植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用。

背景技术：

糖尿病是由于胰岛素绝对缺乏或相对不足以及靶组织细胞(如脂肪、肝脏、骨骼肌等)对胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗)而引起的以慢性血糖水平升高为特征的代谢异常综合症，可导致糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱。临床上主要有胰岛素依赖型(IDDM，I型)和非胰岛素依赖型(NIDDM，II型)两种类型。糖尿病作为一种严重的非传染性慢性疾病现已成为全世界各国密切关注的重大公共卫生问题之一，是全球范围内继心血管和肿瘤疾病之后的第三号杀手。随着生活水平提高，无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病的发病率都在逐年上升。在发展中国家表现更为突出。据WHO估计，全球目前糖尿病患者已超过1.9亿，到2025年将增加到3亿。

20世纪80年代，人们通过基因工程(重组DNA)(转基因)酵母(啤酒酵母.毕赤酵母或汉逊酵母)或重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达出高纯度的合成人胰岛素，其结构和人体自身分泌的胰岛素一样。对比动物胰岛素，人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗，所以皮下脂肪萎缩的现象也随之减少；由于人胰岛素抗体少，所以注射量比动物胰岛素平均减少30％；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素，常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。

20世纪90年代末,在对人胰岛素结构和成分的深入研究中发现,对肽链进行修饰:利用基因工程技术,改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合；改变等电点；增加六聚体强度；以钴离子替代锌离子；在分子中增加脂肪酸链,加大与白蛋白的结合,均有可能改变其理化和生物学特征,从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)。胰岛素类似物可紧临餐使用，也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。

尽管胰岛素在治疗糖尿病上有诸多优点，但它由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障，其常规给药途经一直以注射为主。本发明将人胰岛素与转铁蛋白融合表达，可以实现在口服给药，减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用。本发明对具有降糖作用的活性多肽进行结构改造和修饰，使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性，并通过植物来生产该活性物质。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。并且制成口服降糖胶囊。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白，其具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

本发明还提供了编码如权利要求1所述融合蛋白的核苷酸，具有

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(IV)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(IV)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

在上述研究基础上，本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述待转化载体为叶绿体表达载体。

本发明还提供了所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：分别将所述人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pInTf。

本发明还提供了所述的表达载体或植物在表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为降糖的口服制剂。

在上述研究的基础上，本发明还提供了宿主，转化有所述表达载体的植物或微生物；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

本发明还提供了药物，包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为降糖的口服制剂。

本发明还提供了一种植物作为宿主表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：

步骤1：准备转化用载体；

步骤2：准备微粒子弹；

步骤3：基因枪轰击；

步骤4：转换后培养、再生为植株。

本发明还提供了一种植物作为宿主制备降糖的药物的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白，灌装。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：

步骤1：准备转化用载体；

步骤2：准备微粒子弹；

步骤3：基因枪轰击；

步骤4：转换后培养、再生为植株。

植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。

本发明利用植物叶片，生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。

本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统大规模生产人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示载体pInTf示意图；

图2示western-blot结果。

具体实施方式

本发明公开了一种植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了植物生产口服降糖胶囊的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。并且制成口服降糖胶囊。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本发明还提供了一种表达载体，包括人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列密码子优化为植物偏好的密码子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为植物叶绿体载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：将人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列的密码子优化为植物偏好的密码子；

步骤2：由金斯瑞进行基因合成克隆到pUC57载体中，获得pInTf克隆载体.

