基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用。
背景技术：
：玉米纯度鉴定和品种区分是育种过程中的重要环节，同时也是玉米种子质量控制体系中的关键环节。目前玉米纯度鉴定和品种区分方法有形态鉴定、种子贮藏蛋白质电泳技术和DNA分子标记技术等。其中，简单重复序列(SimpleSequenceRepeats,SSR)标记具有多态性高、遗传上呈共显性和对参考序列要求较低等优点，因此根据上述技术制定的相关技术标准得到了广泛应用。随着分子生物学技术的发展，各育种企事业单位对分子标记辅助选择的需求日益迫切，而SSR标记基因组分布不够丰富以及需进行复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等问题逐渐凸显，很难实现高通量低成本的分子标记辅助选择。竞争性等位基因PCR(kompetitiveallelespecificPCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。该技术现阶段主要被应用于SNP或InDel基因分型研究中，正逐渐成为分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要技术手段。HaoHu等在《EvaluatinginformationcontentofSNPsforsample-tagginginresequencingprojects》中，从SNP信息熵的角度提出了一种挑选SNP标记用来区分人类个体的方法，并用Perl语言开发了SNP_Tagger.pl。基于此方法，用低至60个SNP标记就可以区分当前世界上所有人类的个体，而仅通过30个SNP标记就足以标记区分多达10万个以上个体。在作物育种领域，目前尚未见到基于KASP技术的一组分子标记来进行玉米纯度鉴定和品种区分。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用。为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记，包括22个核心SNP标记，编号分别为LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902，它们的信息如下：表122个玉米核心SNP标记编号染色体SNP物理位置等位基因编号染色体SNP物理位置等位基因LP0009127883004[G/T]LP03683229172879[A/C]LP0014144333421[A/G]LP03769150002028[G/C]LP00331204846790[A/C]LP0425122595305[C/T]LP00681299049227[C/T]LP06204135185331[A/G]LP01894239761848[G/A]LP06294173239725[C/T]LP01914240048629[A/G]LP07296102987176[A/T]LP0209513238813[T/C]LP07496163214059[A/C]LP0221595037309[A/G]LP07827136902532[A/C]LP02275172852124[G/A]LP07877167378729[A/G]LP02425215561608[T/C]LP0800870028786[A/G]LP0328819858353[C/G]LP090210144409391[A/G]上述SNP物理位置是基于玉米B73的全基因组序列确定的，玉米B73全基因组序列的版本号为APGv3。第二方面，本发明提供用于扩增上述玉米核心SNP标记的KASP引物，22个核心SNP标记LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902分别依次通过以下引物扩增得到：SEQIDNO:1-3，SEQIDNO:4-6，SEQIDNO:7-9，SEQIDNO:10-12，SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:16-18，SEQIDNO:19-21，SEQIDNO:22-24，SEQIDNO:25-27，SEQIDNO:28-30，SEQIDNO:31-33，SEQIDNO:34-36，SEQIDNO:37-39，SEQIDNO:40-42，SEQIDNO:43-45，SEQIDNO:46-48，SEQIDNO:49-51，SEQIDNO:52-54，SEQIDNO:55-57，SEQIDNO:58-60，SEQIDNO:61-63，SEQIDNO:64-66。第三方面，本发明提供含有上述KASP引物的检测试剂、试剂盒或芯片。第四方面，本发明提供所述22个玉米核心SNP标记或所述KASP引物的以下任一应用：(1)用于构建玉米品种DNA指纹数据库；(2)用于玉米种质资源遗传多样性分析；(3)用于玉米分子标记辅助育种；(4)用于玉米品种鉴定；(5)用于制备玉米基因组芯片。前述应用包括以下步骤：1)提取待测玉米基因组DNA；2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增；3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。其中，所述KASPPrimermix中含有三条特异性引物：引物F、H和C，各SNP标记的引物序列都是按照F、H和C顺序一一对应。所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的FRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。