本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种藻类孢子释放方法。
背景技术：
随着社会飞速发展，海洋环境富营养化程度日趋严重。诸如绿潮等海洋灾害的爆发愈加频繁，规模亦越来越大。2009年，青岛沿岸地区爆发了世界上存在报道的最大规模的绿潮，给国家带来难以估量的生态及经济损失。随后10年，绿潮每每如约而至。经先前学者鉴定，绿潮原因种为浒苔(ulvaprolifera)。浒苔生活史为同形世代交替，产四鞭毛的孢子细胞，并以其附着发育作为整个生命周期的起点。孢子抗逆能力极强，往往形成孢子场，待条件适合后附着于附着基之上快速发育，从而成为下次绿潮爆发的潜在源头。因此，为达到从源头控制、缓解绿潮之目的，需深入了解浒苔孢子形成、释放及附着机理，其中又以附着机理为首要因素。
针对于孢子附着、发育方向的研究，需有效控制浒苔孢子释放至外界环境中。先驱学者针对孢子释放这一难点问题，设计了一系列经典释放方案，诸如碎片化法、干出法、激素法等。碎片化法指采用消毒设备将藻体进行机械打碎，挑取长度为1cm左右藻段，转移至1.5ml离心管中培养，诱导孢子囊形成，待孢子释放后收集孢子用以后续分析实验。
干出法是利用胁迫机理，通过不利环境条件刺激浒苔孢子释放。取洁净藻体，黑暗条件下避光干出10-12h，使藻体失水程度达到60％左右。干出处理后藻体进行快速复水，待藻体恢复水分后，置于烧杯内培养以诱导孢子产生。当藻体培养至呈现黄褐色时，收集培养水体，4℃低速离心富集孢子细胞以用于后续实验。激素法则是利用部分天然产物，如2,4-表油菜素内酯等，进行低浓度(0.1～0.2mg/l)暴露实验，待培养2-3天后收集培养水体，通过低速离心法分离、富集孢子细胞。
碎片化法以及干出法均可获得一定数量的浒苔孢子细胞。但在孢子释放率方面并不理想。大部分藻体直接白化死亡而不产生孢子释放。激素法在释放率方面效果尚佳，释放周期较其它方法短，但残留的激素难以除去，导致后续从事孢子细胞附着、发育方面相关研究时受到干扰。同时，孢子细胞的附着能力保留时间短，不同藻体的孢子释放时间亦难以同步，在收集孢子过程中的，为保证孢子不丧失活性以用于后续实验，孢子暂存方案成为一个技术难点。
技术实现要素：
本发明正对现有技术中存在的不足，提供了一种藻类孢子释放方法，可有效提高藻体孢子释放成功率。
一种藻类孢子释放方法，包括以下步骤：
(1)将藻体在黑暗条件下干出10～12h；
(2)将干出后的藻体再复水；
(3)对藻体进行碎片化处理；
(4)对碎片化后的藻体诱导培养释放孢子。
优选的，所述藻类为绿藻纲石莼属藻类。更优选的，所述藻类为孔石莼或浒苔。
优选的，步骤(1)干出前，先对藻体进行驯化培养，驯化培养的方法为：将藻体于恒温光照培养箱中驯化培养30天，条件为20℃，盐度30ppt，光照强度3000lux，光暗比12∶12。
培养时，采用无菌海水驯化藻体。期间以大型海藻常用培养基pes培养基做营养盐加富处理，以确保驯化环境中藻体生长所需的营养成分。
优选的，步骤(3)对藻体进行碎片化处理时，藻体碎片最大尺寸不大于1cm。更优选的，步骤(3)对藻体进行碎片化处理时，藻体碎片最大尺寸不大于0.5cm。进一步优选的，步骤(3)对藻体进行碎片化处理时，藻体碎片最大尺寸不大于1mm。研究发现，碎片化程度越高，藻体分切的越细小，则孢子释放时间越早，且释放率越高。但藻体分切也不宜过于细小，过于细小之后，操作比较麻烦，所以大约1mm左右为最适宜的大小。
优选的，步骤(4)诱导培养条件为：温度25℃～35℃，盐度25～35ppt，光照3000lux，光暗比12∶12。更优选的，步骤(4)诱导培养条件为：温度25℃，盐度25～30ppt，光照3000lux，光暗比12∶12。最优选的，步骤(4)诱导培养条件为：温度25℃，盐度25ppt，光照3000lux，光暗比12∶12。在诱导孢子释放过程中，温度和盐度的影响较大，高盐度(35ppt)情况下孢子释放率显著低于低盐度(25ppt)和正常盐度组(30ppt)；而温度方面，较高温度下(30℃、35℃)孢子释放率不如较低温度(25℃)下。
本发明经研究发现，采用干出结合碎片化的技术方案，能够更为有效的诱导藻体孢子释放。在干出方面，相较于先前相关研究的光照条件下干出诱导，黑暗条件下干出可更好的保证藻体不会因失水过多而直接死亡，进而导致释放失败。通过将藻体碎片化处理，能够有效提高孢子释放效率，并且，碎片化程度越高，即藻体分切的越细小，对孢子释放越有利。
具体实施方式