具体的，为了提供外源蛋白在植物中的高效表达，本发明将人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，获得pInTf载体(图1)。

本发明还提供了所述的表达载体在表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列中的应用。

将本发明提供的表达载体用基因枪轰击植物叶片，再生为植株后收获植物叶片并制成口服降糖胶囊。

本发明利用植物叶片，生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。

本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统大规模生产人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。

本发明提供的植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1叶绿体表达载体的构建

为了将外源蛋白在植物中的高效表达，将人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列氨基酸序列利用反翻译软件

(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。

实施例2转化材料准备

将植物种子用无菌水浸泡过夜，用70％乙醇浸泡1分钟后用无菌水冲洗1次；再用2％NaClO(加0.1％Tween-20)处理15分钟，每5分钟轻柔混匀1次，无菌水冲洗4-5次；用无菌滤纸吸干后种植于1/2MS培养基上(含3％蔗糖、0.7％琼脂粉、pH值为5.8)，置于光照培养箱中25℃，16h光照8h黑暗培养，约3周可用于转化。

实施例3基因枪准备

称取50-60mg金粉(0.6μm)于干燥的1.5mL灭菌EP离心管。加入1mL无水乙醇，涡旋2分钟。加入1mL无菌水，涡旋1分钟，室温放置1分钟，10,000rpm离心2分钟，去上清。加入1mL 50％甘油，重悬金粉，-20℃冻存。

甘油保存状态的金粉悬液涡旋5分钟使金粉重悬。取50μL金粉悬液于无菌1.5mL离心管，涡旋1分钟。加入10μg质粒DNA，涡旋30秒。加入50μL 2.5M CaCl2，涡旋30秒。加入20μL 0.1M亚精胺，混合物涡旋5分钟，冰上静置2分钟。加60μL预冷的无水乙醇，手指轻弹使之重悬，14,000rpm离心10秒，去上清，重复一次。加入50μL无水乙醇重悬，备用。

实施例4基因枪轰击

根据样品数量取一定数量的载体膜、可裂膜、阻挡网(注意：载体膜、可裂膜需每枪更换，阻挡网同一个样品可共用)于无水乙醇中浸泡15分钟，用无菌水冲洗2次，自然晾干，备用。将晾干的载体膜放入无菌铁环中，压平。将制备好的子弹涡旋充分混匀，取10μL子弹于载体膜中央，自然晾干。把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，加入阻挡网，把微粒载片安装在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上盖子，将微粒发射装置放回轰击室。

实施例5转化后培养及筛选

1.暗培养：将轰击后的生菜叶片剪下，切成10～20mm2的叶盘置于RMOL培养基(不加抗生素)中25℃暗培养2天。

2.筛选培养：将暗培养结束的材料转移至筛选培养基(抗生素浓度为50μg/mL)中进行筛选培养。

3.生根培养：将芽转移至生根培养基(抗生素浓度为100μg/mL)中诱导生根。

实施例6 Western blot检测目的蛋白表达情况

采用液氮研磨、变性裂解提取植物蛋白，将裂解上清和5×上样缓冲液(使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为5％)按4:1的比例混合(如200μl蛋白裂解上清与50μl5×上样缓冲液混合)，混匀，95℃加热6min，同时处理阴性对照及阳性对照；电泳电压积层胶80V，分离胶120V，待目的蛋白跑至分离胶中间位置后，停止电泳，回收下槽电泳液，拆开电泳装置，按照负极(黑色)、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜(事先用甲醇活化15s、ddH2O洗涤后浸泡于1×转移缓冲液中)或NC膜(不需活化)、滤纸、海绵、正极(透明)的顺序放置，排气泡后组装，放入电泳槽(注黑色对应电泳槽黑色一面放入)，加满转移缓冲液，将整个电泳槽放入冰水混合液中，90V电泳1.0h；电泳快结束时配制5％脱脂奶粉(封闭液)，将转移后的膜放入封闭液中室温封闭至少1h，4℃孵育一抗过夜(一抗稀释于5％脱脂奶粉中，稀释比参考说明书)；使用PBST或TBST洗涤15min×3次，室温孵育二抗1～2h，PBST或TBST洗涤15min×3次，采用DAB试剂盒进行显色，拍照，分析目的蛋白表达情况，结果表明目标蛋白在生菜中正常表达，见图2。

