用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的引物对和探针及其应用。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒(hiv-1),属于逆转录病毒慢性病毒，是艾滋病的病原体。艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(aids),是一种由人类免疫缺陷病毒引起的，以全身免疫系统严重损伤为特征的传染性人体免疫系统疾病。临床表现为不常见的感染、恶性肿瘤以及不明原因的免疫缺陷综合症。

hiv-1的病毒结构、生活周期及复制过程：

hiv-1是rna逆转录病毒，它的生活周期类似于rna肿瘤病毒。病毒颗粒外包被磷脂双分子层包膜，内有圆柱状核心蛋白，有rna逆转录酶、整合酶和结构蛋白等组成。有三个蛋白基因：gag基因编码核心蛋白、pol基因编码逆转录酶与整合酶、env基因编码包膜蛋白；6个非结构蛋白基因。hiv-1病毒颗粒从亲代到子代的复制过程，构成了它的生活周期，包括了病毒的衣服、侵入和脱壳、反转录、整合、病毒rna和蛋白质的合成、装配、释放和成熟等阶段。首先hiv-1通过与宿主细胞上的受体结合，与宿主细胞膜融合后侵入靶细胞。一旦hiv-1外壳和靶细胞质膜相融合，病毒的核心蛋白就进入细胞。在hiv-1的核心蛋白中包埋着rna基因组合逆转录酶。病毒的rna基因组复制需要经过dna中间产物，后在逆转录酶的作用下将病毒rna基因组转变成双链dna，再整合进入宿主细胞的染色体中，最后以原病毒的形式成为宿主基因组的永久成分，并在宿主细胞分裂时随宿主dna的复制而复制。

科学家发现了的hiv-1的治疗药物司他夫定(d4t)和齐多夫定(azt)是目前常用的两种hiv-1核苷酸逆转录酶抑制剂(nrtis),但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。过去的研究一证明可引起d4t和azt耐药产生的突变是pol结构基因m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m六中突变。

目前应用于检测hiv-1耐药突变的方法主要是pcr产物直接测序法。然而该方法却存在着检测周期长、灵敏度低、非闭管操作、易造成交叉污染、杂合突变等等缺陷，使得很难适应于临床检测。因此，开发出一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的hiv-1耐药突变检测方法是对临床检测hiv-1耐药检测具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的引物对和探针，还提供了一种包括上述引物对和探针的检测试剂盒以及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，如下：

本发明提供了一种艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的引物对和探针，包括检测hiv-1病毒rna的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m的arms引物和taqman探针。

m41l的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.1和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

d67n的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.2和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

k70r的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

l210w的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.6和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

t215y的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.7和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

q151m的aarms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.8和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

本发明还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点中的试剂盒，包括权利要求上述arms引物对和探针。

优选地，所述试剂盒还包括rt-pcr混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对照品混合液；所述rt-pcr混合液包括：rt-pcr缓冲液、dntps、mgcl2、6对上下游引物及2条探针；所述混合酶液包括：m-mlv逆转录酶和tapdna聚合酶。

更优选地，所述试剂盒中各组分含量分别为：

更优选地，所述试剂盒中：

rt-pcr混合液包括

rt-pcr缓冲液(20mmtris-hcl,50mmkclph8.3)终浓度1×；

dntps终浓度2mm；

mgcl2终浓度2mm；

arms引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为200nm；

各arms上下游引物以及试剂盒质控品上下游引物所对应的taqman探针终浓度为175nm；

mlv逆转录酶终浓度1.6u/μl；taqdna聚合酶终浓度0.05u/μl；

阳性对照混合液中模板cdna终浓度0.1～10ng/μl；

本发明还提供了上述试剂盒在检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点中的应用，包括以下步骤:

总rna提取：提取待测样本的rna，提到模板rna溶液；

反应组分配制：分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物；其中，检测混合物按pcr混合液14ul、混合酶液2.5ul、引物探针3.5ul、模板rna溶液5ul配制一人份；阳性对照品混合物按pcr混合液14ul、混合酶液2.5ul、引物探针3.5ul、阳性对照品混合液5ul配制一人份；阴性对照品混合物按pcr混合液17.5ul、混合酶液2.5ul、引物探针3.5ul、阴性对照品混合液5ul配制一人份；

