一种酶法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法与流程

1.本发明涉及食品添加剂加工领域，特别涉及甜味剂一种酶法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。


背景技术：

2.单葡萄糖醛酸甘草次酸是甘草酸水解掉末端一分子的葡萄糖醛酸后生成的产物，甜度是甘草酸的5倍，更是蔗糖甜度的1000倍，是一种高甜度低热量的天然甜味剂。目前天然高倍甜味剂市场潜力极大，在世界各国的食品工业中的应用逐渐广泛。因此，能够开发出甜度更高、安全性更高、纯度更高、性质稳定、生产成本更低的新型高倍甜味剂成为我们的研究目标。因为口味、营养、健康等各种因素的共同驱动，高甜度低热量的功能性甜味剂消费市场前景广阔、潜力很大。而单葡萄糖醛酸甘草次酸作为天然高倍甜味剂的一种，相较于传统的人工合成甜味剂具有甜度更、用量少、成本低的优点。还可以预防肥胖、高血糖、高血脂和龋齿等疾病，能够满足不同人群的诉求。对于单葡萄糖醛酸甘草次酸的生产与开发，符合高甜度低热量天然功能性甜味剂的发展趋势，必将有着广阔的市场前景。
3.单葡萄糖醛酸甘草次酸的制备方法包括化学法或者生物法，化学法为化学合成法或者酸碱水解法，但是化学合成法有合成路线长、成分复杂、难分离、生产成本高、污染大的缺点；而化学水解法的键能选择性不强，很难定向合成目标产物。因此选择生物转化法来制备单葡萄糖醛酸甘草次酸则具有反应速率快、反应条件温和、高选择性；反应成本低、环境友好、能耗低、收率高，反应类型多样化等优点。然而，目前采用的酶法制备结果普遍无法定向生成单葡萄糖醛酸甘草次酸，还伴有甘草次酸生成。
4.因此，本领域迫切需要开发一种能够降低生产成本并且对环境友好的生物转化制备方法，具体地，需要开发一种利用具有高效催化活性的酶制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的新的生物酶来源，以及制备的新工艺。整个工艺流程绿色环保，而且成本较低。过程主要包括酶法转化、灭酶、离心、醇提、酸沉、醇溶、旋蒸等过程。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种酶法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括下列步骤：
7.(1)将猪小肠洗净，将肠壁内容物收集，向肠壁内容物中加入ph值为5的0.1mol/l pbs缓冲液，制得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液；
8.(2)将β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液加入甘草酸溶液中，置于水浴锅中进行生物酶转化反应；反应结束后灭酶；
9.(3)将灭酶后的转化液离心，分开收集上清液和沉淀。向沉淀中加入乙醇，进行加热搅拌，以提取沉淀中的单葡萄糖醛酸甘草次酸；
10.(4)将乙醇提取液离心，收集得到的上清液，利用旋转蒸发仪将有机溶剂乙醇去除，温度为60℃。然后与步骤(3)中收集的转化后的上清液进行合并。
11.(5)将步骤(4)中合并后的上清液进行酸沉，醇溶，离心后，取上清液，将上清液旋蒸去除有机溶剂，得到单葡萄糖醛酸甘草次酸粉末。
12.本发明的更优技术方案为：
13.步骤(1)中向肠壁内容物中以料液比为1∶8的比例加入ph值为5的0.1mol/l pbs缓冲液，浸提5h后离心，离心转速选择5000r/min，以此方法提取三次，制得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液
14.步骤(2)中使用纯度≥98％的甘草酸，用ph为6的0.1mol/l pbs缓冲液配置甘草酸溶液浓度为5mg/ml。甘草酸溶液与粗酶液的体积比为4∶1，在55℃下反应10小时进行酶解反应。
15.步骤(3)中，用乙醇提取沉淀中单葡萄糖醛酸甘草次酸时，向沉淀中按照料液比为1∶17.5(m∶v)加入的为70％乙醇，提取时间为5h，温度为55℃。
16.步骤(5)中，向转化液中加入hcl至ph＝2，静置4h后，离心，向酸沉沉淀中按照料液比为1∶12.5(m∶v)加入无水乙醇醇溶。
17.与现有技术相比本发明的技术优势：
18.本发明提供了一种新的生物酶来源，具有高活性高选择性的特点，能够高效的制备单葡萄糖醛酸甘草次酸，在优选方案中的条件下进行转化，可以定向生成单葡萄糖醛酸甘草次酸，而无甘草次酸生成，因为甘草次酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸的性质十分相似，没有副产物生成，大大简化了后期分离等操作流程，降低了生产成本。深度开发利用了猪的脏器，整个工艺流程做到反应速率快、反应条件温和、高选择性；反应成本低、环境友好、能耗低、收率高，反应类型多样化等优点。
附图说明
19.图1为甘草酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、甘草次酸生物转化示意图
20.图2实施例1产物hplc图谱
21.图3实施例2产物hplc图谱
22.图4实施例3产物hplc图谱
具体实施方式
23.为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地说明，本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
24.实施例1：
25.向甘草酸溶液中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液甘草酸溶液与粗酶液的体积比为4∶1，在55℃条件下置于水浴锅中，在反应时间为4h，灭酶后经过hplc检测转化液，还有甘草酸剩余，没有甘草次酸生成。经过乙醇提取沉淀中的单葡萄糖醛酸甘草次酸，单葡萄糖醛酸甘草次酸总转化率为48.21％
26.实施例2：
27.向甘草酸溶液中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液甘草酸溶液与粗酶液的体积比为4
∶1，在55℃条件下置于水浴锅中，在反应时间为10h，灭酶后经过hplc检测转化液，已经没有甘草酸剩余，也未有甘草次酸生成，经过乙醇提取沉淀中的单葡萄糖醛酸甘草次酸，单葡萄糖醛酸甘草次酸总转化率为57.29％
28.实施例3：
29.向甘草酸溶液中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液甘草酸溶液与粗酶液的体积比为4∶1，在55℃条件下置于水浴锅中，在反应时间为20h，灭酶后经过hplc检测转化液，已经没有甘草酸剩余，有甘草次酸生成，经过乙醇提取沉淀中的单葡萄糖醛酸甘草次酸，单葡萄糖醛酸甘草次酸总转化率为45.37％，甘草次酸的总转化率为13.52％。
30.实施例4：
31.向甘草酸溶液中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶液甘草酸溶液与粗酶液的体积比为7∶1，在55℃条件下置于水浴锅中，在反应时间为28h，灭酶后经过hplc检测转化液，已经没有甘草酸剩余，也未有甘草次酸生成，经过乙醇提取沉淀中的单葡萄糖醛酸甘草次酸，单葡萄糖醛酸甘草次酸总转化率为57.35％。
32.产物的检测方法
33.采用高效液相色谱(hplc)测定甘草酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、甘草次酸的含量。高效液相色谱仪采用：高效液相色谱仪，spd-20a，日本岛津。zorbax sb-c18(4.6
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250mm，5μm)色谱柱；流动相为0.1％磷酸水a-乙腈b，梯度洗脱(0～3min，38％～50％b；3～10min，50％～52％b；10～20min，52％～85％b；20～30min，85～90％b；30～35min，90％～38％b；35～41min，38％b)；流速为1ml/min；进样量20μl；柱温30℃；紫外检测波长为254nm。
34.包括以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。