实施例7人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列活性检测

在持续七周的稳定期后，将狗随机分为两个治疗组，每组3只，分别接收含有降糖蛋白(实施例5制得的人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白)及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，做第一次重复。再次将狗随机分组，接受另一种不同的实验饮食，做第二次重复。重复I和II至少持续2周，在每次重复结束后检测血糖反应。

在血糖检测开始前，狗禁食24小时。剃去导管插入部位的毛，无菌处理，导管插入右头静脉。大约间隔5分钟采集两基线样品。在采集最后一个基线样品后，立即给狗喂相当其体重1％的饮食并含有1片或3片降糖胶囊，至多允许其吃15分钟。如果在15分钟内狗不吃实验饮食，则当天不检测其血糖反应，次日重新检测。在进食后10、20、30、45、60、120、180和240分钟，采集额外的血液样品。血液样品1300×g离心15分钟，在采集后两小时内将每个时间点1ml血浆之两等分样品冻存。应用己糖激酶方法测定血浆葡萄糖浓度(mg/dl)。

表1狗血液中糖浓度的实验结果

注：*示具有显著差异(P＜0.05)；**示具有极显著差异(P＜0.01)。

实施例8动物毒性试验

将7周大小的实验用小白鼠随机分为三个治疗组，每组10只，分别接收含有降糖蛋白(按照体重喂食500ng/g)(本发明得到的人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白)，及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，接受相同的实验饮食。连续喂食10天，每次喂食后实进行观察，每天需要连续观察6小时以上，并没有看小鼠处于兴奋状态还是抑制状态，没有出现行动迟缓等现象，也没有出现腹泻等情况。证明人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白口服安全性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王跃驹

<120> 植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用

<130> MP1907675

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 804

<212> PRT

<213> 人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白(Fusion protein of human insulin and transferrin)

<400> 1

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly

20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly

50 55 60

Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu

65 70 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys

85 90 95

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Asp

115 120 125

Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys Cys

130 135 140

Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg Ala

165 170 175

Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu Val

180 185 190

Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val Ala Glu

195 200 205

Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala

210 215 220

Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro

245 250 255

Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu

260 265 270

Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp

275 280 285

Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys

290 295 300

Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu

305 310 315 320

Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile Phe

325 330 335

Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys

340 345 350

Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His Leu

355 360 365

Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly Lys

370 375 380

Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly

385 390 395 400

Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys

405 410 415

Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro

420 425 430

Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile

435 440 445

Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp Glu Cys

450 455 460

Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg Leu Lys Cys

465 470 475 480

Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala

485 490 495

Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala Asp

500 505 510

Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly

515 520 525

Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu Lys Ser Asp Asn Cys Glu

530 535 540

Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser

545 550 555 560

Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His

565 570 575

Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu

580 585 590

Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly

595 600 605

Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met

610 615 620

Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr

625 630 635 640

Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala

645 650 655

Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly Lys Asn Pro

660 665 670

Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu Leu Leu Cys

675 680 685

Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys His Leu

690 695 700

Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp Lys Glu Ala

705 710 715 720

Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe Gly Ser Glu

725 730 735

Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr Lys

740 745 750

Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His Asp

755 760 765

Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala Val

770 775 780

Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu Ala Cys Thr

785 790 795 800

Phe Arg Arg Pro

<210> 2

<211> 2412

<212> DNA

<213> 人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白(Fusion protein of human insulin and transferrin)

