一种海洋真核微藻粒级结构分析方法及其应用与流程

本发明涉及一种海洋真核微藻粒级结构分析方法及其应用，属于海洋真核微藻分子鉴定技术领域。

背景技术：

微藻粒级结构国内外相关研究概况：微藻粒级结构对海洋生态系统生态功能影响较大，微藻的生态行为、新陈代谢、光合作用等生理特性均与其粒径大小有关，在海洋生态系统的生物泵和营养成分中扮演着重要角色，由于不同粒径微藻在生理功能、沉降速率和被摄食压力等方面的差异，微藻粒级结构能够强烈影响水生生态系统的食物网结构和碳循环途径[1]。由于微型(2～20μm)和微微型(0.22～2μm)微藻个体微小、形态学鉴定困难，一度研究较为迟缓。褐潮的暴发引起了各界对微微型微藻研究的高度关注[2]，高通量测序技术的发展极大地推动了微微型微藻的高效检测，进而加速了其对生态系统的影响研究[3]。然而，有关微藻粒级结构的研究方法目前尚有缺陷。

已有技术缺陷：

目前微藻粒级观测技术主要有叶绿素a分级法、电子粒度分析仪法、流式细胞术法、显微测量粒径分析法、分子鉴定法等，其中前三种可对微藻生物量进行粗略区分，无法获取各组分种类信息，显微测量粒径分析法虽然可通过镜检了解各种类信息，但无法鉴定微微型和部分微型微藻，分子鉴定法可定性研究微藻多样性，但定量较为困难。孙军[4]等指出当调查海域优势种为链状微藻群体时，传统的叶绿素a分级法、电子粒度分析仪法都会低估微型和微微型微藻的生物量，而高估>20μm小型微藻的贡献。因此目前常用的叶绿素a分级法由于大孔径膜高截留率严重低估了小粒径微藻的贡献。因此，亟需解决微藻粒级的精确研究方法。本发明采用高通量测序-分子鉴定分级技术解决了海洋微藻粒级结构精确分析方法。

[1]宁修仁.海洋微型和微微型浮游生物[j].东海海洋,1997,15(3):60–64.

[2]kong,f.z.,yu,r.c.,zhang,q.c.,yan,t.,&zhou,m.j.(2012).pigmentcharacterizationforthe2011bloominqinhuangdaoimplicatedbrowntideeventsinchina.chinesejournalofoceanologyandlimnology,30(3),361-370.

[3]王丽平,南炳旭,扈培龙.秦皇岛褐潮暴发敏感海域细菌种群特征[j].环境科学研究,2015,28(6):899-906.

[4]孙军,刘东艳,钟华,张利永.微藻粒级研究方法的比较[j].青岛海洋大学学报(自然科学版),2003(6):917-924.

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，利用高通量测序-分子鉴定分级技术建立海洋真核微藻粒级结构分析方法，为贝类饵料粒级结构研究提供了科学依据。

为了实现上述目的，本发明提供了一种海洋真核微藻粒级结构分析方法，包括以下步骤：

(1)采集微藻分子鉴定样品，采集表层海水样品经筛绢过滤，然后用微孔滤膜收集全部微藻，保存滤膜；(2)提取步骤(1)中分子鉴定样品滤膜上真核微藻宏基因组18srdna，检测18srdna浓度及纯度；(3)利用seqidno.1～2所述的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物，以步骤(2)提取的18srdna为模板，进行可变区v4的pcr扩增，对于pcr扩增产物，构建dna文库，对于构建的文库，使用hiseq2500pe250模式进行测序；(4)测序得到的原始数据经拼接、截取、过滤，得到otus(operationaltaxonomicunits)；(5)对步骤(4)得到的otus进行聚类和物种分类，对otus进行物种注释，检测步骤(1)中滤膜上总叶绿素a的浓度，通过公式计算某种微藻在滤膜上的叶绿素a浓度，进而统计不同粒级微藻的生物量比例，对微藻粒级结构进行精确分析，所述公式中dbi为某种微藻在滤膜上的叶绿素a浓度，μg/l，nbi为滤膜上总的叶绿素a浓度，μg/l，dc为某种微藻滤膜上的序列数，nc为滤膜上所有微藻的序列数。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中采用的筛绢的孔径为200μm。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中收集微藻分子鉴定样品时采用的滤膜孔径为小于等于0.22μm。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中最终得到的带有微藻分子鉴定样品的滤膜的保存方法为将滤膜置于无菌离心管中，放入-20℃或-80℃冰箱中。

