Hox32基因在提高植物对重金属汞的耐受性中的应用的制作方法

本申请涉及转基因应用领域，尤其涉及hox32基因在提高植物对重金属汞的耐受性中的应用。

背景技术：

重金属污染问题日益严重，目前我国污水灌溉及废弃物等对农田己造成大面积的土壤污染。据统计，我国污灌区遭受重金属汞污染的稻田涉及个15省市自治区，生产的稻米中汞含量超过国家食品卫生标准。在汞污染地区，糙米中汞总含量最高可达145mg/kg，有机汞的含量可达117mg/kg。汞的迁移转化是在陆、水、空三者之间发生，大气中气态和颗粒态的随风飘散，一部分通过湿沉降或干沉降落到地面或水体中土壤中的可挥发进入大气，也可以被水冲淋进入地面水和渗透入地下水中地面水中的一部分由于挥发而进入大气，大部分则沉淀进入底泥。环境中的汞绝大部分是人为因素所致，包括工业废气、废水、废渣的排放,农业污水灌溉、污泥施肥、医疗和城市垃圾、焚烧等(刘麒麟等，令人担忧的医用汞污染[j].中国医药指南.2011.7.no.21.204～205.)。

水稻(oryzasatival.)是世界上最重要的农作物，全球一半以上的人口以稻米为主食。重金属一旦进入土壤—作物系统就很难排除，所以水稻重金属污染问题已经引起全球各个国家相关部门的高度重视。重金属不仅对水稻造成毒害并使其减产，而且沿着食物链逐级往上传递，由于其不易水解和生物难分解的特性，重金属易被植物吸收并积累在一些可食用部位，最终在食物链末端的生物体中浓缩放大，严重危害人体健康(araot,aen.genotypicvariationsincadmiumlevelsofricegrain.soilsciplantnutr,2003,49:473-479；horiguchih,teranishih,niiyak,aoshimak,katoht,sakuragawan,kasuyam.hypoproductionoferythropoietincontributestoanemiainchroniccadmiumintoxication:clinicalstudyonitai-itaidiseaseinjapan.archtoxicol,1994,68:632-636)。重金属污染已经成为我国生产安全(无公害)稻米的关键影响因素。因此，如何降低稻米中重金属积累、实现稻米的安全生产成为了一项亟需解决的课题。深入研究重金属吸收、转运及积累机制，对保障农产品和生态安全以及人民身体健康都具有重要及深远的意义。

hox32是水稻重要的一个转录因子，参与调控水稻叶型等生长发育过程。lietal.(2016)发现过表达hox32转基因株系hox32-ov产生向近轴面卷曲的窄叶，组织学分析表明hox32-ov株系中泡状细胞数目减少，此外，叶夹角减小导致株型直立。(ying-yingli；aoshen；weixiong；qiong-linsun；qianluo；tingsong；zheng-longli；wei-jiangluan.overexpressionofoshox32resultsinpleiotropiceffectsonplanttypearchitectureandleafdevelopmentinrice.rice,2016,9:46)。本申请研究发现hox32过表达还可以提高水稻对重金属汞的耐受性。

技术实现要素：

为此，本申请的一个目的是提供一种hox32基因cds片段，其序列如seqidno.1所示。

本申请的另一个目的是提供一种扩增所述的基因片段的引物对，该引物对的序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本申请的另一个目的是提供一种载体，其中含所述的基因片段。

优选，所述的载体进一步由如下方法构建而来，连接pmd19-t载体并进行kpnⅰ/bamhⅰ双酶切验证，将克隆连接入p1300gfp载体，kpnⅰ/bamhⅰ双酶切体系鉴定hox32过表达载体p1300gfp-hox32。

本申请的另一个目的是提供一种含有所述的载体的农杆菌菌株。

本申请的另一个目的是提供seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株在提高植物对重金属汞的耐受性中的应用。

本申请的另一个目的是提供seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株在培育提高重金属汞的耐受性植物中的应用。

本申请的另一个目的是提供seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株在调控重金属汞的耐受性中的应用。

本申请的另一个目的是提供seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株在调控植物对重金属汞的吸收和转运中的应用。

本申请的另一个目的是提供seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株在土壤重金属汞污染修复中的应用。

优选，所述的应用，其中所述植物为水稻。

本申请的另一个目的是提供一种培育提高重金属汞的耐受性的转基因植物的方法，该方法将seqidno.4所示hox32基因，所述的hox32基因cds片段，所述的载体或所述的农杆菌菌株导入植物中，获得提高重金属汞的耐受性的转基因植物。

