四氢呋喃型木脂素化合物及其制备方法和应用与流程

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及四氢呋喃型木脂素类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从药用植物白英全草中分离得到的5个具有相同平面结构的四氢呋喃型木脂素，包括两对对映异构体和一个内消旋体，及其在制备抗阿尔茨海默症(ad)药物方面的应用。

背景技术：

白英(solanumlyratumthunb.)为茄科茄属多年草质藤本，全草及根入药，其产于甘肃、陕西、山西、河南、山东诸省。日本、朝鲜、中南半岛也有分布。白英味苦、微寒、有小毒，其药用历史久远，最早见于《神农本草经》记载，列为上品，为传统中药。白英具有清热利湿、解毒消肿、抗癌等功能，主治感冒发热、黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、子宫糜烂、肾炎水肿等症，临床上用于治疗各种癌症，尤其对子宫颈癌、肺癌、声带癌等有一定疗效。

阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)：又叫老年性痴呆，是一种常见的中枢神经系统变性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。逐渐发生的记忆障碍(memoryimpairment)或遗忘是ad的重要特征或首发症状。ad的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。本发明选用的ad实验模型为mpp⁺诱导的sh-sy5y细胞模型。1-甲基-4-苯基吡啶离子(mpp⁺)是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，从而发挥其诱导ad的毒性作用。

技术实现要素：

本发明涉及五种从茄科茄属植物白英(solanumlyratumthunb.)中分离得到的四氢呋喃型木脂素类化合物，结构如下：

本发明包括如下制备技术方案：

利用白英全草制备四氢呋喃型木脂素类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的白英全草以70-80％乙醇加热回流提取2-3次，合并提取液浓缩得浸膏；

(2)步骤(1)得到的浸膏依次用乙酸乙酯和正丁醇以1:1-1:1.5的体积比进行萃取，萃取3-4次；

(3)步骤(2)所得乙酸乙酯层和正丁醇层干浸膏分别经硅胶柱色谱，均以二氯甲烷-甲醇系统(50:1-1:1)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识两层馏分进行合并后共得到6个馏分a、b、c、d、e、f。

馏分a经ods柱色谱，以乙醇-水系统20％-90％进行梯度洗脱，经薄层检识和自动分析hplc分析合并后进一步得到了四个组分a1、a2、a3、a4。

所得组分a3经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30份样品，后经薄层检识和hplc分析进行合并得到7个组分3.1-3.7。

利用制备hplc对组分3.7以60-62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。

利用半制备hplc对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2和3，并利用相同方法，对3.7.2进行分离得到了化合物1。

利用手性色谱柱对化合物1和2进行手性拆分分别得到了化合物1a/1b和2a/2b。其手性制备拆分方法为：利用daicelchiralpakic手性色谱柱，流动相为正己烷-异丙醇(1:1)，流速为0.3ml/min，紫外检测器检测波长为254nm。

本发明所述的提取、制备方法，适用于茄科茄属植物白英(solanumlyratumthunb.)。

本发明中所述的手性拆分条件，适用于化合物1和2。

本发明所得化合物的结构鉴定结果如下：

利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维nmr技术对化合物1、2、3的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测ecd和计算ecd谱图，对拆分后的光学纯化合物1a/1b-2a/2b的绝对构型进行确定。

化合物1:黄色油状化合物，hresims给出准分子离子峰m/z567.2566[m+na]⁺(计算为c30h40o9na,567.2565)，结合¹h,¹³c-nmr数据确定其分子式为c30h40o9，计算不饱和度为11。¹hnmr和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)谱中，δ6.99(1h,d,j＝1.3hz,h-2),6.93(1h,d,j＝8.1hz,h-5),6.97(1h,dd,j＝8.1,1.3hz,h-6),6.90(1h,br.s,h-2′),6.89(1h,overlap,h-5′),6.88(1h,br.d,j＝8.4hz,h-6′)提示为两个1,3,4-三取代苯环系统。δ4.64(1h,d,j＝8.5hz,h-7),5.10(1h,d,j＝7.2hz,h-7′)；δ83.1(c-7),81.3(c-7′)提示为两个连氧的次甲基质子。δ4.29(1h,dd,j＝11.3,5.4hz,h-9a),4.22(1h,dd,j＝11.3,5.7hz,h-9b),3.82(2h,m,h-9)；δ64.1(c-9),64.5(c-9′)提示为两个连氧的亚甲基。δ2.35(1h,dq,j＝8.5,5.4hz,h-8),2.69(1h,m,h-8′)；δ50.5(c-8),45.7(c-8′)提示为两个次甲基信号。δ3.93(s,3-och3),3.89(s,3′-och3)；δ56.1(3,3′-och3)提示为两个甲氧基信号。δ2.17(1h,d,j＝7.2hz,h-2″),2.02(1h,d,j＝7.3hz,h-2″′),2.06(1h,m,h-3″),1.96(1h,m,h-3″′),0.96(2h,dd,j＝6.6,1.8hz,h-4″,5″),0.87(2h,dd,j＝6.5,1.1hz,h-4″′,5″′)以及碳谱中δ173.1(c-1″),172.9(c-1″′),43.5(c-2″),43.3(c-2″′),25.8(c-3″),25.6(c-3″′),22.6(c-4″,4″′),22.5(c-5″,5″′)提示为两个异戊酯基片段。以上氢谱和碳谱数据显示结构中可能存在两个相似的片段。根据分子式提供的信息，推测结构中可能存在一个呋喃环。