步骤2)中引物F的5’端添加FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，引物H的5’端添加HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。优选地，步骤2)所述KASPPrimermix中引物F、H和C的浓度分别为步骤2)中所用PCR反应体系如下：384孔板中每孔加入100μMKASPPrimermix0.02-0.022μl、2×KASPMastermix0.6-0.9μl和DNA模板0.6-0.9μl。步骤2)中所用PCR反应条件如下：90-95℃预变性10-20分钟；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，退火并延伸30-90秒，5-20个TouchDown循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.1-3.0℃；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，57-60℃退火并延伸30-90秒，20-35个循环。优选地，所用PCR反应体系如下：384孔板中每孔加入100μMKASPPrimermix0.022μl、2×KASPMastermix0.8μl和DNA模板0.8μl。PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个TouchDown循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，35个循环。反应结束后，对扩增产物进行荧光扫描。可选地，步骤3)按图1方式进行数据读取或参考吴建辉博士学位论文(2017)，通常以Excel文件的形式导出基因分型的数据，其中，第一列是样品名称，第一行是标记名称，材料与标记以矩阵的形式一一对应，在此基础上稍做格式转换，进行遗传多样性分析、品种纯度鉴定和品种区分等。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出22个玉米核心SNP标记，利用该套SNP标记组合对玉米材料进行检测，更精准、高效。在DNA质量满足一般KASP反应(或常规PCR反应)需求的情况下，检测的准确度和分辨率均很高，检测效率是SSR标记的10-20倍，检测成本与SSR标记相当，同时检测过程中无需使用丙烯酰胺等有毒化学试剂。此外，反应体系构建可实现自动化，将导出的数据输入计算机软件，可以实现一键分析。真正实现了高通量、低成本、自动化安全检测。附图说明图1为本发明对扩增产物的荧光扫描数据进行读取的结果示例。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1玉米核心SNP标记的获得基于已有的600份玉米自交系材料(由袁隆平农业高科技股份有限公司提供)，从906个SNP标记中，靶向测序基因分型技术的数据结合数理统计分析，筛选出可以区分上述材料的22个核心SNP标记。具体筛选方法如下：1、获取数据：材料清单及各材料的SNP信息，得到一个SNP矩阵数据，每行为一个SNP标记信息(称之为标记)，每列为一个材料(称之为材料)；2、数据清洗：剔除SNP信息缺失率>20％的材料；剔除SNP信息缺失率>20％的标记；剔除不具备多态性的标记，即若该标记上所有材料的基因值相同，则剔除该标记。剔除掉相同材料：对所有材料进行对比分析，对相同基因型占比在95％以上的材料组进行鉴定，判断是否为同一材料，若是则剔除掉重复的材料。3、计算SNP标记的信息熵：1)计算单个标记的信息：根据其三种基因型(如某个标记上的三种基因型A/A，A/T，T/T)在单个SNP上出现的频率，计算单个SNP信息熵。计算公式如下：其中，H(X)为单个SNP的信息熵，χ为三种基因型的集合，如{A/A，A/T，T/T}，p(x)为单个标记上特定基因型出现的概率。2)计算标记对(即两个标记)之间的互信息：两个标记X和Y之间的互信息定义为：其中，p(x,y)为三种基因型X和Y的联合概率密度，p(x)和p(y)分别是关于它们的三种基因型的X和Y的边际概率密度。X和Y之间的互信息越高，X和Y的信息总和越冗余。根据以上公式，计算所有标记的单个标记信息熵，以及所有标记两两组合形成的标记对的互信息。计算过程可用以下R语言脚本SNPentropy.R来实现，输出文件为SNPentropy.txt。4、通过HaoHu《EvaluatinginformationcontentofSNPsforsample-tagginginresequencingprojects》所提供的SNP_Tagger.pl来挑选标记组合：SNP_Tagger为用perl开发的脚本。执行语句为：perlSNP_Tagger.pl-entropySNPentropy.txt-outtest.txt-marker_numberk其中，SNP_Tagger.pl为脚本文件名，SNPentropy.txt为步骤3中输出的SNP信息熵数据文件，test.txt为输出的结果，k为挑选的标记数量。k值的确定：在进行标记筛选时，我们往往无法事先确定合适的k值，一般默认取k值＝10。通过SNP_Tagger找出k个标记后，用选出的k个标记和所有材料组成一个新的数据集，计算各个材料在k个标记上两两之间汉明距离。若两个材料之间的汉明距离为0，则表示对应的两个无法被区分，统计出无法被区分的材料个数m。随着k值的增大，无法被区分的材料数m将缩小，但m缩小的幅度将越来越小，可通过肘部法挑选出k值，并筛选出k个标记。5、对无法被区分材料进行标记筛选5.1在步骤4中筛选出了k个标记，通过这些标记，仍有m个材料无法被区分。我们用剔除掉上述k个标记以外的其他标记，与这m个材料，组合成新的数据集:Data_no_k,在新的数据集中，计算任意两个材料之间的汉明距离，形成一个m*m的汉明距离矩阵。在所得汉明距离矩阵中，找到非对角线位置的最小的汉明距离d，显然d>0：若d＝1，则该汉明距离所对应的两个材料仅存在一个标记有差异，选出该标记；若d>1，则从这两个材料所不同的d个标记中，挑选出信息熵最大的那个标记。