一种东乡野生稻群落划分方法与流程

本发明涉及野生稻群落技术领域，尤其涉及一种东乡野生稻群落划分方法。

背景技术：

东乡野生稻属普通野生稻，是迄今全世界最北的野生稻(28°14′n,116°36′e)，属国家二类保护植物，因其具有丰富的遗传多样性及蕴藏着耐寒、耐旱、耐瘠、抗病虫、胞质雄性不育等有利基因，素有植物中的“大熊猫”之美誉。1978～1982年先后在江西省东乡县发现了9个野生稻群落，分别位于庵家山、樟塘、东塘上、水桃树下、坎下垅、东塘、林场、东塘西和东塘下，1980年江西省农业科学院水稻所从东乡野生稻原生地取样、编号和保存，并在南昌建立了异位保护圃，含9个群落，共252个株系。1984年建立了水桃树下东乡野生稻居群原位保护区，为全国第一个野生稻保护区；1986年又与中国水稻所在原产地马岗山(庵家山)林场建立了第二个原位保护区，分为a、b两个原位保护位点，使东乡野生稻有了原位、异位的双重保护，对东乡野生稻的保护和利用起到了积极作用。

东乡野生稻现有9个群落的划分是由发现地点而来的，近年利用核基因组的分子标记对这9个群落的检测发现群落内和群落间的都存在较大遗传差异。比如，谢建坤等(2003)利用sslp标记对东乡野生稻进行多样性分析，发现东乡野生稻居群内平均遗传距离为0.23～0.47，居群间平均遗传距离为0.40～0.55。又如，孔德利等(2006)利用微卫星标记对113份东乡野生稻进行多样性分析表明，东乡野生稻群体内来自同一居群的部分材料遗传距离较近，有些材料间的遗传距离很大，最大达0.851。可见，东乡野生稻群落在核基因组水平上存在着丰富的遗传变异，然而居群内也存在较大遗传变异，这对东乡野生稻株系针对具体功能的利用和保护造成一定难度。

遗传多样性研究是保护生物学的重要领域之一，通过对东乡野生稻的遗传多样性研究，可以揭示东乡野生稻的变异类型、居群遗传结构和进化特点，国内外对东乡野生稻遗传多样性开展了大量研究，但也面临着不足之处。首先，无法对东乡野生稻株系进行来源鉴定和居群划分。野生稻的交配系统是风媒异交和自交混合型，如果附近有外来水稻花粉，野生稻极有可能被串粉，由此自交形成群落内丰富的遗传多样性；而野生稻花粉飘到栽培稻上，同样会让栽培稻渗入野生稻血缘，其自交后代与野生稻表型十分相似，而被误作野生稻居群。同一居群的东乡野生稻在生长过程中有异源材料渗入，已有研究无论从形态聚类还是核基因组分子标记分析来看，都无法对东乡野生稻株系进行来源鉴定和居群划分。其次，尚无研究东乡野生稻同一个居群内的株系是否同一起源，这给现在野生稻的保护带来一定复杂性。已有研究几乎都发现，东乡野生稻居群内的遗传距离小于居群间的。因为在原生境生长条件下，若是居群内通过动物粪便混入其它来源的种子，在长期的演化过程中，它们的核基因组相互渗透，完全有可能使一个小生态环境下的居群内遗传距离逐渐缩小，因此，解决东乡野生稻的分群及同一居群内遗传多样性的准确衡量目前是东乡野生稻遗传分化和保护研究的重点。

