通过过表达脱落酸受体来提高植物生物量并由此提高产量的方法与流程

本申请涉及转基因和基因编辑领域，特别地涉及植物例如作物中的转基因和基因编辑。本发明提供了一种通过过表达脱落酸受体来提高植物生物量并由此提高产量的方法。本发明提高了植物，例如作物，特别是玉米中的生物量。
背景技术：
：提高作物产量是保证人类社会可持续性发展的必要条件。预期到2050年，世界人口将增加到98亿；这就需要农业在2010年所提供卡路里的基础上增加56％。基于现有农业产量增长率，人类需要增加15亿英亩的农业用地才能满足2050年需求。而农业用地受到气候、生态、经济模式等因素影响，保证现有农业用地面积已经是实属不易。因此，进一步提高作物产量是最有效的方法。第一次绿色革命解决了施用化肥带来的植株过高/倒伏的问题；通过矮秆基因的利用，大大提高了作物耐倒伏能力，进而提高了作物单位面积的产量。通过化肥的施用和作物矮化/半矮化，大大提高了小麦、水稻、大麦和高粱的产量；但是在玉米上这种效应并不明显。玉米上产量的提高主要取决于杂种优势的利用；通过优化杂交组合，可以提供1％的产量年增长率。随着生物技术的发展，一些可以提高产量的基因被发现和利用。水稻在含有纯合osdep1基因时，单株产量比对照提高40％[1]。osgw5可以调控籽粒宽度来提高粒重和产量[2]。可以导致植株半矮化的della突变体，在绿色革命中被广泛用来提高收获指数(harvestindex)[3]。沉默zmnac7可以提高玉米生物量，因此提高玉米产量[4]。根据经典产量模型，产量＝源×收获指数，源的提高可以大大提高产量；源往往指地上部分生物量。其中一个例子是，水稻pyl1/4/6突变体增加了地上部分生物量，进而增加了产量[5]。脱落酸是一种植物生长调节激素，干旱条件下在根部产生并富集，通过导管进入叶片调控水势或是抗氧化能力。另外有研究表明，叶片中也可以产生脱落酸。脱落酸一般通过结合其受体并改变受体同蛋白磷酸酶的相互作用，进而调控下游磷酸激酶的磷酸化状态，激活依赖脱落酸的信号通路。脱落酸受体pyr/pyl/rcar是一类结合脱落酸的蛋白，或是单体形式，或是双体模式。在拟南芥中，有15种脱落酸受体；在小麦中，有9种脱落酸受体。脱落酸可以调节生长和胁迫相应的平衡；外源施加脱落酸可以提高浮萍的生物量[6]。水稻中三突变pyl1/4/6可以提高产量，但造成突变体对干旱胁迫更加敏感[5]。这种干旱敏感性在水稻上不是个问题，因为水稻整个生长季都有水；但是对于小麦，玉米，大豆之类的作物来讲，干旱会时常发生。技术实现要素：总体而言，本发明通过过表达的方法，验证了一些玉米脱落酸受体可以增加作物生物量，进而提高作物产量；并且可以在不影响水利用效率情况下，提高作物生物量。特别地，本发明涉及一种提高植物的生物量并由此提高产量的方法，其包括在所述植物中过表达编码脱落酸受体的多核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，所述脱落酸受体是所述植物自身的脱落酸受体或者其他物种的脱落酸受体。在一个优选的实施方案中，过表达出一种或多种脱落酸受体。在一个优选的实施方案中，所述脱落酸受体的氨基酸序列选自seqidno:2和4。在一个优选的实施方案中，所述编码脱落酸受体的多核苷酸序列选自seqidno:1和3。在一个优选的实施方案中，所述过表达由植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子来驱动。在一个进一步优选的实施方案中，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子przmubi1，其序列显示在seqidno:5中。在一个进一步优选的实施方案中，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子pract1，其序列显示在seqidno:6中。在一个优选的实施方案中，所述过表达由植物诱导型启动子或植物器官特异性启动子来驱动。在一个进一步优选的实施方案中，所述植物诱导型启动子为seqidno:28中所示的拟南芥干旱诱导启动子pratrd29a或其他干旱诱导启动子。在一个进一步优选的实施方案中，所述植物器官特异性启动子为seqidno:27中所示的绿色器官特异性启动子prospsi33kd、seqidno:29中所示的气孔特异性启动子prat1g22690或类似的启动子。在一个优选的实施方案中，所述过表达通过调控dna甲基化或者组蛋白修饰或者可变剪切来实现。在一个优选的实施方案中，所述过表达通过基因编辑的方法来实现。在一个优选的实施方案中，所述植物选自由下列各项组成的组：玉米、小麦、水稻、高粱、拟南芥、大豆、番茄、向日葵、菠菜和油菜。在一个优选的实施方案中，所述方法提高作物幼苗期的苗势。在一个优选的实施方案中，所述方法提高青储玉米生物量。附图说明图1显示了zmpyl-c双元载体的图谱。图2显示了zmpyl-h双元载体的图谱。序列表信息seqidno:1为czmpyl-c(编码框序列)。seqidno:2为czmpyl-c(蛋白序列)。seqidno:3为czmpyl-h(编码框序列)。seqidno:4为czmpyl-h(蛋白序列)。seqidno:5为przmubi1(玉米泛素启动子)。seqidno:6为pract1(水稻肌动蛋白启动子)。seqidno:7为tubi1(玉米泛素终止子)。seqidno:8为prhvlpt2(大麦糊粉层特异脂转移蛋白启动子)。seqidno:9为cred(红色荧光蛋白基因)。seqidno:10为tpi-15(西红柿蛋白酶抑制因子ii终止子)。seqidno:11为cpat(大豆密码子优化的草胺膦乙酰转移酶基因)。seqidno:12为t35s(花椰菜花叶病毒35s终止子)。seqidno:13为cpmi(6-磷酸甘露糖异构酶基因)。seqidno:14为tnos(农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子)。seqidno:15为zmadh1正向引物。