扩增：分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物放入荧光定量pcr仪扩增，反应条件为42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果判定：根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值判定结果：当阳性质控品和阳性对照品的ct值小于等于35，或者检测混合物为阳性时，试剂盒有效；当阳性质控品或阳性对照品的ct值大于35，或者检测混合物无ct值时，试剂盒无效或需重复检测。

其中，根据检测混合物的ct值定性判定，依据为：ct＞40时，待测样本中无hiv-1治疗药物d4t和azt耐药突变；35≤ct≤40时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如ct＞40或无扩增曲线，则为待测样本中无hiv-1治疗药物d4t和azt耐药突变，反之则为待测样本中有hiv-1治疗药物d4t和azt耐药突变；ct﹤35时，待测样本中有hiv-1治疗药物d4t和azt耐药突变产生。

所述的检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的方法是：rt-arms-taqmanqpcr，该技术基于rt-real-timepcr平台，结合arms突变富集技术。利用arms引物对突变靶序列进行特异性pcr扩增，taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在real-timepcr基础上鉴定特定突变。

有益效果：本发明公开的基于rt-arms-taqmanqpcr技术检测hiv-1耐药突变的方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、成本低等优点。设计的arms引物只针对基因突变序列，能特异性扩增突变模板rna，在arms引物的3’向5’端1-2位设计两个错配碱基，可以增加arms引物的特异性，本发明设计的taqman探针针对目的基因正义连的突变位点设计，特异地结合突变模板rna，设计的arms引物只针对基因特异突变序列，能特异性扩增突变模板rna，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测灵敏度，本发明公开的方法检测基因突变灵敏度可以达到1％(即目的基因的突变基因rna模板数占野生型rna模板数的1％)，而直接测序法检测基因突变的灵敏度为10％(即目的基因的突变基因rna模板数占野生型rna模板数的10％)，检测过程为闭管反应，减少污染的可能性，操作简单快速，整个pcr反应过程只有80分钟，结果判读明确客观，只需根据pcr仪器上的数据即可完成对样本基因类型的判读，同时本发明还具有安全性高，整个体系不包含有毒有害物质，无需pcr产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

附图说明

图1为不同mgcl2浓度rt-arms-taqmanqpcr检测结果图(1.5、2.0、2.5、3.0和3.5分别表示mgcl2浓度1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm与3.5mm)。

图2为不同dntps浓度rt-arms-taqmanqpcr检测结果图(0.6、0.8、1.0和1.2分别表示0.6mm、0.8mm、1.0mm与1.2mm)。

图3为不同rt-pcr缓冲液浓度rt-arms-taqmanqpcr检测结果图(0.5×、1.0×、1.5×、2×分别为0.5倍、1倍、1.5倍与2倍)。

图4为不同探针浓度rt-arms-taqmanqpcr检测结果图(100、175、250、325、400、475分别表示100nm、175nm、250nm、325nm、400nm与475nm)。

图5为以含有m41l点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图6为以含有d67n点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图7为以含有k70r点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图8为以含有l210w点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图9为以含有t215y点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图10为以含有q151m点突变的合成突变型polrt基因为模板，用不同稀释比例进行pcr进行扩增，检测d4t和azt主要耐药突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m突变型的rt-arms-taqmanqpcr检测结果图。

图11为以阳性对照品为模板进行扩增得到的qpcr检测结果图。

图12为以阳性质控品为模板进行扩增得到的qpcr检测结果图。

图13为以阴性对照品为模板进行扩增得到的qpcr检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

本发明使用的试剂及其来源：人工合成的引物探针核苷酸序列及人工合成的hiv-1病毒rna序列由上海基康生物技术有限公司负责合成；rt-pcr缓冲液、dntps、m-mlv逆转录酶、taqdna聚合酶终浓度、mgcl2等试剂均是从宝生物工程(大连)有限公司采购获得。

实施例1

用于检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的试剂盒，包括：

1、rt-pcr混合液700μl

rt-pcr混合液包括

rt-pcr缓冲液(20mmtris-hcl,50mmkclph8.3)终浓度1×

dntps终浓度2mm；

mgcl2终浓度2mm；

arms引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为200nm；各arms上下游引物以及试剂盒质控品上下游引物所对应的taqman探针终浓度为175nm；