优选，所述的方法，其中所述植物为水稻。

本申请的另一个目的是提供一种培育提高重金属汞的耐受性的水稻的方法，该方法包括以下的步骤：

(1)hox32过表达载体构建

①提取水稻根rna，逆转录为cdna；以水稻根cdna为模板，利用权利要求2的引物对扩增水稻hox32基因的cds序列；

②将pcr片段割胶回收，连入克隆载体pmd-19t，菌液pcr验证后送金斯特公司测序，得到序列正确的克隆载体pmd19-hox32；

③kpnⅰ/bamhⅰ双酶切目的片段和载体质粒p1300-gfp；

④酶切产物与p1300gfp载体按照体积比为5:1进行连接；连接产物转化大肠杆菌，pcr和酶切验证，阳性克隆经测序和序列比对后得到构建完成的hox32基因过表达载体p1300gfp-hox32；

⑤将构建好的过表达载体质粒导入根癌农杆菌感受态细胞，农杆菌菌液pcr验证得到含有过表达重组质粒的农杆菌菌株；

(2)hox32过表达载体的水稻转基因

①胚性愈伤组织的诱导和继代培养

将水稻灌浆期稻穗取回脱粒，种子置于500ml烧杯中，种子数量约为烧杯体积的1/3，70％酒精消毒2min，倒掉酒精加入500ml25％次氯酸钠溶液，滴入2-3滴吐温-20，抽真空浸泡90min，在超净工作台上倒去溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5次；在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，接种于诱导培养基中，封好膜后28℃/暗培养7d；在超净台上将已经诱导出的愈伤组织去芽，然后置于继代培养基中相同条件继续培养7d；

②感菌与共培养

共培养前一周将含有重组质粒的农杆菌菌株划ym+50mg/lkan，40mg/lrif平板进行活化，提前2-3d挑取单菌落在新的含有抗生素的ym平板上再次化菌，一个单克隆菌落划一条；用金属药匙收集平板上的菌条，置于30ml悬浮侵染培养基中，并使该悬浮菌液od600＝0.01；挑选淡黄色、致密、大小合适的愈伤组织颗粒放入农杆菌悬浮菌液中侵染30min，取出愈伤组织在无菌滤纸上微晾20-30min，置于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃/暗培养3d；

③抗性愈伤组织的筛选

共培养后的愈伤组织首先依次用无菌水和含500mg/l头孢拉定的无菌水清洗3-5次，然后置于无菌滤纸上晾干，最后将它们转入抗性筛选培养基上，28℃/暗培养；14d后将能够长出抗性愈伤的愈伤组织移至新的筛选培养基上，28℃/光照培养14d，直到能够长出淡黄致密的抗性愈伤；

④抗性愈伤组织的分化和生根

将经过筛选后颜色鲜黄有抗性的愈伤组织转入分化培养基中，密度保持在每支试管3-4粒或每瓶5-7粒，封好膜后于28℃/恒温昼夜交替培养15-30d至分化成苗，将长至1cm左右的分化苗放入生根培养基中培养；

⑤转基因植株的炼苗和移栽

挑选根部生长较好的转基因苗置于蒸馏水或无菌水的试管中，炼苗3-7d后移栽至温室中土培并进行检测。

附图说明

图1为takara试剂盒操作流程简图。

图2为hox32在水稻不同发育时期和不同器官中的表达特征。

图3为hg胁迫下水稻根中hox32的表达特征。

图4为hox32过表达载体的构建图。

图5为hox32过表达水稻中hox32基因的荧光定量pcr筛选。

图6为在汞胁迫下野生型水稻及hox32过表达转基因株系的表型变化。

图7为汞处理对野生型水稻及hox32过表达转基因株系叶片h2o2含量的影响。

图8为汞处理对野生型水稻及hox32过表达转基因株系叶片mda含量的影响。

具体实施方式

一、hox32过表达转基因水稻阳性株系获取

1、hox32过表达载体构建及水稻转基因

1.1hox32过表达载体构建

①提取水稻根rna，逆转录为cdna。以水稻根cdna为模板，利用表1中的引物扩增水稻hox32基因的cds序列，pcr扩增体系如表2所示。扩增扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，72℃再延伸10min，最后4℃保存。