<400> 2

atggctttat ggatgagact tcttcctctt cttgctcttc ttgctttatg gggacctgat 60

cctgctgctg cttttgtaaa tcaacatctt tgtggttctc atcttgttga agctttatat 120

cttgtatgtg gtgaacgagg atttttctat actcctaaaa caagacgaga agctgaagat 180

cttcaagtag gacaagttga attaggtgga ggacctggtg ctggatcttt acaacctctt 240

gctcttgaag gatctcttca aaaaagaggt attgtagaac aatgttgtac ttctatttgt 300

tctctttatc aacttgaaaa ttattgtaat ggtggaggtg gatctggtgg aggtggatct 360

ggtggaggtg gaagtgtacc tgataaaact gttagatggt gtgctgtatc tgaacatgaa 420

gctacaaaat gtcaatcttt tcgagatcat atgaaatctg ttattccttc tgatggacct 480

tctgtagctt gtgttaaaaa agcttcttat cttgattgta ttcgagctat tgctgctaat 540

gaggctgatg ctgttacatt agatgctgga ttagtatatg atgcttatct tgctcctaat 600

aacttaaaac ctgtagttgc tgaattctat ggttctaaag aagatcctca aactttctat 660

tatgctgtag ctgtagttaa aaaagattct ggattccaga tgaatcaact tagagggaaa 720

aaatcttgtc atacaggttt aggacgatct gctggatgga atattcctat tggtcttctt 780

tattgtgatc ttcctgaacc tagaaaacct cttgaaaaag ctgttgctaa tttcttttct 840

ggatcttgtg ctccttgtgc tgatggtact gatttccctc aactttgtca actttgtcct 900

ggttgtggat gttctacatt aaatcaatat ttcggttatt ctggagcttt taaatgttta 960

aaagatggtg ctggagatgt agctttcgtt aaacattcta ctattttcga aaatcttgct 1020

aataaggctg atagagatca atatgaactt ctttgtcttg ataatactcg aaaacctgtt 1080

gatgaatata aggattgtca tcttgctcaa gtaccttctc atacagtagt tgctagatct 1140

atgggaggaa aagaagatct tatttgggaa cttcttaatc aagctcaaga acatttcgga 1200

aaagataaat ctaaagaatt ccaattattt tcttctcctc atggaaaaga tcttcttttt 1260

aaagattctg ctcatggatt tttaaaagta cctcctcgta tggatgctaa aatgtatctt 1320

ggatatgaat atgtaactgc tattagaaat cttcgagaag gtacttgtcc tgaagctcct 1380

acagatgaat gtaaacctgt taaatggtgt gctctttctc atcatgaacg acttaaatgt 1440

gatgaatggt ctgtaaattc tgttggaaaa attgaatgtg tatctgctga aactacagaa 1500

gattgtattg ctaaaattat gaatggtgaa gctgatgcta tgtctcttga tggtggattc 1560

gtttatattg ctggtaaatg tggattagta cctgttcttg ctgaaaatta tgaaaaatct 1620

gataattgtg aagatactcc tgaagctgga tatttcgctg ttgctgtagt taaaaaatct 1680

gcttctgatc ttacatggga taatcttaag gggaaaaaat cttgccatac tgctgtagga 1740

agaacagctg gttggaatat tcctatgggt cttctttata ataagattaa tcattgtcga 1800

tttgatgaat ttttctctga aggatgtgct cctggatcta aaaaagattc ttctctttgt 1860

aaattatgta tgggttctgg acttaatctt tgtgaaccta ataacaaaga aggatattat 1920

ggatatactg gtgcttttag atgtcttgtt gaaaaaggag atgttgcatt cgttaaacat 1980

caaactgtac ctcaaaatac aggtggaaaa aatcctgatc cttgggctaa aaatcttaat 2040

gagaaagatt atgaattatt atgtttagat ggtactagaa aacctgtaga agaatatgct 2100

aattgtcatc ttgctagagc tcctaatcat gctgtagtta cacgaaaaga taaagaagct 2160

tgtgttcata aaattcttcg acaacaacaa catctttttg gatctgaagt aactgattgt 2220

tctggtaatt tctgtttatt tcgatctgaa actaaagatc ttttatttcg agatgataca 2280

gtttgtttag ctaaacttca tgatagaaat acatatgaaa aatatcttgg agaagaatat 2340

gttaaagctg ttggtaatct tcgaaaatgt tctacttctt ctcttcttga agcttgtact 2400

tttagaagac ct 2412