5.2用上述方法找到的一个标记，与步骤4中找出的k个标记，形成一个(k+1)个标记组合，此时有m2个材料无法被区分。将k+1个标记与m个材料组成新的数据集“Data_no_k+1”，重复5.1、5.2的操作，直到m＝0为止。此时可得到k+p个标记组合，其中k为步骤4中找出的标记组合，p为步骤5.1中找出的标记组合。6、通过步骤4和步骤5，确定了k+p个标记组合，通过这些组合，可以区分所有材料。进一步地，剔除掉冗余的标记。6.1用k+p个标记和所有的材料，组成数据集：Dataset_kp，然后，剔除掉步骤5中所挑选的p个标记中的第一个标记所对应的标记行，用剩余的数据计算汉明距离矩阵，若汉明距离矩阵中除对角线以外，其他所有值均为0，则该标记被剔除；若汉明距离矩阵中除对角线以外，出现有至少一个0，则表明剔除掉该标记后，有材料无法被区分，也就是说这个标记不能被剔除。6.2重复6.1的操作，直至步骤5中所挑选的p个标记均被判断是否剔除，最终数据集剩下k+p2个标记行，p2为上述p个标记被剔除后剩余的标记。6.3重复6.1、6.2的操作，对标记组合k中的标记逐一剔除，若剔除后剩余的标记无法区分所有材料，则剔除失败，放回标记组合；若剔除后剩余的标记仍可以区分所有材料，则剔除成功，不再放回，知道所有k个标记均被判断是否剔除，最终剩下k2个标记。6.4执行完剔除操作后，最终剩下k2+p2个标记，这些标记构成的组合可以区分所有材料，且剔除任意一个标记后，剩余的标记均无法区分所有材料。最终获得如表1所示的22个玉米核心SNP标记。表222个玉米核心SNP标记编号染色体SNP物理位置等位基因编号染色体SNP物理位置等位基因LP0009127883004[G/T]LP03683229172879[A/C]LP0014144333421[A/G]LP03769150002028[G/C]LP00331204846790[A/C]LP0425122595305[C/T]LP00681299049227[C/T]LP06204135185331[A/G]LP01894239761848[G/A]LP06294173239725[C/T]LP01914240048629[A/G]LP07296102987176[A/T]LP0209513238813[T/C]LP07496163214059[A/C]LP0221595037309[A/G]LP07827136902532[A/C]LP02275172852124[G/A]LP07877167378729[A/G]LP02425215561608[T/C]LP0800870028786[A/G]LP0328819858353[C/G]LP090210144409391[A/G]上述SNP物理位置是基于玉米B73的全基因组序列确定的，玉米B73全基因组序列的版本号为APGv3。实施例2利用22个玉米核心SNP标记鉴定RP3等12个玉米自交系纯度的方法RP3等12个玉米自交系是袁隆平农业高科技股份有限公司目前主要推广品种的亲本，每个自交系农艺性状方面表现一致，应用本发明的22个玉米核心SNP标记及其KASP引物，对以上材料进行纯度鉴定，主要是验证该组核心标记的代表性和区分度。具体实验步骤如下：1、DNA模板的准备：分别准备RP3等12个玉米自交系的DNA，每个材料10个重复，共120个样品。采用CTAB法提取以上样品基因组DNA。2、KASP引物的设计以及合成：利用生物信息学相关方法找到每个SNP位点物理位置两侧适当长度的B73参考基因组序列。基于以上参考序列应用Primer3设计如下KASP引物(表3)，引物交由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成。表3KASP引物序列注：合成引物时需要在引物F和H的5'端分别添加标签序列FAM和HEX。3、反应体系的构建：将添加了标签序列的引物、DNA模板以及KASP反应液构建反应体系，应用LGC的IntelliQube全自动化PCR/qPCR体系建立系统。每个反应的DNA模板量为30ng左右。反应体系：组分384Tape100μMKASPPrimermix0.022μl2×KASPMastermix0.8μlDNA模板0.8μl总体积1.622μl所述KASPPrimermix中引物F、H和C的浓度分别为12μM、12μM和30μM。4、将加样完毕的反应板在热循环仪(Hydrocycler)中进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个TouchDown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，35个循环。5、结果分析：反应结束后对产物进行荧光扫描，扫描结果会以散点图的形式出现，根据散点图判断该样品的基因型：图形的横坐标表示产物释放的FAM荧光，纵坐标表示产物释放的HEX荧光。如果能检测出显著的FAM荧光和HEX荧光，则表明样品在该标记位点是杂合体；如果仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到显著的FAM荧光，则表明样品是该标记中带HEX荧光标签引物所代表基因型的纯合体；如果仅检测到显著的FAM荧光但没有检测到HEX荧光，则表明样品是该标记中带FAM荧光标签引物所代表基因型的纯合体；如果HEX荧光和FAM荧光都没有检测到，则需要重新检测。采用R脚本对IntelliQube中导出的数据进行一键分析，表4结果显示本发明22个玉米核心SNP标记具有较好的区分度，可以应用到品种(系)纯度鉴定或区分中。每个自交系10个样品的纯度鉴定结果见表5。表5每个自交系10个样品的纯度鉴定结果实施例3利用22个玉米核心SNP标记鉴定B73等11个经典玉米自交系纯度的方法应用本发明的22个玉米核心SNP标记及其KASP引物，对表6中的经典玉米自交系材料进行纯度鉴定，实验方法同实施例2。