表1pcr扩增hox32基因序列引物

表2hox32基因的pcr扩增反应体系

②将pcr片段割胶回收，连入克隆载体pmd-19t，菌液pcr验证后送金斯特公司测序，得到序列正确的克隆载体pmd19-hox32；

③kpnⅰ/bamhⅰ双酶切目的片段和载体质粒p1300-gfp，双酶切体系如表3所示；

表3kpnⅰ/bamhⅰ双酶切体系

④酶切产物与p1300gfp载体按照体积比为5:1进行连接。连接产物转化大肠杆菌，pcr和酶切验证，阳性克隆经测序和序列比对后得到构建完成的hox32基因过表达载体p1300gfp-hox32；

⑤将构建好的过表达载体质粒导入根癌农杆菌感受态细胞，农杆菌菌液pcr验证得到含有过表达重组质粒的农杆菌菌株。

1.2hox32过表达载体的水稻转基因

1)胚性愈伤组织的诱导和继代培养

将水稻灌浆期稻穗取回脱粒，种子置于500ml烧杯中(种子数量约为烧杯体积的1/3)，70％酒精消毒2min，倒掉酒精加入500ml25％次氯酸钠溶液(滴入2-3滴吐温-20)，抽真空浸泡90min，在超净工作台上倒去溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5次。在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，接种于诱导培养基中，封好膜后28℃/暗培养7d。在超净台上将已经诱导出的愈伤组织去芽，然后置于继代培养基中相同条件继续培养7d。

2)感菌与共培养

共培养前一周将含有重组质粒的农杆菌菌株划ym(+50mg/lkan，40mg/lrif)平板进行活化，提前2-3d挑取单菌落在新的含有抗生素的ym平板上再次化菌，一个单克隆菌落划一条。用金属药匙收集平板上的菌条，置于30ml悬浮侵染培养基中，并使该悬浮菌液od600＝0.01。挑选淡黄色、致密、大小合适的愈伤组织颗粒放入农杆菌悬浮菌液中侵染30min，取出愈伤组织在无菌滤纸上微晾(20-30min)，置于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃/暗培养3d。

3)抗性愈伤组织的筛选

共培养后的愈伤组织首先依次用无菌水和含500mg/l头孢拉定的无菌水清洗3-5次，然后置于无菌滤纸上晾干，最后将它们转入抗性筛选培养基上，28℃/暗培养。14d后将能够长出抗性愈伤的愈伤组织移至新的筛选培养基上，28℃/光照培养14d，直到能够长出淡黄致密的抗性愈伤。

4)抗性愈伤组织的分化和生根

将经过筛选后颜色鲜黄有抗性的愈伤组织转入分化培养基中，密度保持在每支试管3-4粒或每瓶5-7粒，封好膜后于28℃/恒温昼夜交替培养15-30d至分化成苗，将长至1cm左右的分化苗放入生根培养基中培养。

5)转基因植株的炼苗和移栽

挑选根部生长较好的转基因苗置于蒸馏水或无菌水的试管中，炼苗3-7d后移栽至温室中土培并进行检测。

4汞胁迫下水稻生理指标测定方法

1)h2o2测定

取0.1g水稻叶片样品，加入3ml预冷的磷酸钾buffer(即pbs，50mm,ph6.5)，冰浴研磨。匀浆液以6000g，4度离心25min,上清即为h2o2提取液。加入1ml0.1％氯化钛(含20％h2so4)。混合液以6000g，4度离心15min。取上清测定波长410nm的od，消光系数0.28umol^-1cm^-1

2)mda

参照huang等(2004)的方法的测定。称取0.1g水稻叶片在液氮中研磨成粉末状，用3ml预冷的提取缓冲液匀浆(50mmpbsph7.0，3mmdtt，1mmedta-na2，5％pvp)。匀浆物以4000×g离心10min，上清液为样品提取液。

取上清液1ml加入3ml27％三氯乙酸和1ml2％硫代巴比妥酸，混合物沸水浴(95度)保温30min(有的是15min)，冰浴上迅速冷却后，15000×g离心10min，在分光光度计上分别于450nm、532nm、600nm处测定上清液的od值。mda的浓度按照如下公式计算：mda(μmoll^-1)＝6.45×(od532-od600)-0.56×od450。

