1.本发明涉及外泌体纯化技术领域，具体为一种人脐带间质干细胞外泌体 的分离纯化方法。
背景技术：
2.外泌体(exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌 体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不 同的特性和生物学功能。
3.现有的从人脐带间质中提取外泌体的方法复杂且设备要求高，现有技术的 获取的外泌体重悬液含大量杂蛋白，并非为纯净的外泌体，仅为含外泌体的 混合液，因为此，我们推出一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法， 以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人脐带间质干细胞外 泌体的分离纯化方法，按照以下步骤进行制备：
6.s1：制取上清液：人脐带间质样本收集于第一离心管中，在1～9℃、250～ 600g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心 管中，在3～8℃、9000～11000g离心10～15分钟，分离得到上清液；
7.s2：连续离心：将步骤s1中取得的上清液，总外泌体抽提液以1:1的体 积比在第三离心管混合，震荡均匀后，在无血清且去除外泌体的培养液中于 37℃培养箱孵育48h后，上清液经400g，第一次离心1～10分钟、3000g第 二次离心10～20分钟，10000g第三次离心10～20分钟，在所述第三离心管 的底部得到固相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总外泌体；
8.s3：将步骤s1中取得的人脐带间质干细胞总外泌体用60000g的sw28转 子浓缩90～120分钟，外泌体沉淀在0.32m蔗糖中重悬，然后100000g离心 1-3个小时，留做备用；
9.s4：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；
10.s5：将步骤s4中取得的重悬液，加入第四离心管中，将所述第四离心管 置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在第四离心管中得到磁珠结 合的外泌体；
11.s6：向第四离心管中加入ph值为7～8的磷酸缓冲液，然后将第四离心 管置于磁力架吸附3～8分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的外泌体进 行清洗；
12.s7：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化 状态，将步骤s6处理后的外泌体样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进 行分离纯化外泌体；
13.s8：利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的 外泌体，取得经洗涤后纯化柱；
14.s9：所述经洗涤后纯化柱用含50～200mm napo，0.1～10mm edta，ph为 6.5-7.5的洗脱液孵育1～5min，4℃，2000～5000rpm离心1-5min，所得洗 脱组分为高纯度外泌体，并进行保存。
15.优选的，所述柱平衡液为50～500mm napo，0.1～10mm edta，ph为6.0～ 7.0。
16.优选的，所述洗涤液为1～15mm napo，0.1～15mm edta；100mm～1m nacl， ph为6.0～7.0。
17.优选的，所述免疫磁珠法指准备25μl预涂有免疫球蛋白g的免疫磁珠 与30μl抗cd9单克隆抗体孵育1～2个小时，其后，免疫磁珠与20μg外泌 体在4℃混悬1～2个小时，清洗4次后，外泌体和磁珠在pbs中再次重悬。
18.优选的，所述洗脱液为200-500mmnapo，0.1-10mm edta，ph为6.5-7.5。
19.优选的，将步骤s9中取得的高纯度外泌体20μl与纳米多肽凝胶溶液混 合均匀，中静置5min，使其凝固，在-4℃进行保存。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过制取上清液，分离 得到上层液体，将上层液体移入第二离心管中，三次连续离心，底部得到固 相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总外泌体，外泌体在蔗糖中重 悬，分离得到上清液离心、免疫磁珠法取得重悬液，羟基磷灰石纯化柱进行 分离纯化外泌体，多次对外泌体进行纯化，使得提纯效果好，减少了杂质。
具体实施方式
21.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例1
23.本发明提供一种技术方案：一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方 法，按照以下步骤进行制备：
24.s1：制取上清液：人脐带间质样本收集于第一离心管中，在9℃、250g 离心10分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在8℃、 11000g离心10分钟，分离得到上清液；
25.s2：连续离心：将步骤s1中取得的上清液，总外泌体抽提液以1:1的体 积比在第三离心管混合，震荡均匀后，在无血清且去除外泌体的培养液中于 37℃培养箱孵育48h后，上清液经400g，第一次离心80分钟、3000g第二次 离心10分钟，10000g第三次离心20分钟，在所述第三离心管的底部得到固 相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总外泌体；