seqidno:16为zmadh1反向引物。seqidno:17为zmadh1探针。seqidno:18为pmi正向引物。seqidno:19为pmi反向引物。seqidno:20为pmi探针。seqidno:21为red正向引物。seqidno:22为red反向引物。seqidno:23为red探针。seqidno:24为zmef正向引物。seqidno:25为zmef反向引物。seqidno:26为zmef探针。seqidno:27为prospsi33kd(水稻光合作用中心i的33kd基因启动子)。seqidno:28为pratrd29a(拟南芥干旱相应基因29a启动子)。seqidno:29为prat1g22690(拟南芥赤霉素调控基因启动子)。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.在玉米中过表达来自玉米的脱落酸受体1.1.双元载体构建选取单个受体的编码框序列(表1)，设计双端带有bsmbi酶切位点，并在金斯瑞(genscript)合成。bsmbi酶切后连入经bamhi/spei片段化的中间载体上。壮观霉素阳性克隆(spec+)通过pvui/noti酶切验证。正确的克隆进一步通过测序验证连接处无误。玉米泛素启动子(seqidno:5)用于脱落酸受体的表达。参见图1-2。表1.玉米脱落酸受体脱落酸受体编号基因转录本zmpyl-cgrmzm2g169695grmzm2g169695_t01zmpyl-hgrmzm2g048733grmzm2g048733_t011.2.玉米的农杆菌转化实验中玉米转化品种为jhax。采用农杆菌转化方法，具体操作见参考文献[7]。载体中含有6-磷酸甘露糖异构酶基因(pmi，seqidno:13)表达盒作为植物中的筛选标记；选择pmi阳性的植株进行拷贝数分析(采用seqidno:18-20所示的引物和探针)。1.3.t0代转基因拷贝数鉴定从每个pmi阳性苗收集10毫克叶片，采用改进的tris-sds法提取基因组dna[8]。内参基因和目的基因的taqman引物和探针均利用美国appliedbiosystem公司的primerexpress3.0软件设计，并由invitrogen公司合成，序列信息见表2和表3。表2.内参基因实时荧光定量pcr的引物和探针序列(拷贝数)表3.目的基因实时荧光定量pcr的引物和探针序列(拷贝数)将带有1个拷贝转基因的t0植株移栽到温室(表4)。表4.转基因拷贝数分析1.4.t2代种子繁育带有1个拷贝转基因的t0在温室中自交产生t1代种子。通过taqman检测转基因拷贝数(同1.3)，保留带有1个拷贝转基因的t1代植株。t1转基因植株开花时，人工去雄；用野生型jhax花粉授雌穗产生t2代种子(表4)。t2种子会分离出转基因阳性植株和非转基因植株，t2代植株用于表型分析。实施例2.过表达zmpyl-c提高了玉米苗期生物量，并不影响对于干旱的敏感性。通过种子糊粉层的红色荧光标记(red，其基因序列如seqidno:9所示)，将转基因和非转基因t2代种子各挑出20粒。准备9cm×9cm的方盆，装入类似重量的培养土。t2种子直播在方盆中间位置，1厘米深。正常浇水和施肥直到长至v3期。收获地上部分，烘干至恒重，测定生物量，利用t-test进行统计分析。过表达zmpyl-c显著提高了苗期生物量的积累(表5)。表5.过表达zmpyl-c同对照生物量比较水利用效率(wateruseefficiency)是积累单位重量干物质所需要的水量；需要的水量越少，反应了植物避旱能力的提高。在干旱初期和/或轻度干旱下，避旱能力越强，可以使植物更好的应对干旱胁迫。通过种子糊粉层的红色荧光标记(red)，将转基因和非转基因t2代种子各挑出50粒。准备9cm×9cm的方盆，装入类似重量的培养土。t2种子直播在方盆中间位置，1厘米深。正常浇水和施肥直到长至v3期。选中大小相近的30个转基因植株和30个非转基因植株；满水放置2小时后，用塑料盖封盖，然后控水干旱。剩余的苗，收获地上部分，称量起始鲜重(initialfw)和起始干重(initialdw)。干旱处理前，称取盆和植株总重量；7天控水后，再称取盆和植株总重；两者之差就是累计水利用量。同时收获植株地上部分并称量最终鲜重(finalfw)和最终干重(finaldw)。总用水量＝累计水利用量–(最终鲜重–起始鲜重)，水利用效率＝总水利用/(最终干重–起始干重)。利用t-test进行统计分析。基于显著性分析(p值小于0.05)，过表达zmpyl-c不影响水利用效率(表6)，即没有提高或是降低抗旱能力。综上，过表达zmpyl-c可以提高苗期生物量，进一步提高产量；同时不影响对干旱的敏感性。表6.过表达zmpyl-c同对照水利用效率比较实施例3.过表达zmpyl-h提高了提高了玉米苗期生物量，并不影响对于干旱的敏感性。通过同样的验证方法，过表达zmpyl-h可以显著提高苗期生物量(表7)，而不影响干旱敏感性(表8)。表7.过表达zmpyl-h同对照生物量比较表8.过表达zmpyl-h同对照水利用效率比较结论：通过过表达脱落酸受体，可以提高植物生物量，进而提高产量；同时不会影响对干旱的敏感性。过表达单个脱落酸受体或是多个受体，可以显著提高生物量并由此提高产量。参考文献[1]huangx,qianq,liuz,sunh,hes,luod,xiag,chuc,lij,fux.naturalvariationatthedep1locusenhancesgrainyieldinrice.natgenet.2009apr；41(4):494-7.[2]liuj,chenj,zhengx,wuf,linq,hengy,tianp,chengz,yux,zhouk,zhangx,guox,wangj,wangh,wanj.gw5actsinthebrassinosteroidsignalingpathwaytoregulategrainwidthandweightinrice.natplants.2017apr10；3:17043.