拟斯卑尔脱山羊草Pm6SS-1基因及其分子标记和应用的制作方法

本发明涉及一种拟斯卑尔脱山羊草基因pm6ss-1及其分子标记和应用，属于基因工程领域。

背景技术：

小麦白粉病是由小麦白粉菌（blumeriagraminisf.sp.tritici）引起的真菌性病害，是影响小麦生产的主要病害之一。发掘抗病基因、培育抗病品种是控制小麦白粉病最经济、有效、环保的途径。长江中下游地区是我国小麦主产区之一，也是我国小麦白粉病发病最严重的地区之一，近年来，白粉菌毒性小种的逐渐增强，目前，在抗白粉病基因的利用和布局上呈现严重单一化趋势，这将使白粉菌面临极大选择压，加速白粉菌生理小种变异，使pm21基因面临随时抗性丧失的风险。已有报道称，携带pm21基因的小麦品种在一些地区可被白粉菌侵染。通过簇毛麦pm21等位基因的克隆及进化分析发现，pm21等位基因序列高度一致，但起病原菌识别作用的lrr结构域中溶剂暴露面氨基酸残基的ka/ks比值为4.02，表明这些残基处于分化选择下，该结果与小种特异性抗性基因pm3的情况极为相似（ka/ks=3.4）。大规模突变分析也表明，单碱基变异容易导致pm21丧失抗性。抗白粉病基因pm12来自小麦近缘物种拟斯卑尔脱山羊草（基因组为s），位于第6号染色体的短臂（6ss），对小麦白粉菌具有广谱、高效的抗性，是少数优异的抗白粉病基因之一。在1996年有研究者将pm12导入小麦背景，形成遗传种质wembleyline#31，但是，由于连锁累赘的存在，pm12基因至今未能在生产上得到利用。

因此，利用其他有效的抗白粉病基因，对于平衡基因布局、延长珍贵基因使用年限、有效控制白粉病危害、保障国家粮食安全具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术缺陷之一，提供一种来源于拟斯卑尔脱山羊草的抗白粉病基因pm6ss-1及其用途。

本发明为达到上述技术目的，采用如下技术手段实现：

本发明首先提供pm6ss-1基因，来自于拟斯卑尔脱山羊草，所述基因的dna序列如seqidno.1所示，对应的cdna序列如seqidno.2所示。

本发明还提供所述pm6ss-1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.3。

本发明还提供一种重组表达载体，所述载体包含seqidno.2所示的pm6ss-1基因cdna。

本发明通过转基因小麦研究表明，pm6ss-1基因能够显著提高小麦对白粉病的抗性。所述拟斯卑尔脱山羊草的抗白粉病基因pm6ss-1可应用于遗传改良小麦品种提高小麦的白粉病抗性。本发明还针对pm6ss-1基因的启动子序列seqidno.4开发了功能性分子标记mbh2，用于特异性检测权利要求所述的基因pm6ss-1，可应用于pm6ss-1基因的分子标记辅助育种。

所述特异性pcr扩增分子标记mbh2的上游和下游引物序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示。

所述的分子标记可以用于检测作物中pm6ss-1基因和/或pm21基因；或用于筛选或鉴定小麦抗白粉病品种。

本发明的有益效果：

本发明提供的拟斯卑尔脱山羊草的抗白粉病基因pm6ss-1的基因序列为国内外首次报道。

本发明从小麦遗传种质wembleyline#31的6ss染色体上克隆了一个抗白粉病基因pm6ss-1，编码螺旋卷曲－核苷酸结合位点－富含亮氨酸重复（cc-nbs-lrr）类抗病蛋白，病毒诱导的基因沉默分析表明pm6ss-1是抗性必需基因，转基因分析表明，含pm6ss-1基因的转基因小麦具有广谱、高效的抗白粉病功能，在小麦抗白粉病育种中具有重要的应用价值。烟草叶片细胞瞬时表达分析显示，pm6ss-1基因和pm21基因在cc结构域引发的细胞死亡模式上存在明显差异，可见pm6ss-1基因在小麦抗白粉病育种中具有独特的价值。本发明还开发了pm6ss-1基因的功能性分子标记mbh2，在群体中不仅能追踪pm6ss-1基因，还能有效区分pm12和pm21基因提供的白粉病抗性，可应用于这两个基因的分子标记辅助育种。

附图说明

图1：pm6ss-1基因的编码区结构；pm6ss-1基因具有三个外显子（1-407，507-899，1751-3689）和两个内含子（408-506，900-1750），图中灰色框表示为外显子，折线表示为内含子。