26.s3：将步骤s1中取得的人脐带间质干细胞总外泌体用60000g的sw28转 子浓缩120分钟，外泌体沉淀在0.32m蔗糖中重悬，然后100000g离心3个 小时，留做备用；
27.s4：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；
28.s5：将步骤s4中取得的重悬液，加入第四离心管中，将所述第四离心管 置于磁力架，吸附10分钟，移除管内液体，在第四离心管中得到磁珠结合的 外泌体；
29.s6：向第四离心管中加入ph值为8的磷酸缓冲液，然后将第四离心管置 于磁力架
吸附8分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的外泌体进行清洗；
30.s7：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化 状态，将步骤s6处理后的外泌体样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进 行分离纯化外泌体；
31.s8：利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的 外泌体，取得经洗涤后纯化柱；
32.s9：所述经洗涤后纯化柱用含200mm napo，0.1mm edta，ph为7.5的洗 脱液孵育5min，4℃，2500rpm离心1min，所得洗脱组分为高纯度外泌体，并 进行保存。
33.具体的，所述柱平衡液为250mm napo，0.8mm edta，ph为6.5。
34.具体的，所述洗涤液为7mm napo，15mm edta；100mm nacl，ph为7.0。
35.具体的，所述免疫磁珠法指准备25μl预涂有免疫球蛋白g的免疫磁珠 与30μl抗cd9单克隆抗体孵育1个小时，其后，免疫磁珠与20μg外泌体 在4℃混悬1个小时，清洗4次后，外泌体和磁珠在pbs中再次重悬。
36.具体的，所述洗脱液为500mmnapo，0.1mm edta，ph为7.5。
37.具体的，将步骤s9中取得的高纯度外泌体20μl与纳米多肽凝胶溶液混 合均匀，中静置5min，使其凝固，在-4℃进行保存。
38.实施例2
39.本发明提供一种技术方案：一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方 法，按照以下步骤进行制备：
40.s1：制取上清液：人脐带间质样本收集于第一离心管中，在9℃、600g 离心10分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在8℃、 10000g离心13分钟，分离得到上清液；
41.s2：连续离心：将步骤s1中取得的上清液，总外泌体抽提液以1:1的体 积比在第三离心管混合，震荡均匀后，在无血清且去除外泌体的培养液中于 37℃培养箱孵育48h后，上清液经400g，第一次离心7分钟、3000g第二次 离心12分钟，10000g第三次离心15分钟，在所述第三离心管的底部得到固 相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总外泌体；
42.s3：将步骤s1中取得的人脐带间质干细胞总外泌体用60000g的sw28转 子浓缩95分钟，外泌体沉淀在0.32m蔗糖中重悬，然后100000g离心2个小 时，留做备用；
43.s4：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；
44.s5：将步骤s4中取得的重悬液，加入第四离心管中，将所述第四离心管 置于磁力架，吸附7分钟，移除管内液体，在第四离心管中得到磁珠结合的 外泌体；
45.s6：向第四离心管中加入ph值为7.5的磷酸缓冲液，然后将第四离心管 置于磁力架吸附3分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的外泌体进行清 洗；
46.s7：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化 状态，将步骤s6处理后的外泌体样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进 行分离纯化外泌体；
47.s8：利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的 外泌体，取得经洗涤后纯化柱；
48.s9：所述经洗涤后纯化柱用含50mm napo，10mm edta，ph为6.5的洗 脱液孵育3min，4℃，2050rpm离心4min，所得洗脱组分为高纯度外泌体，并 进行保存。
49.具体的，所述柱平衡液为288mm napo，7mm edta，ph为6.0。
50.具体的，所述洗涤液为8mm napo，9mm edta；100mm nacl，ph为6.0～ 7.0。
51.具体的，所述免疫磁珠法指准备25μl预涂有免疫球蛋白g的免疫磁珠 与30μl抗cd9单克隆抗体孵育1～2个小时，其后，免疫磁珠与20μg外泌 体在4℃混悬1个小时，清洗4次后，外泌体和磁珠在pbs中再次重悬。
52.具体的，所述洗脱液为230mmnapo，2mm edta，ph为7.5。
53.具体的，将步骤s9中取得的高纯度外泌体20μl与纳米多肽凝胶溶液混 合均匀，中静置5min，使其凝固，在-4℃进行保存。
54.本发明通过制取上清液，分离得到上层液体，将上层液体移入第二离心 管中，三次连续离心，底部得到固相物质，移除上层清液后为人脐带间质干 细胞总外泌体，外泌体在蔗糖中重悬，分离得到上清液离心、免疫磁珠法取 得重悬液，羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体，多次对外泌体进行纯化， 使得提纯效果好，减少了杂质。
55.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。