通过hsqc谱对直接相连的碳氢信号进行了归属。在hmbc谱中，δ4.64(h-7)与δ132.3(c-1),109.4(c-2)及119.8(c-6)有相关，δ5.10(h-7′)与δ129.7(c-1′),108.9(c-2′)及119.4(c-6′)有相关说明两个苯环连在呋喃环的c-7和c-7′位。δ4.29(h-9b)与δ173.1(c-1″)存在相关，δ3.83(h-9′a)与δ172.9(c-1″′)存在相关，说明结构中的两个异戊酯基片段与c-9,c-9′位直接相连。δ2.35(h-8)与δ64.1(c-9),83.1(c-7),45.7(c-8′)存在相关，以及δ2.69(h-8′)与δ64.5(c-9′),81.3(c-7′),50.5(c-8)存在相关，说明异戊酯基通过c-9,c-9′位的亚甲基取代在呋喃环的c-8,c-8′位。δ3.93(3-och3)与δ146.8(c-3)存在相关，δ3.89(3′-och3)与δ146.6(c-3′)存在相关，说明了两个甲氧基的连接位置。根据以上信息，得到该化合物的平面结构。由此推测化合物1为四氢呋喃型木脂素类化合物。化合物1的相对构型是通过noesy谱确定的。在noesy谱中可观察到h-9与h-7/h-8′,h-8与h-6/h-7′/h-9′以及h-8′与h-7/h-9/h-6′的相关，证明了h-7与h-8,h-7′与h-8′,h-8与h-8′都为反式取向。

化合物2:黄色油状化合物，hresims给出准分子离子峰m/z567.2566[m+na]⁺(计算为c30h40nao9,567.2565)，结合¹h,¹³c-nmr数据确定其分子式为c30h40o9，不饱和度为11。¹h(400mhz,cdcl3)与¹³cnmr(100mhz,cdcl3)谱中显示出2个甲氧基、4个甲基、4个次甲基、2个亚甲基、2个酯羰基碳以及12个芳香碳(其中6个为季碳)。对nmr谱图数据进行分析，发现化合物2的谱图与化合物1的类似，其主要的不同为c-9和c-9′处的化学位移值，化合物2中为δ61.9(c-9),60.7(c-9′)，而化合物1中为δ64.1(c-9),64.5(c-9′)。故推测化合物2与化合物1具有相同的平面结构。化合物2的相对构型也是通过noesy谱确定的，在noesy谱中可观察到h-9与h-7/h-9′,h-9′与h-2′/h-6′存在相关，证明了h-8,h-7′,h-8′为同一取向，而h-7为相反的取向。

化合物1和2的比旋光度接近于零且无明显的cd吸收，推测其为外消旋混合物。使用daicelchiralpakig手性色谱柱对化合物1和2进行进一步的分离，结果得到两对对映异构体1a/1b和2a/2b。它们的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。1a的实验cd谱中的cotton效应峰与预设为7s,8r,7′s,8′r构型的计算ecd谱中的cotton效应峰能够较好的吻合。2a的实验cd谱中的cotton效应峰与预设为7r,8r,7′r,8′s构型的计算ecd谱中的cotton效应峰能够较好的吻合。由此可以确定化合物1a,1b,2a,2b的绝对构型分别为7s,8r,7′s,8′r、7r,8s,7′r,8′s、7r,8r,7′r,8′s和7s,8s,7′s,8′r构型。

化合物3：黄色油状化合物，hresims给出准分子离子峰m/z567.2541[m+na]⁺(计算为c30h40nao9,567.2565)，结合¹h,¹³c-nmr数据确定其分子式为c30h40o9，其与化合物1和2的分子式相同。其中最显著的差异是化合物3在氢谱和碳谱中出现了叠加共振的信号，说明化合物3具有磁性等同的对称面。对二维核磁数据的分析验证了所有氢和碳信号的分配。在noesy谱中，可以观察到h-7与h-9,h-8与h-2和h-6的相关，由此确定了化合物的相对构型，为(rel)-(7β7′β,8α,8′α)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羟基-7,7′-环氧木脂素-9,9′-异戊酯基。化合物3为内消旋化合物，不具有旋光性和cotton效应。