本发明还提供了利用本发明所述的分析方法在分析海洋真核微藻粒级结构中的应用。

本发明所述otus(operationaltaxonomicunits)即为分类单位，在本发明中97％一致性的序列聚类成为otus，每个otus代表一个物种。

有益效果

本发明首次利用高通量测序-分子鉴定分级技术建立了海洋真核微藻粒级结构分析方法，可以对微藻粒级结构进行精确分析，为研究贝类饵料演替提供科学方法。通过对辽东湾微藻粒级结构两种分析方法的案例验证，证明利用高通量测序-分子鉴定分级技术可显著提高微藻粒级结构分析精确度，尤其对微微型微藻的组成测算误差最高降低了80％。

附图说明

图1为辽东湾采样站位示意图；

图2为辽东湾四季叶绿素a各粒级含量；

图3为高通量测序-分子鉴定分级法和叶绿素a分级法测算的微藻粒级组分差异。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

高通量测序-分子鉴定分级分析法，包括以下(1)～(6)的步骤：

(1)样品采集

采集微藻分子鉴定样品，采集表层海水1l，首先经200μm筛绢过滤去除大型浮游生物，然后用0.22μm微孔滤膜收集全部微藻，最后将滤膜转移至1.5ml无菌离心管中，置于-20℃或-80℃冷冻保存、运输。

(2)dna的提取

采用ctab法提取真核微藻宏基因组，将滤膜剪碎置于1.5ml离心管中，加入500μlctab裂解液(2％ctab；100mmol/ltris-cl，ph为8.0；1.4mmol/lnacl；10mmol/ledta)和1μlβ-巯基乙醇，5～10μl蛋白酶k，55℃裂解1～1.5h；短暂离心，取出液体置于新离心管中，用酚氯仿抽提2次后，取上清液，加入两倍体积预冷的无水乙醇，沉淀2～3h，保留沉淀，使用75％乙醇清洗沉淀，得到浮游生物基因组dna，利用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测dna浓度及纯度，合格后置于-20℃冰箱保存备用。

(3)18srdna可变区v4的pcr扩增

pcr进行扩增所使用的引物为：

18sf:5′-ccaacctggttgatcctgccagta-3′

18sr:5′-ccttgttaacgacttcaccttcctct-3′

pcr反应体系为50μl，包括pcrbuffer5μl、dntpmixture8μl、上下游引物(10μmol/l)各2μl、步骤(3)提取的模板dna2μl、taqdna聚合酶2.5u，加适量灭菌水。扩增反应均在pe9700型pcr仪(美国pe公司)上完成，反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共33个循环；72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，将检测合格的产物使用nebultra^tmdnalibraryprepkitforillumina(newenglandbiolabs)建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过qubit定量(thermoscientific)和文库检测，合格后，使用hiseq2500pe250模式进行上机测序。

(4)测序数据质量控制

通过illuminahiseq2500测序平台进行pe250模式测序，所得原始数据使用flash软件进行拼接，参照qiime软件质量控制流程，将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据。原始序列需经过拼接和质量过滤，为保障数据准确可靠，高质量数据需占到90％以上，为进一步分析物种组成多样性信息，使用uparse软件对所有样品的有效序列进行聚类分析，以97％的一致性将序列聚类成为otus种水平，剔除原生动物otus数后得到注释到种的微藻。

(5)数据分析

测序得到的原始数据使用flash软件进行拼接，参照qiime软件质量控制流程将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据。利用uparse(http://drive5.com/uparse/)对有效数据进行otus(operationaltaxonomicunits)聚类和物种分类，采用rdpclassifier方法与silva数据库(https://www.arb-silva.de/,version108)对otus代表序列进行物种注释。根据相关研究，不同粒径的微藻序列数比例更接近于生物量比例(raofu，2017)，通过序列数比测算某种微藻在不同孔径滤膜上的叶绿素a浓度，相关公式：

式中：dbi为某种微藻在某级孔径滤膜上的叶绿素a浓度，μg/l；nbi为某孔径滤膜上的叶绿素a浓度，μg/l；dc为某种微藻在某级孔径滤膜上的序列数；nc为某孔径滤膜上所有微藻的序列数。