[3]serrano-mislataa,bencivengas,bushm,schiesslk,bodens,sablowskir.dellagenesrestrictinflorescencemeristemfunctionindependentlyofplantheight.natplants.2017sep；3(9):749-754.[4]zhangj,fenglerka,vanhemertjl,guptar,mongarn,sunj,allenwb,wangy,weersb,moh,lafitter,houz,bryanta,ibraheemf,arpj,swaminathank,moosesp,lib,shenb.identificationandcharacterizationofanovelstay-greenqtlthatincreasesyieldinmaize.plantbiotechnolj.2019apr29.doi:10.1111/pbi.13139.[5]miaoc,xiaol,huak,zouc,zhaoy,bressanra,zhujk.mutationsinasubfamilyofabscisicacidreceptorgenespromotericegrowthandproductivity.procnatlacadsciusa.2018jun5；115(23):6058-6063.[6]liuy,chenx,wangx,fangy,huangm,guol,zhangy,zhaoh.improvingbiomassandstarchaccumulationofbioenergycropduckweed(landoltiapunctata)byabscisicacidapplication.scirep.2018jun22；8(1):9544.[7]ishiday,hieiy,komarit.agrobacterium-mediatedtransformationofmaize.natprotoc.2007；2(7):1614-21.[8]lih,lij,congxh,duanyb,lil,weipc,luxz,yangjb.improvementofagrobacterium-mediatedtransformationinhi-iimaize(zeamays)usingstandardbinaryvectors.plantcellrep.2008feb；27(2):297-305.序列表<110>先正达农作物保护股份公司(syngentacropprotectionag)先正达生物科技（中国）有限公司(syngentabiotechnologychinaco.,ltd.)<120>通过过表达脱落酸受体来提高植物生物量并由此提高产量的方法<130>81879-cn-reg-org-nat-1<141>2019-09-02<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>702<212>dna<213>人工序列<220><223>czmpyl-c（编码框序列）<400>1atgagagagagaaacagctcgatcgatcaagaacaccaacgaggctctagctccagatcg60acaatgccgttcgcagcctcaaggacgtcacagcagcagcacagccgtgtggccaccaac120gggagggccgtggcggtgtgcgcgggtcacgcgggcgtgcccgacgaggtggcgcggcac180cacgagcacgctgtggcagcggggcaatgctgcgccgccatggtgcagtccatcgcagcg240ccggtggacgcggtgtggtcgctggtgcgtcgcttcgaccagccgcagcggtacaagcgc300ttcatcaggagctgccacctcgtggacggcgacggcgccgaggtggggtccgtgcgggag360ctcctgctcgtgtccgggctgcccgccgagagcagccgcgagcggcttgagatccgggac420gacgagcggcgggtgatcagcttccgggtcctgggcggcgaccaccgcctggccaactac480cgctccgtgaccaccgtgcacgaggcggcgccgtcgcaggacgggcgcccgctcaccatg540gtcgtcgagtcctacgtggtggacgtgccgccggggaacaccgtcgaggagacgcgcatc600ttcgtggacaccatcgttcggtgcaacctccagtccctcgagggcacggtcatcaggcag660ctggagatcgcggcaatgccgcacgacgacaaccagaactga702<210>2<211>233<212>prt<213>人工序列<220><223>czmpyl-c（蛋白序列）<400>2metarggluargasnserserileaspglngluhisglnargglyser151015serserargserthrmetprophealaalaserargthrserglngln202530glnhisserargvalalathrasnglyargalavalalavalcysala354045glyhisalaglyvalproaspgluvalalaarghishisgluhisala505560valalaalaglyglncyscysalaalametvalglnserilealaala65707580provalaspalavaltrpserleuvalargargpheaspglnprogln859095argtyrlysargpheileargsercyshisleuvalaspglyaspgly100105110alagluvalglyservalarggluleuleuleuvalserglyleupro115120125