图2：pm6ss-1基因的沉默分析结果；图中从左至右依次为：接种bsmv:00（不含外源

基因片断）的对照，3个接种bsmv:pm6ss-1as（含反向插入的pm6ss-1的基因片断）的测试组，测试组出现肉眼可见的白粉菌孢子堆。

图3：pm6ss-1基因的转基因分析结果；图中叶片从左至右依次为抗白粉病的wembleyline#31（含pm12基因），3个t1转基因株系，抗白粉病对照扬麦18（含pm21基因），感白粉病的小麦转基因受体jw1。

图4：pm6ss-1基因的mbh2分子标记分析结果；图中1为扬麦9号；2为wembleyline#31；3-12为wembleyline#31/扬麦9号f2群体中的抗白粉病单株；13-22为wembley31/扬麦9号f2群体中的感白粉病单株，箭头所示为pm6ss-1基因的722bp特异性条带。

图5：pm6ss-1基因和pm21基因的mbh2分子标记分析结果；图中1为扬麦9号；2为wembley31；3为扬麦18（含pm21基因）；4-9为wembleyline#31/扬麦18f2群体中同时携带pm6ss-1和pm21基因的单株；10-15为f2群体中只有pm6ss-1基因的单株；16-21为f2群体中只有pm21基因的单株，箭头所示分别为pm6ss-1基因的722bp特异性条带和pm21基因的653bp。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明技术方案进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的实施方式仅用于说明和解释发明，并不用于限制发明。本发明实施例中所涉及材料，无特殊说明均为常规公众可获取的。

实施例1.pm6ss-1基因的克隆

本发明所用的小麦遗传种质wembleyline#31（公知公用，由江苏里下河农业科学研究所提供；原始文献为：jia等.rflp-basedmapsofthehomoeologousgroup-6chromosomesofwheatandtheirapplicationinthetaggingofpm12,apowderymildewresistancegenetransferredfromaegilopsspeltoidestowheat.theorapplgenet.1996,92:559–565）具有拟斯卑尔脱山羊草第6号染色体大部分片段，携带抗白粉病基因pm12。本发明根据簇毛麦抗白粉病基因pm21（genbank登录号：mf370199.1）设计了一对特异性引物p1（seqidno.7）：5’-cgatgaaccccctcatcggcaagct-3’；p2（seqidno.8）：5’-cgacgcttctgaaggcagactcga-3’，利用pcr技术，从wembley31基因组中克隆了一个抗病基因片段，进而利用tail-pcr技术（liu和huang.efficientamplificationofinsertendsequencesfrombacterialartificialchromosomeclonesbythermalasymmetricinterlacedpcr.plantmolbiolrep1998，16:175–181.）获得该基因片段两侧的区域，并进行dna序列测定，拼接出一个全长的抗病基因，将其命名为pm6ss-1，测序结果表明，该基因的编码区序列为3689bp，具体序列如seqidno.1所示，pm6ss-1基因具有三个外显子（分别为407bp、393bp、1939bp）和两个内含子（分别为99bp、851bp）（见图1），pm6ss-1基因的完整开放阅读框为2739bp，如seqidno.2所述，编码的蛋白质为912aa，氨基酸序列如seqidno.3所示，属于典型的cc-nbs-lrr类抗病蛋白。

实施例2.pm6ss-1基因的沉默分析

根据实施例1中得到的pm6ss-1基因设计引物

p3（seqidno.9）：5’-cccgaattcctgcgacagctcactctag-3’）和p4（seqidno.10）：5’-ggggtcgactcaaagtttgaccacattcatag-3’），并进行pcr扩增，获得pm6ss-1基因末端的dna片段，产物经过ecori、sali双酶切后，连入bsmvγ载体，重组的γ载体、α载体、β载体（载体均为公知公用，hein等.virus-inducedgenesilencing-basedfunctionalcharacterizationofgenesassociatedwithpowderymildewresistanceinbarley.plantphysiol2005,138:2155–2164.）分别用mlui、mlui、spei进行线性化处理，接着进行体外转录合成rna，将三份rna等比例混合，形成重组病毒bsmv:pm6ss-1as，摩擦接种抗白粉病的小麦wembleyline#31的第二张叶片。病毒感染6天后接种白粉菌（公知公用），10天后肉眼观察叶片上白粉菌的发展情况。结果表明，pm6ss-1基因的沉默可使白粉菌在wembley31叶片上发展出肉眼可见的孢子堆（见图2），这表明pm6ss-1是小麦wembley31抗白粉病过程中的必需基因。