物种生物量优势度(y)表示微藻群落中某一物种质量所占的优势程度：

式中，nx为第x种微藻种类的otus数，n为otus总数，fx为第x种微藻种类在各样品中出现的频率。

微藻叶绿素a分级法的步骤为：

(1)样品采集

采集微藻叶绿素a分级样品和分子鉴定样品。叶绿素a分级样品每个站位采集表层海水2l并快速转入干净的聚丙烯桶，加入2ml碱式碳酸镁悬浮液(碱式碳酸镁用蒸馏水配制成的饱和溶液)，样品首先经200μm筛绢预过滤，然后依次经20μm、3μm、0.22μm微孔滤膜分级收集叶绿素a样品，滤膜用锡纸封好立即放入-20℃冰箱中冷冻保存、运输。

(2)叶绿素a测定

叶绿素a的分析方法参考《海洋监测规范》(gb17378-2007)中的分光光度法，对滤膜上的微藻细胞用90％丙酮低温(4℃)、黑暗萃取18-24h。依次测定萃取液在750nm、664nm、647nm、630nm波长下的吸光度，按jeffrey-humphrey方程式计算叶绿素a的浓度。

实施例2

2014年在辽东湾海域网格化设置12个站位(如图1所示)，分别于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采用实施例1所述方法采集了微藻叶绿素a分级样品和高通量测序-分子鉴定样品进行微藻粒级结构分析。

1叶绿素a分级测定

采用实施例1中微藻叶绿素a分级法测定叶绿素a的方法测定，叶绿素a分级法结果显示，辽东湾微藻以微型(nano：3-20μm)为主，平均占51±7％，春、夏、秋、冬依次降低；小型微藻(micro：>20μm)次之，平均占31±3％，夏季最高，春、秋、冬差异不大；微微型微藻(pico：0.22-3μm)最低，平均占19±8％，春、夏、秋、冬依次升高，和微型微藻正好相反，见表1、图2(图2中*表示在p<0.05水平(双侧)上显著相关)。

表1辽东湾四季叶绿素a各粒级组分(％)

2分级滤膜微藻截留种类

由于叶绿素a分级测算存有误差，为了解微藻在不同孔径滤膜上的截留效率和种类，将1、3、10站位分别在20μm、3μm、0.22μm微孔滤膜上过滤收集的海藻以及仅在0.22μm微孔滤膜上过滤收集的微藻进行了分子鉴定，具体方法参照实施例1所示。统计仅在0.22μm滤膜上真核微藻发现，共甲藻目(syndiniales)otus数占微藻总otus数20％左右(春20±1％、夏19±1％、秋21±1％、冬20±1％)，均无法注释到种，由于共甲藻目主要为寄生性甲藻，一般不含有叶绿素a，而本研究主要利用叶绿素a代表各粒级的生物量，为减少误差，测算微藻优势度时将共甲藻目剔除。

分级测序结果发现，同一种微藻在不同孔径滤膜上均有检出，仅用0.22μm微孔滤膜上各站位不同粒级优势种分析发现(表2)，微拟球藻和细小微胞藻在整个真核微藻中生物量占绝对优势，由于其粒径较小，推测其数量优势度更高。

表2各粒级第一优势种及优势度

通过序列数比测算某种微藻在不同孔径滤膜上的叶绿素a浓度，进而测算主要微微型微藻在不同滤膜上的截留率，见表3。分析发现，微微型微藻在20μm和3μm滤膜上的截留率均较高，最高在20μm滤膜上截留86.2％，在3μm滤膜上截留99.5％。

表3主要微微型微藻滤膜截留率

3微藻粒级修正分析

为真实反映微藻粒级结构，需对各站位仅用0.22μm微孔滤膜上过滤收集的真核微藻进行dna信息测序比对注释，根据各粒径微藻生物量占比统计粒级结构。测序每个样品平均获得77297条原始序列，经过拼接和质量过滤，每个样品平均得到70604条序列，高质量数据占到91％以上，表明测得的数据准确可靠，每个样品平均获得378个otus，剔除原生动物otus数后，春、夏、秋、冬注释到种的微藻种类分别为150、187、183、195，各样品测序结果见表4。