下面为针对石莼属(ulva.sp)两种常见物种浒苔(u.prolofera)以及孔石莼(u.lactuca)进行孢子释放实验。
实施例1
(1)实验样品驯化培养：取适量孔石莼样品，于恒温光照培养箱中驯化培养30天，条件为20℃，盐度30ppt，光照强度3000lux，光暗比12∶12。海水采用pes培养基加富处理。
(2)样品黑暗干出条件探索：驯化完成后，采用灭菌海水冲洗后，消毒棉签清除表面杂质，黑暗条件下分别干出10h、12h、24h并分别标记为a、b、c组。干出同时准备藻段培养所需48孔细胞培养板。干出完成后样品，分别测定各组失水程度为59％、55％、72％。
(3)干出样品复水：干出藻体于灭菌环境下复水，以韧性恢复作为复水完成之标准。待工作完成后，进行后续碎片化工作。
(4)样品碎片化处理：复水完成后样品通过灭菌刀片切断、组织剪剪短、1ml灭菌枪头穿刺等手段，分别长度约为1cm、0.5cm的藻段以及直径约为1mm的圆形藻片。依据长度不同标注为a、b、c组。结合步骤2中干出时间的差异，设置组别为aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc。
(5)组织碎片培养诱导孢子释放：将藻段转移至48孔板后，培养条件变更为温度25℃，盐度25ppt，光照3000lux，光暗比12∶12。培养4天后，镜检观察到孢子释放现象。
(6)孢子收集及孢子复苏：采用移液器快速收集培养液，冰面暂存；收集时间不超过2小时。富集后的孢子液小心移除上清，于20℃条件下水浴复苏20min。通过镜检观察，孢子游动性完好，后续实验中存在附着现象，证明释放技术及复苏手段有效。
(7)孢子释放率总结：各组别中释放率存在显著差异。其中，干出时间长短将显著影响孢子释放效率。ca、cb、cc(干出24h组)内未观察到孢子释放现象，藻体直接白化死亡。在碎片化程度相同时，10h与12h带来的影响并不显著。在碎片化方面，当碎片化程度为1cm时(aa、ba、ca)，其释放率均未超过50％。随着碎片化程度增加，孢子释放率逐渐递增。在干出处理时间相同时，直接1mm的圆形藻片表现出最佳的孢子释放能力。在本次实验中，bc组检测到最高的孢子释放率，约为80％；因此孢子释放最佳条件为干出时间12h、碎片化至直径为1mm的藻片。
实施例2
(1)实验样品驯化培养：取适量浒苔样品，于恒温光照培养箱中驯化培养30天，条件为20℃，盐度30ppt，光照强度3000lux，光暗比12∶12。海水采用pes培养基加富处理。
(2)样品黑暗干出条件探索：驯化完成后，选取片状、分支较少的浒苔藻体，采用灭菌海水冲洗后，消毒棉签清除表面杂质，黑暗条件下分别干出10h、12h、18h。干出同时准备藻段培养所需48孔细胞培养板。干出完成后样品，分别测定各组失水程度为67％、60％、78％。
(3)干出样品复水：干出藻体于灭菌环境下复水，以韧性恢复作为复水完成之标准。待工作完成后，进行后续碎片化工作。
(4)样品碎片化处理：复水完成后样品通过灭菌刀片切断、组织剪剪短、1ml灭菌枪头穿刺等手段，分别长度约为1cm、0.5cm的藻段以及直径约为1mm的圆形藻片。
(5)孢子释放诱导条件摸索：将藻段转移至48孔板后，进行培养条件摸索。温度分别设置25℃、30℃、35℃，盐度25、30、35ppt，光照3000lux，光暗比12∶12。结合步骤2、4中干出时间及碎片化处理条件的不同，做各条件交叉培养。培养3-5天后，镜检观察到孢子释放现象。
(6)孢子收集及孢子复苏：采用移液器快速收集培养液，冰面暂存；收集时间不超过2小时。富集后的孢子液小心移除上清，于20℃条件下水浴复苏20min。通过镜检观察，孢子游动性完好，后续实验中存在附着现象，证明释放技术及复苏手段有效。
(7)孢子释放率总结：不同前处理样品间孢子释放存在显著差异。在干出时间方面，24h样品在复水后，培养2天全部白化死亡，未见孢子释放现象。18h样品孢子释放率较差。10h与12h干出处理组别对比未出现显著差异。碎片化处理方面，1cm藻段与0.5cm藻段的孢子释放时间较1mm藻片存在1-2天的延迟，在释放率方面亦显著低于1mm藻片。在后续的诱导孢子释放过程中，盐度、温度的影响不容忽视。高盐度组(35ppt)其释放率显著低于低盐度(25ppt)以及正常盐度组(30ppt)，盐度为25ppt时，呈现最佳释放效率。温度方面，25℃时呈现最佳释放效率，高温(30℃、35℃)下不如25℃时释放率高。综上所述，浒苔孢子释放的最佳前处理方式为干出时间10-12h，碎片化至1mm藻段，后续诱导条件组合为温度25℃，盐度25ppt。