表11-3在cdcl3中¹h(400mhz)与¹³c(100mhz)nmr数据

对发明所述五个新的四氢呋喃型木脂素类化合物对mpp⁺诱导的人sh-sy5y神经细胞损伤的保护作用进行了考察，体外细胞试验结果表明化合物1-3对mpp⁺诱导的人sh-sy5y细胞氧化损伤具有显著的保护作用。因此本发明所述的新的四氢呋喃型木脂素类化合物，具有抗ad作用的医药新用途。

附图说明：

图1化合物1的uv谱；

图2化合物1的hresims谱；

图3化合物1的hmbc谱(600mhz,cdcl3)；

图4化合物1的hsqc谱(600mhz,cdcl3)；

图5化合物1的¹h-¹hcosy谱(600mhz,cdcl3)；

图6化合物1的noesy谱(600mhz,cdcl3)；

图7化合物1的手性拆分色谱图；

图8化合物2的uv谱；

图9化合物2的hresims谱；

图10化合物2的hmbc谱(600mhz,cdcl3)；

图11化合物2的hsqc谱(600mhz,cdcl3)；

图12化合物1的¹h-¹hcosy谱(600mhz,cdcl3)；

图13化合物2的noesy谱(600mhz,cdcl3)；

图14化合物2的手性拆分色谱图；

图15化合物3的uv谱；

图16化合物3的hresims谱；

图17化合物3的hmbc谱(600mhz,cdcl3)；

图18化合物3的hsqc谱(600mhz,cdcl3)；

图19化合物3的¹h-¹hcosy谱(600mhz,cdcl3)；

图20化合物3的noesy谱(600mhz,cdcl3)；

图21化合物1的hmbc相关图；

图22化合物1-3的noesy相关图；

图23化合物1a/1b-2a/2b实测ecd与计算ecd比对图。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1-3的制备。

选用茄科植物白英(s.lyratum)的干燥全草40kg为原料，用70％工业乙醇加热回流提取3次，每次2小时。经减压浓缩后得乙醇粗提物2500g，浸膏分别采用乙酸乙酯及正丁醇以1:1的体积比进行萃取，萃取3-5次，得到乙酸乙酯层干浸膏293g，正丁醇干浸膏1114g，两层浸膏分别进行快速减压柱色谱分离，都以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，共收集到40～50个馏分，经硅胶薄层检识后，合并得到6个馏分a(32.5g)、b(44.8g)、c(43.2g)、d(186.4g)、e(49.0g)、f(207.2g)。馏分a经ods色谱柱，以20％-90％乙醇-水进行梯度洗脱，并经薄层检识和hplc分析(50-100％甲醇水)得到四个组分a1(4.6g)、a2(3.6g)、a3(7.2g)、a4(13.2g)。所得组分a3(7.2g)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30个组分，后经薄层检识和hplc分析(80％甲醇水)进行合并得到7个组分3.1-3.7。利用制备hplc对组分3.7以62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。利用半制备hplc对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2(5.9mg,tr40.8min)和3(12.3mg,tr43.4min)，利用相同方法，对3.7.2进行分离得到化合物1(11.3mg,tr47.4min)。并利用手性色谱柱daicelchiralpakic对化合物1进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物1a(4.6mg,tr32.8min)和1b(4.3mg,tr45.1min)，用相同的条件对化合物2进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物2a(2.4mg,tr22.9min)和2b(2.5mg,tr26.1min)。

实施例2：化合物1-3对体外mpp⁺诱导的人sh-sy5y神经细胞损伤保护作用的考察。

利用常规的mtt法考察化合物对mpp⁺诱导的sh-sy5y细胞损伤的保护作用。将经胰蛋白酶消化后的sh-sy5y细胞均匀的接种在96孔板中，置于培养箱中培养12h，样品组中加入不同浓度的化合物(12.5,25,50μm)预处理sh-sy5y神经细胞1h，对照组与模型组中加入等体积的空白培养基预处理1h，在模型组与加药组中加入1mm的mpp⁺处理细胞36h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mlmtt的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。吸去上清液，每孔加入150ml的dmso于微量振荡器上振荡5min，用酶标仪在490nm波长处检测吸光度值，实验操作3次。细胞存活率(％)＝[a490(sample)–a490(control)]/[a490(control)–a490(blank)]×100％。mtt实验结果显示，化合物1-3在不同浓度下均表现出显著的保护作用，尤其在50μm浓度下作用最强，相较于阳性药的52.28±2.16％，并且对映异构体2a和2b在加药浓度为25μm浓度下表现出明显的立体选择性的神经保护活性差异(2a:82.66％；2b:69.03％)。

表2给药后细胞存活率