表4有效序列数及otus数统计

为减少误差，测算微藻优势度时将共甲藻目(syndiniales)剔除，将某站位优势度超过1％的种类均作为整体优势种参与粒级生物量统计。参考相关文献([1]刘瑞玉.中国海洋生物名录[m].北京:科学出版社,2008:301-870.[2]xu,x.,yu,z.,cheng,f.,he,l.,cao,x.,&song,x.moleculardiversityandecologicalcharacteristicsoftheeukaryoticphytoplanktoncommunityinthecoastalwatersofthebohaisea,china[j].harmfulalgae,2017,61:13-22.[3]于杰.浮游生物多样性高效检测技术的建立及其在渤海褐潮研究中的应用[d].青岛:中国海洋大学,2014.[4]江雪娇.北黄海微微型浮游植物的丰度及微微型真核浮游生物分子多样性研究[d].青岛：中国海洋大学，2009.)将筛查出的优势种进行粒径分级(微微型pico<3μm、微型nano3～20μm、小型micro>20μm)，详见表5。

叶绿素a分级法与高通量测序-分子鉴定分级法测算粒级结构的误差分析见表6。分析发现，微微型微藻两种分析方法差异极显著，叶绿素a分级法在四季的误差均较高，最高达82±8％，最低也有37±20％，说明叶绿素a分级法会严重低估微微型微藻的组成。图3也显示出高通量测序-分子鉴定分级法测算出的微微型微藻组成明显高于叶绿素a分级法。

表6叶绿素a分级法测算粒级结构的误差分析(％)

**差异极显著(p<0.01),*差异显著(p<0.05)

表5微藻优势种粒级(不包含共甲藻目)

叶绿素a分级法与高通量测序-分子鉴定分级法测算的微藻粒级结构四季分布见表6。高通量测序-分子鉴定分级法测算的微微型微藻粒级组成明显高于叶绿素a分级法。修正结果显示，春季微微型微藻组成分布在9％～79％，平均46％；夏季微微型微藻组成分布在17％～82％，平均42％；秋季微微型微藻组成分布在34％～59％，平均49％；冬季微微型微藻组成分布在32％～56％，平均42％。

表6叶绿素a分级法与高通量测序-分子鉴定分级法测算的微藻粒级结构四季分布百分比(％)

海洋微藻是滤食性贝类的营养基础，但并非所有微藻都是贝类的饵料，2009年开始在渤海秦皇岛-绥中海域暴发的抑食金球藻(aureococcusanophagefferens)褐潮导致贝类养殖区出现大规模扇贝滞长和死亡现象，造成直接经济损失上亿元。滤食性贝类对食物颗粒的选择分为质量和数量选择型两种策略，质量选择型的贝类对任何浓度的饵料都有选择性，这种选择性和饵料的数量没有关系，只和饵料的质量(粒径大小、有机物多少)有关系，也就是说小粒径微藻不易被摄食。因此研究微藻粒级结构演变机制意义较大，然而粒级结构分析方法成为瓶颈。

本发明通过对分级滤膜上的微藻分子鉴定分析发现，同一种微藻在不同孔径滤膜上均有检出，可能由于过滤阻滞作用，大孔径滤膜孔径逐渐变小，小粒径微藻在大孔径滤膜上截留率增高，或某些链状、杆状等小粒径微藻也被截留在大孔径滤膜上；另一方面海水样品中不可避免地存在一些微藻游离dna或由于过滤挤压某些大粒径细胞通过了小孔径滤膜，或某些杆状等大粒径微藻短轴通过也偶然截留在小孔径滤膜上。同时也发现同一种类在不同滤膜上截留率不同，不同种类在同一滤膜上截留率也有所差异，可能与微藻群落结构组成有关。

高通量测序-分子鉴定分级法修正结果显示，辽东湾四季微微型微藻占有绝对优势(超过40％)，其次是微型微藻，两者叶绿素a对总叶绿素a的平均贡献率超过75％，相反，粒径较大的小型微藻总生物量贡献率始终最低，春、夏、秋、冬季分别为25％、24％、27％、17％。叶绿素a分级法测算结果为微型微藻的组成最高，微微型微藻的组成最低，测算误差最高超过了80％。

孙军对显微测量粒径分析、叶绿素a分级、电子粒度分析仪这3种微藻粒级结构研究方法进行了分析比较，发现使用叶绿素a分级法、电子粒度分析仪法会低估小粒径种类，20μm孔径的筛绢对微型微藻的截留率高达85.63％，显微测量粒径分析修正后<20μm的微藻(微微型+微型)组分占82.27％，与本研究的结果相符，但该研究利用的显微测量粒径分析只能区分<20μm和>20μm两个组分的微藻，无法细分微微型和微型微藻各自的组分。

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<110>辽宁省海洋水产科学研究院

<120>一种海洋真核微藻粒级结构分析方法及其应用

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