毒理学评价程序和方法》(gb15193.3-2003)对抗氧化活性酵母菌进行毒理学安全性评价。具体的，包括以下技术手段：

①酵母菌菌种的驯化：

采用逐步提高培养液中添加微量元素浓度的方法选择驯化液进行酵母菌驯化。

②酵母菌最佳培养条件的确定

运用l18(37)正交试验设计，选取温度、培养时间、接种量、加锌量、加硒量、加锗量、加铜量7个因素和3个水平，以湿重为检测指标，确定酵母菌最佳培养条件。

③抗氧化活性酵母菌的制备

确定酵母菌的最佳培养条件后，在该条件下进行培养。再经离心、水洗、50℃烘干、研磨，即制得干酵母菌粉。

④干酵母菌粉中元素含量的测定

将适量干酵母菌粉置于消化罐中，微波消解，用icp-mp检测各种元素含量。

⑤干酵母菌粉中金属硫蛋白含量的测定

用分光光度法检测金属硫蛋白中巯基的含量。

⑥抗氧化活性酵母菌的毒理学安全性评价

按国家《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行实验。

试验证明，本发明所研制的抗氧化活性酵母菌将具有抗癌、抗衰老、提高免疫力作用的锌、硒及锗三种微量元素一起富集到酵母菌菌种中，无机元素被转化为有机元素，无毒无害，提高了生物利用率。在富集元素的同时通过金属诱导提高酵母菌中金属硫蛋白的含量，增加了产品抗氧化能力。与其它同类产品比较，此产品同时富集了锌、硒及锗三种微量元素和金属硫蛋白，功效成分增多，保健作用增强。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种抗氧化活性酵母菌的制备方法，所述的制备方法是以具有富集作用的球拟酵母菌(torulopsissp.)为生物载体，培养同时富含硒(se)、锌(zn)、锗(ge)、金属硫蛋白的复合酵母菌，将无机微量元素转化为有机微量元素，具体步骤如下：

1)酵母菌种的活化

取球拟酵母菌接种至灭菌的yepd液体培养基中，培养，获得活化菌种；

2)酵母菌种的驯化

向灭菌的筛选平板培养基中分别加入预先灭菌的硫酸锌、氯化铜、亚硒酸钠、二氧化锗溶液，取活化的球拟酵母菌种用划线法接种，培养，挑取生长状态良好的单菌落为驯化后的酵母菌种；

3)抗氧化活性酵母菌的培养

将选取的驯化后的酵母菌单菌落接种至灭菌的yepd液体培养基中，向培养基中添加锌元素至终浓度为550～650μg/ml、添加铜元素至终浓度为60～70μg/ml、添加硒元素至终浓度为20～30μg/ml、添加锗元素至终浓度为55～65μg/ml，培养后，获得所述的抗氧化活性酵母菌。

其中，优选的，所述方法还包括将培养获得的湿的球拟酵母菌经离心、蒸馏水反复洗涤3次，50℃下干燥、研磨，获得干酵母粉的步骤。

其中，优选的，所述方法步骤1)中所述的培养是在28℃培养箱中培养48h，获得活化菌种。

其中，优选的，所述方法步骤2)中向灭菌的筛选平板培养基中分别加入预先灭菌的硫酸锌、氯化铜、亚硒酸钠以及二氧化锗溶液，使得培养基中的zn浓度为200μg/ml、cu浓度为70μg/ml、se浓度为15μg/ml、ge浓度为40μg/ml。

其中，优选的，所述方法步骤3)中将选取的驯化后的菌种单菌落按照接种量为15％接种至灭菌的yepd液体培养基中，在30℃下培养72h，获得所述的抗氧化活性酵母菌。

进一步的，本发明还提出了按照以上任一项所述的制备方法制备得到的抗氧化活性酵母菌。

其中，优选的，所述的抗氧化活性酵母菌命名为204，分类命名为球拟酵母(torulopsissp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为cgmccno.17355，保藏时间为2019年3月18日。

其中，所述的抗氧化活性酵母菌204中含有的锌元素浓度为226.08±1.10μg/g,铜元素浓度为556.63±33.87μg/g，硒元素浓度为21.47±0.11μg/g，锗元素浓度为9.74±0.28μg/g，巯基含量为10.8±0.2μmol/g。

更进一步的，本发明还提出了所述的抗氧化活性酵母菌在制备具有抗癌、抗氧化、抗衰老的医药或食品中的应用。

附图说明

图1为本发明的抗氧化活性酵母菌制备方法的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1抗氧化活性酵母菌的制备