利用细胞质dna序列对物种的遗传多态性以及系统演化关系进行研究已经有几十年的历史，因为细胞质dna为母性遗传，与核基因组相比具有较高的遗传稳定性。细胞质dna主要包括线粒体dna和叶绿体dna，具有相对较高的遗传变异率，有利于研究细胞质遗传多态性以及系统演化规律。迄今，线粒体遗传在人类、鱼类及畜禽等动物进化研究中发挥了积极作用，取得显著进展。利用线粒体分子标记，从母体遗传的角度解析东乡野生稻群落的遗传结构和分布情况，对东乡野生稻重新分群，有利于实现对东乡野生稻遗传资源的精准保护和利用。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种东乡野生稻群落划分方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种东乡野生稻群落划分方法，包括如下步骤：

s1、供试材料选取：

东乡野生稻群体：选择东乡野生稻异位保存圃9个群落共220个株系；

s2、dna提取：

取水稻叶片，基因组dna的提取参照scott等(1988)的ctab法，具体如下：

1)取约0.1g叶片，置于2.0ml离心管中，加入1粒钢珠及500μl2×ctabdna提取液(20gctab，12.1gtris-base，7.44gedta-na，81.9gnacl，溶解于1l蒸馏水中)，使用组织研磨仪打碎叶片，65℃温浴30min，期间振动混匀数次；

2)从水浴中取出离心管，加入约500μl氯仿(chcl3)，充分震荡混匀，在10000rpm下离心5min；

3)转移上清液至一新的1.5ml的离心管中，加入上清体积2倍的无水乙醇，将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后，10000rpm离心5min；

4)弃上清液，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；

5)晾干后的dna加双蒸水溶解，调节最终浓度为100～1000ng/μl，置于-20℃冰箱内保存备用。

s3、线粒体标记的设计：

首先获取已在数据库中公开的11个品种【日本晴、93-11、pa64s、中国野生稻株系w1、hassawi、hassawi杂交水稻(ir1112×hassawi)、保持系、leadrice、rt98c、rt102c以及wa-cms】的线粒体序列，利用ncbi的在线比对软件blast，根据比对分析结果，设计indel标记，利用pcr、电泳检测所设计标记的有效性，筛选得到11个可用于东乡野生稻检测的标记，引物序列如seqidno.1-seqidno.11所示；

s4、基因型分析：

利用筛选得到的11个标记对步骤s1选取的东乡野生稻异位保存圃220份东乡野生稻株系进行基因型检测；进而建立东乡野生稻线粒体dna指纹数据库，利用ntsys统计软件计算标记数据的遗传相似性系数，采用非加权类平均法构建聚类图，并根据获得的类聚图进行基因型分析。

进一步的，步骤s3中的引物序列如下：

seqidno.1，nmt1：aagcataaaggggagagc，ttcgctcctgtagtgattt

seqidno.2，nmt11：ggcacataggatcaaacg，ctaccttgatccgccttc

seqidno.3，nmt16：atcaaaacgggtagggatc，tgcttttctttacgctgac

seqidno.4，nmt28：tctaacttaactgtcctgc，ctagtggttacagcgaatg

seqidno.5，nmt29：aaaacatatctttcggcgt，aaagcttcaagaataccgt

seqidno.6，nmt35：gaagctgactctcgttct，tgctatcgtcaccctttc

seqidno.7，nmt37：tctttcttttcccacggt，catgggatagcctgactc

seqidno.8，nmt38：acttccaatagagcgtcg，taggctactggtcgtact

seqidno.9，nmt43：aaggacccgcttcactag，tggatccttctctggtttg

seqidno.10，nmt44：atcttgaatcaggcctcg，ataccttcagccgagatc

seqidno.11，nmt46：agcatttcatcgcctatct，gcaaacctagcctacctatt

进一步的，步骤s3中：pcr采用10μl反应体系：模板dna1.0μl，10×pcrbuffer1.0μl，25mm的mgcl21.0μl，2mm的dntp1.0μl，0.3μm的引物1.0μl，taq酶0.2u，并加ddh2o补至10μl。

进一步的，步骤s3中：pcr扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。

进一步的，在步骤s3中：pcr反应产物在6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经银染、显色后读取条带。