alagluserserarggluargleugluileargaspaspgluargarg130135140valileserpheargvalleuglyglyasphisargleualaasntyr145150155160argservalthrthrvalhisglualaalaproserglnaspglyarg165170175proleuthrmetvalvalglusertyrvalvalaspvalproprogly180185190asnthrvalglugluthrargilephevalaspthrilevalargcys195200205asnleuglnserleugluglythrvalileargglnleugluileala210215220alametprohisaspaspasnglnasn225230<210>3<211>576<212>dna<213>人工序列<220><223>czmpyl-h（编码框序列）<400>3atggtggtggagatggacggaggcgtgggagtagcagcagcaggaggaggaggagcgcag60acgccggcgccgccgccgccgcggcggtggcgcttggcggacgagcggtgcgacctgcgc120gccatggagacggactacgtgcggcggttccaccggcacgagccccgcgaccaccagtgc180tcctccgccgtcgccaagcacatcaaggcgcctgtccaccttgtctggtccctggtgagg240cggttcgaccagccacagctcttcaagcccttcgtgagccggtgtgagatgaaggggaac300atcgagatcggtagcgtcagggaggtcaacgtcaagtccgggctgccggccacaagaagc360acggagaggctcgagctgttagacgacgacgagcgcattctcagcgtcaggttcgttgga420ggcgatcacaggctgcaggtatgctctgttcttcatctatctatattctgtgctgcccat480gcgagatattttgcccaccacctcaaatgcgtcctggagttcctctgccagatgcatctt540gatgtgctgccctgcgacgatgccatcctcgagtga576<210>4<211>191<212>prt<213>人工序列<220><223>czmpyl-h（蛋白序列）<400>4metvalvalglumetaspglyglyvalglyvalalaalaalaglygly151015glyglyalaglnthrproalaproproproproargargtrpargleu202530alaaspgluargcysaspleuargalametgluthrasptyrvalarg354045argphehisarghisgluproargasphisglncysserseralaval505560alalyshisilelysalaprovalhisleuvaltrpserleuvalarg65707580argpheaspglnproglnleuphelysprophevalserargcysglu859095metlysglyasnilegluileglyservalarggluvalasnvallys100105110serglyleuproalathrargserthrgluargleugluleuleuasp115120125aspaspgluargileleuservalargphevalglyglyasphisarg130135140leuglnvalcysservalleuhisleuserilephecysalaalahis145150155160alaargtyrphealahishisleulyscysvalleuglupheleucys165170175glnmethisleuaspvalleuprocysaspaspalaileleuglu180185190<210>5<211>1993<212>dna<213>人工序列<220><223>przmubi1（玉米泛素启动子）<400>5ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtcta60agttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatcta120tctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataa180tatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattga240gtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctccttttt300ttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagg360gtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctatttt420agcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagata480taaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaa540aactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcga600cgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagca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