本发明的抗氧化活性酵母菌制备方法的流程图如图1所示。

1、酵母菌菌种的活化

用接种环取球拟酵母菌(torulopsissp.)接种至灭菌的yepd液体培养基中，放入28℃培养箱中培养48h，获得活化菌种。

2、酵母菌菌种的驯化

采用逐步提高培养液中添加微量元素浓度的方法选择驯化液进行酵母驯化。即向灭菌的筛选平板培养基中分别加入预先灭菌的硫酸锌、氯化铜、亚硒酸钠以及二氧化锗溶液，使得培养基中的zn浓度分别达到100、200、300μg/ml、cu浓度分别达到50、70、90μg/ml、se浓度分别达到5、15、25μg/ml、ge浓度分别达到20、40、60μg/ml，取活化的球拟酵母菌菌种用划线法接种，28℃培养48h。根据球拟酵母菌生长状态，最终确定的驯化液中含有的zn浓度为200μg/ml、cu浓度为70μg/ml、se浓度为15μg/ml、ge浓度为40μg/ml。将选取的灭菌后驯化液加入培养基中，取活化的球拟酵母菌菌种用划线法接种，28℃培养48h，挑取生长状态良好的单菌落为驯化后的菌种。

3.抗氧化活性酵母菌的培养

用l18(37)正交试验设计，以湿重为检测指标，确定球拟酵母菌的最佳培养条件：培养时间72h，接种量为15％，培养温度为30℃，添加锌元素浓度550～650μg/ml、添加铜元素浓度60～70μg/ml、添加硒元素浓度20～30μg/ml、添加锗元素浓度55～65μg/ml为最佳条件。

在最佳培养条件下培养球拟酵母菌菌，获得抗氧化活性酵母菌。

4、抗氧化活性干酵母菌的制备

将湿的球拟酵母菌经离心、蒸馏水反复洗涤3次，50℃烘干、研磨，即制得干酵母菌粉。

将上述筛选获得的抗氧化活性酵母菌命名为204(ta204)，分类命名为球拟酵母(torulopsissp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为cgmccno.17355，保藏时间为2019年3月18日。

5、干酵母菌粉(ta204)中各元素含量的测定

将适量干酵母菌粉置于消化罐中，加酸微波消解，用icp-mp检测元素含量，结果干酵母菌中含有多种元素，钠、镁、钾、钙等人体必需的常量元素含量较高，实验所富集的锌、铜、硒、锗四种元素在干酵母菌中含量比不添加微量元素培养的酵母菌中含量高，还含有人体必需元素铬、锰、铁、镍、砷、钼、锡，有害元素铍、镉、锑、铅的含量较低，不含有害元素汞，见表1。

表1酵母菌204中各种元素含量

6、干酵母菌粉(ta204)中金属硫蛋白含量的测定

将适量样品(经金属诱导的干酵母菌)和对照(未经金属诱导的干酵母菌)置于氯化钠溶液中，55℃自溶48h，离心取上清液。用半胱氨酸作为标准物质，在标准溶液和样品液中加入ellman试剂，用分光光度法检测溶液中金属硫蛋白的含量，结果未经金属诱导的干酵母菌巯基含量为0.0063±0.0001mmol/g，经金属诱导后干酵母菌巯基含量为10.8±0.2μmol/g，两组比较差异有显著性(p<0.01)。

7、抗氧化活性酵母菌的毒理学安全性评价

按国家《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行实验和评价。结果以最大灌胃容量和最大使用浓度的酵母菌ta204给小鼠灌胃后均未见明显中毒症状，观察14天亦无死亡。实验结束后将受试动物处死进行大体解剖检查，未见肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器有明显异常改变。受试物对小鼠最大耐受剂量(mtd)大于15.3g/kg·bw，根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》(gb15193.3-2003)中的急性毒性分级标准，受试物属实际无毒级。

用同时筛选得到的ta97、ta98、ta100、ta102四株菌株进行试验，结果样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量—反应关系，试验结果为阴性。

样品各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无显著性(p>0.05)，而环磷酰胺组与阴性对照组比较差异有显著性(p<0.01)，试验结果为阴性。

以上试验证明，本发明所研制的抗氧化活性酵母菌将具有抗癌、抗衰老、提高免疫力作用的锌、硒及锗三种微量元素一起富集到酵母菌菌种中，无机元素被转化为有机元素，无毒无害，提高了生物利用率。在富集元素的同时通过金属诱导提高酵母菌中金属硫蛋白的含量，增加了产品抗氧化能力。与其它同类产品比较，此产品同时富集了锌、硒及锗三种微量元素和金属硫蛋白，功效成分增多，保健作用增强。