本发明提出的一种东乡野生稻群落划分方法，有益效果在于：本发明所获得的标记是针对不同品种的线粒体变异序列设计的，特异性强，故检测时不必单独提取线粒体dna进行pcr扩增，只需使用总dna作模板检测即可；本发明的标记为线粒体分子标记，可以从母体遗传的角度对东乡野生稻群落进行分子鉴定，了解东乡野生稻群体的分化；利用本发明的标记对东乡野生稻群落进行检测，不仅节约成本，而且能够准确地获取东乡野生稻群落的遗传结构和分布信息，有利于对东乡野生稻资源进行精准保护和利用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种东乡野生稻群落划分方法，包括如下步骤：

s1、供试材料选取：

东乡野生稻群体：选择东乡野生稻异位保存圃9个群落共220个株系；

s2、dna提取：

取水稻叶片，基因组dna的提取参照scott等(1988)的ctab法，具体如下：

1)取约0.1g叶片，置于2.0ml离心管中，加入1粒钢珠及500μl2×ctabdna提取液(20gctab，12.1gtris-base，7.44gedta-na，81.9gnacl，溶解于1l蒸馏水中)，使用组织研磨仪打碎叶片，65℃温浴30min，期间振动混匀数次；

2)从水浴中取出离心管，加入约500μl氯仿(chcl3)，充分震荡混匀，在10000rpm下离心5min；

3)转移上清液至一新的1.5ml的离心管中，加入上清体积2倍的无水乙醇，将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后，10000rpm离心5min；

4)弃上清液，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；

5)晾干后的dna加双蒸水溶解，调节最终浓度为100～1000ng/μl，置于-20℃冰箱内保存备用。

s3、线粒体标记的设计：

首先获取已在数据库中公开的11个品种【日本晴、93-11、pa64s、中国野生稻株系w1、hassawi、hassawi杂交水稻(ir1112×hassawi)、保持系、leadrice、rt98c、rt102c以及wa-cms】的线粒体序列，利用ncbi的在线比对软件blast，根据比对分析结果，设计indel标记，利用pcr、电泳检测所设计标记的有效性，筛选得到11个可用于东乡野生稻检测的标记，引物序列如seqidno.1-seqidno.11所示：

seqidno.1，nmt1：aagcataaaggggagagc，ttcgctcctgtagtgattt

seqidno.2，nmt11：ggcacataggatcaaacg，ctaccttgatccgccttc

seqidno.3，nmt16：atcaaaacgggtagggatc，tgcttttctttacgctgac

seqidno.4，nmt28：tctaacttaactgtcctgc，ctagtggttacagcgaatg

seqidno.5，nmt29：aaaacatatctttcggcgt，aaagcttcaagaataccgt

seqidno.6，nmt35：gaagctgactctcgttct，tgctatcgtcaccctttc

seqidno.7，nmt37：tctttcttttcccacggt，catgggatagcctgactc

seqidno.8，nmt38：acttccaatagagcgtcg，taggctactggtcgtact

seqidno.9，nmt43：aaggacccgcttcactag，tggatccttctctggtttg

seqidno.10，nmt44：atcttgaatcaggcctcg，ataccttcagccgagatc

seqidno.11，nmt46：agcatttcatcgcctatct，gcaaacctagcctacctatt

pcr采用10μl反应体系：模板dna1.0μl，10×pcrbuffer1.0μl，25mm的mgcl21.0μl，2mm的dntp1.0μl，0.3μm的引物1.0μl，taq酶0.2u，并加ddh2o补至10μl。

pcr扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。pcr反应产物在6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经银染、显色后读取条带。

s4、基因型分析：

利用筛选得到的11个标记对步骤s1选取的东乡野生稻异位保存圃220份东乡野生稻株系进行基因型检测，11个标记在东乡野生稻群体中都显示多态性：如图1；进而建立东乡野生稻线粒体dna指纹数据库，利用ntsys统计软件计算标记数据的遗传相似性系数，采用非加权类平均法构建聚类图：如图2，根据获得的类聚图进行基因型分析，分析显示，东乡野生稻可分为10大类，与以原生境命名的9个群落不一致；原9个群落在线粒体遗传组成上也处于混杂状态，说明原生境的9个群落在母体遗传上并不单一，或者说各群落曾被相互渗透；且利用母体遗传将东乡野生稻清晰地划分为10个居群，表明这套线粒体标记实用性强，而且鉴定方法可靠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。