具体而言，所述rt-pcr混合液中包含：引物序列seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9其各自浓度分别为0.2,0.4,0.2,0.2,0.4,0.4,0.2,0.2mmol/μl，taqman探针序列为seqidno.5和seqidno.10，终浓度分别为0.2,0.2mmol/μl。

seqidno：1

f1(m41l)：5’-gcattagtagaaatttgtacagtct-3’(tm53.3,length25)

seqidno：2

f4(d67n):5’-cagtatttgccataaagaaattta-3’(tm54.8,length24)

seqidno：3

f7(k70r):5’-cataaagaaaaaagacagtacatg-3’(tm53,length24)

seqidno：4

r1:5’-ctaggtatggtaaatgcagtatac-3’(tm52.1,length24)

seqidno：5

a1:fam-5’-ctgaagtcttcatctaagggaactgaa-3’-bhq(tm62.4,length27)

seqidno：6

f16(l210w)：5’-gagctgagacaacatctacg-3’(tm53.3,length20)

seqidno：7

f17(t215y)：5’-ctgttgaggtggggacaata-3’(tm58.4,length20)

seqidno：8

f15(q151m)：5’-tatcagtacaatgtgcttcgtat-3’

seqidno：9

r2:5’-tactgtccatttatcaggatg-3’(tm52.7,length21)

seqidno：10

a2:fam-5’-cataacccatccaaaggaatgg-3’-bhq(tm62.4,length22)

其中，用于检测艾滋病治疗治疗药物d4t和azt耐药突变位点的引物对和探针，包括检测hiv-1病毒rna的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点m41l、d67n、k70r、l210w、t215y和q151m的arms引物和taqman探针。

m41l的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.1和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

d67n的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.2和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

k70r的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.5所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

l210w的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.6和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

t215y的arms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.7和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

q151m的aarms引物对的上游引物和下游引物分别为seqidno.8和seqidno.9所示的核苷酸序列，taqman探针为seqidno.10所示的核苷酸序列，分别用fam和bhq1标记5’端和3’端；

2、混合酶液

m-mlv逆转录酶终浓度1.6u/μl；

taqdna聚合酶终浓度0.05u/μl；

3、阳性对照100μl

4、阳性质控品40μl

阳性对照混合液中模板cdna终浓度为0.1～10ng/μl

所述阳性对照品混合物是六种阳性对照品的混合物，包括阳性对照品溶液1，通过人工合成的方法将m41l点突变引入hiv-1polrt基因而得到；阳性对照品溶液2，通过人工合成的方法将d67n点突变引入hiv-1polrt基因而得到；阳性对照品溶液3，通过人工合成的方法将k70r点突变hiv-1polrt基因而得到；阳性对照品溶液4，通过人工合成的方法将l210w点突变hiv-1polrt基因而得到；阳性对照品溶液5，通过人工合成的方法将t215y点突变hiv-1polrt基因而得到；阳性对照品溶液6，通过人工合成的方法将q151m点突变hiv-1polrt基因而得到；其制备方法，具体如下：

hiv-1polrt基因cdna序列如seqidno.11所示。

通过人工合成的方法将m41l点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品1。将合成的含m41l点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品1克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品1。

通过人工合成的方法将d67n点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品2。将合成的含d67n点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品2克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品2。

通过人工合成的方法将k70r点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品3。将合成的含k70r点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品3克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品3。

通过人工合成的方法将l210w点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品4。将合成的含l210w点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品4克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品4。

通过人工合成的方法将t215y点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品5。将合成的含t215y点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品5克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品5。

通过人工合成的方法将q151m点突变引入到hiv-1polrt基因，得到突变型阳性对照品6。将合成的含q151m点突变的hiv-1polrt突变型阳性对照品6克隆到pgm-t载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化dh5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品6。