实施例3.pm6ss-1基因的转基因分析

根据实施例1中得到的pm6ss-1基因设计如下引物

p5（seqidno.11）：5’-tttcccgggcccctcggcttgagatgt-3’）和

p6（seqidno.12）：5’-cccactagtcctcttgttacataatgcagtgcct-3’，以小麦wembleyline#31的cdna为模板进行pcr扩增，获得pm6ss-1基因的cdna，经smai和spei双酶切后，连入经同样双酶切的plgy02（公知公用，由山东省农业科学研究院提供），形成重组质粒plgy02-pm6ss-1。将重组质粒plgy02-pm6ss-1导入农杆菌eha105菌株（公知公用，购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司），然后采用农杆菌介导法侵染小麦jw1（公知公用，由山东省农业科学研究院提供）的幼胚愈伤组织，经潮霉素筛选获得再生植株，经验证获得3个能稳定表达pm6ss-1基因的转基因小麦株系。采用26个不同采集地（江苏、山东、河南、河北等）的白粉菌接种转基因小麦，结果显示，转基因小麦高抗所有测试的白粉菌（见图3）。

实施例4.pm6ss-1基因的烟草叶片细胞瞬时表达分析

以所克隆的pm6ss-1基因为模板，利用pcr技术扩增pm6ss-1基因所编码的cc结构域、cc-nbs和cc-nbs-lrr（全长）的序列，各pcr产物经酶切后连入载体pcambia1300（公知公用，由河南大学生命科学学院提供），形成重组质粒。同时pcr扩增pm21基因（genbank登录号：mf370199.1）的对应序列，构建用于比较试验的重组质粒。将每个重组质粒分别导入农杆菌eha105菌株，利用注射法导入烟草叶片进行瞬时表达，注射两天后，台盼蓝染色观察和统计烟草叶片细胞的死亡情况。

结果表明，pm6ss-1基因编码的cc、cc-nbs、cc-nbs-lrr（全长蛋白）均可导致烟草细胞死亡；pm6ss-1基因的cc可以导致烟草细胞死亡，但cc-nbs、cc-nbs-lrr（全长蛋白）都不会引起细胞死亡（见表1）。一般认为，cc结构域在抗病蛋白中起到抗病信号传导的作用，该实验表明，尽管pm6ss-1基因和pm21基因具有一定的序列一致性，但两者在抗病信号传递方式或途径上存在较大差异，因此，pm6ss-1基因在小麦抗白粉病育种中具有独特的价值。

表1.pm6ss-1基因和pm21基因诱导烟草叶片细胞死亡能力的比较分析

实施例5.pm6ss-1基因的诊断性分子标记

本发明所克隆的pm6ss-1基因的启动子部分的序列为seqidno.4，根据该启动子序列开发了一个基于pcr特异性检测pm6ss-1基因的功能性分子标记，命名为mbh2，用于特异性pcr扩增分子标记mbh2的上游和下游引物序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示。

以携带pm6ss-1基因的抗白粉病小麦wembleyline#31和感白粉病小麦品种扬麦9号（公知公用，由江苏里下河地区农业科学研究所提供）进行杂交形成f1，经自交后获得f2群体，分子标记mbh2在群体的所有单株中进行扩增，pcr反应体系为：10μl反应体系中含约10-20ng模板dna，1×pcrbuffer，1.5mmoll^-1mgcl2，200mmoll^-1dntp，两条引物终浓度各为0.2μmoll^-1，0.5utaqdna聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10μl。pcr反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，55℃-60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。pcr扩增产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。

分子标记mbh2在所有抗白粉病单株中可以pcr扩增到一条722bp的特异性条带，而感病单株中没有这个条带（见图4），表明分子标记mbh2能够在群体中有效追踪pm6ss-1基因。以携带pm6ss-1基因的抗白粉病小麦wembleyline#31和携带pm21基因的抗白粉病小麦品种扬麦18（公知公用，由江苏里下河地区农业科学研究所提供）进行杂交形成f1，经自交后获得f2群体，分子标记mbh2在群体中能有效区分pm6ss-1基因（722bp特异性条带）和pm21基因（653bp特异性条带）（见图5，pcr扩增体系和扩增条件参数如上所述）。综上所述，分子标记mbh2是一个有效的诊断性分子标记，不仅能追踪pm6ss-1基因，还能在小麦背景下有效区分pm6ss-1基因和pm21基因，在分子标记辅助育种中具有实际应用价值。

序列表

<110>江苏大学

<120>拟斯卑尔脱山羊草pm6ss-1基因及其分子标记和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3689

<212>dna

<213>拟斯卑尔脱山羊草(aegilopsspeltoides)

<400>1

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<210>2

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<400>2

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