结果表明，本发明的22个玉米核心SNP标记无论在每个自交系内部的重复间(表7)还是不同自交系间(表8)都具有很好的区分度，具有很好的应用前景。表611个经典玉米自交系名称及所属类群类群玉米自交系名称瑞德B73、2369、LH190、LH191改良瑞德郑58、K22PB齐319兰卡斯特LH51、MBST、78371A四平头昌7-2表711个经典玉米自交系(内部重复间)纯度虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>袁隆平农业高科技股份有限公司浙江大学<120>基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用<130>KHP191112273.7<160>66<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1gggacaatgctgaagatgatgttt24<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2tcaaagttctatacaggtggttgtg25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3tcaaagttctatacaggtggttgtt25<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4gcatgcatgcctggagtgctctt23<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5accagcaattcgatcaggaatgtaat26<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6ccagcaattcgatcaggaatgtaac25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>7atgagccttgtttgtgcaatactc24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>8aggtatcatgttgcatgcatttcaa25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>9aggtatcatgttgcatgcatttcac25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>10caagggtggatcctgaattcctgat25<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>11ggctcgtagtcgtaacctctc21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>12gggctcgtagtcgtaacctctt22<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>13cgaggcattggtaacttgctaag23<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>14aatgcgtggagaccatgggg20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>15aatgcgtggagaccatggga20<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>16gctgagactgtatgtgtactggtgta26<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>17gtacgtgctcatcttgacaagtgt24<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>18acgtgctcatcttgacaagtgc22<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>19cgcatgaatgttcaacggaacacgta26<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>20gttggtagcaaattaatgatgtcactcaa29<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>21ggtagcaaattaatgatgtcactcag26<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>22atcccccatgttkacccagagcta24<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>23cactctgagatgcctgccggt21<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>24ctctgagatgcctgccggc19<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>25caggctgttccgatgcttatgcaat25<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artif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