将制得的阳性对照品1、阳性对照品2、阳性对照品3、阳性对照品4、阳性对照品5和阳性对照品6各稀释至1％浓度，混合均匀成阳性对照品混合液，备用。

5、阴性对照混合液100μl

所述阴性对照混合液是提取的健康人体基因组dna。

实验例2

以试剂盒质控品的引物探针seqidno.5、seqidno.10、作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行rt-arms-taqmanqpcr，pcr反应中mgcl2浓度分别为1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm与3.5mm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、0.8mmdntps、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果如图1所示，由图1可知，在mgcl2浓度为1.5mm～3.5mm范围内均有扩增曲线，当mgcl2浓度为2.0mm时其结果最佳。

实验例3

以试剂盒质控品的引物探针seqidno.5、seqidno.10、作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行rt-arms-taqmanqpcr，pcr反应中dntps浓度分别为0.6mm、0.8mm、1.0mm与1.2mm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、2mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果如图2所示，由图2可知，在dntps浓度为1.5mm～3.5mm范围内均有扩增曲线，当dntps浓度为0.8mm时其结果最佳。

实验例4

以试剂盒质控品的引物探针seqidno.5、seqidno.10、作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行rt-arms-taqmanqpcr，pcr反应中探针浓度分别为100nm、175nm、250nm、325nm、400nm与475nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、0.8mmdntps、2mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果如图3所示，由图3可知，在探针浓度为100nm～475nm范围内均有扩增曲线，当探针浓度为175nm时其结果最佳。

实验例5

以试剂盒质控品的引物探针seqidno.5、seqidno.10、作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行rt-arms-taqmanqpcr，pcr反应中引物浓度分别为100nm、200nm、300nm、400nm、500nm与600nm，其余成分浓度相同(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、0.8mmdntps、2mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、175nm探针、0.1～10ng/μl的阳性对照品)。pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果如图4所示，由图4可知，在探针浓度为100nm～600nm范围内均有扩增曲线，当探针浓度为200nm时其结果最佳。

实施例6

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对m41l的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对m41l的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图5所示，本发明公开的检测方法对m41l点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例7

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对d67n的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对d67n的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图6所示，本发明公开的检测方法对d67n点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例8

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对k70r的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对k70r的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图7所示，本发明公开的检测方法对k70r点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例9

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对l210w的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对l210w的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图8所示，本发明公开的检测方法对l210w点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例10

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对t215y的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对t215y的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图9所示，本发明公开的检测方法对t215y点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例11

对实施例1中艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒对q151m的检测灵敏度

按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl配制，引物探针3.5μl，将实施例1中阳性对照品1的1％、阳性对照品的0.01％、阳性对照品的0.0001％、阳性对照品的0.000001％进行稀释后作为模版进行pcr反应，每个稀释样本上样量为5ul，以确定本发明中检测试剂盒对q151m的检测灵敏度(在20μl体系中各组分的终浓度分别为1×rt-pcr缓冲液、3mmdntps、1.6mmmgcl2、1.65u/μl混合酶、200nm引物、175nmtaqman探针)，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图10所示，本发明公开的检测方法对q151m点突变的检测灵敏度可以达到0.000001％突变样本。

实施例12

利用实施例1的艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒检测。

rt-pcr反应液及混合酶液，按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl，引物探针3.5μl配制，对阳性对照品混合液进行pcr扩增，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图11所示，检测试剂盒中配备的阳性对照品的ct值均在35以下。

实施例13

利用实施例1的艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒检测。

rt-pcr反应液及混合酶液，按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl，引物探针3.5μl配制，对阳性对照质控品混合液进行pcr扩增，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图12所示，检测试剂盒中配备的阳性质控品的ct值均在35以下。

实施例14

利用实施例1的艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点rt-pcr检测试剂盒检测。

rt-pcr反应液及混合酶液，按每个样本rt-pcr反应液14μl，混合酶液2.5μl，引物探针3.5μl配制，对阴性性对照品混合液进行pcr扩增，pcr反应条件为：42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。

结果如图13所示，本发明公开的检测方法对正常人基因组不进行扩增。

序列表

<110>江苏发士达生物科技有限公司

<120>用于检测艾滋病治疗药物d4t和azt耐药突变位点的引物对和探针及其应用

<141>2019-04-30

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

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<211>25

<212>dna

<213>m41l的arms引物对的上游引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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<213>q151m的arms引物对的上游引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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<213>l210w、t215y和q151m的下游引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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<213>l210w、t215y和q151m的taqman探针(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>10

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<210>11

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<400>11

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