二、研究材料与方法

1.实验材料和生长条件

野生型水稻(oryzasativa，zhonghua11，简称zh11)作为对照组，把hox32过表达转基因水稻阳性株系(l8；l9)作为实验组。野生型和转基因株系种子在28℃萌发3天，萌发后播种到网格上置于28℃，13小时光照、22℃，11小时黑暗，相对湿度为70％的培养箱中，用一半浓度的kimurab溶液进行水培预培养。14天后换成全营养液进行培养。溶液每三天更换一次。培养至8周时在hgcl2处理14d后，观察并比较转基因株系与野生型zh11水稻植株在汞处理前后的表型，并进行相关生理分子分析。

2.基因的表达特性分析

1)水稻样品总rna的提取：用takara的rna提取试剂盒提取各个不同水稻样品中的总rna

2)rna样品的逆转录

采用takara第一链cdna合成试剂盒primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser进行rna逆转录。在depc处理的离心管内将试剂按表4所示混合均匀。按下列条件(表5)进行逆转录反应。

表4rna样品的逆转录

表5pcr反应温度和时间

3)实时荧光定量pcr

采用rotorgeneq及时荧光定量pcr仪，对hox32表达水平进行检测以获得相应的数据并进行分析。对于每一个cdna样品进行3次重复实验。pcr采用sybrpremixextaq^tm(takara,japan)，并以β-actin作为内参。反应体系见表6；反应程序见表7。

表6实时荧光定量pcr反应体系

表7实时荧光定量pcr反应温度和时间

表8rt-pcr引物序列

三、实验结果

1、hox32基因的时空表达特性分析：

利用qrt-pcr检测hox32在野生型水稻zh11不同生长时期和不同器官中的表达量。如图2所示，在苗期和分蘖期，hox32表达规律相似，主要在叶片中表达且在分蘖期叶中表达量高于其他时期；穗分化期，hox32在茎和剑叶中表达量较高；抽穗期，hox32主要在根中表达且含量明显高于其他时期；在灌浆期，hox32主要在节中表达；在成熟期，hox32主要在茎和节以及叶中表达。且hox32在抽穗期、灌浆期及成熟期在节中的表达量显著高于其他时期。

2、hg胁迫下水稻中hox32的表达特征分析

如图3所示，4周龄的zh11幼苗在hgcl2处理后，于0h、1h、3h、6h、12h、24h分别取水稻根，提rna、逆转录后进行qrt-pcr检测，分析hox32在hg处理不同时间点的表达量变化。hg处理前12h，hox32表达量缓慢上升趋势，且在12h后急剧上升。

3、hox32过表达载体的构建及水稻转基因：

pcr扩增hox32基因cds片段，连接pmd19-t载体并进行kpnⅰ/bamhⅰ双酶切验证。将克隆连接入p1300gfp载体，kpnⅰ/bamhⅰ双酶切体系鉴定hox32过表达载体p1300gfp-hox32，农杆菌菌液pcr验证得到含有过表达重组质粒的农杆菌菌株。pcr反应、双酶切验证电泳过程见图4。将构建好的载体采用农杆菌遗传介导的方法转入水稻中花11，获得转基因植株t1代后，提取叶片rna，逆转录为cdna，如图5，采用荧光定量方法检测hox32基因的表达，筛选得到l8、l9为相对表达量较高的转基因株系。

4、hox32过表达转基因水稻对汞胁迫的响应分析：

选取hox32水稻转基因植株经潮霉素筛选后，选取长势一致的hox32过表达阳性植株(l8、l9)和野生型植株用hgcl2处理后，hox32过表达植株与野生型zh11相比，苗长势较好，比较健壮，绿色叶片更多，丙二醛mda和h2o2的增加程度较低。这说明在汞胁迫条件下，转基因植株所受到的氧化胁迫程度和膜过脂化程度较低，hox32过表达可以在一定程度上提高水稻对汞胁迫的耐受性(图6-8)。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国计量大学

<120>hox32基因在提高植物对重金属汞的耐受性中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2580

<212>dna

<213>水稻(oryzasatival.)

<400>1

atggcggcggcgatggtggcggcggtgcatggagtggggaggcaggacaggtcgtcgcct60

ggcggcggaggggcgccgcaagtggacacgggcaagtacgtgcgctacaccccggagcag120

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<210>2

<211>29

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>2

ggggtaccggagaagggtcgacggggatg29

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>3

cgggatccgacgaatgaccagttgacgaac30

<210>4

<211>3136

<212>dna

<213>水稻(oryzasatival.)

<400>4

gcttcccctgtccaccactattaaaccaacccccaccccttctctctcctcctctaccgt60

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cagcagttctgagaacatttagtcagaggctaagcagaggcttcaatgatgctgtcaatg1620

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