一种赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法、无菌检验方法与流程

本发明属于海洋藻类纯培养技术领域，尤其涉及一种赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法、无菌检验方法。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：获得无菌纯藻种的方法有过滤、离心脱洗、紫外线灭杀等物理方法，此类方法成本较高且只能用于初级阶段的应急处理。紫外灭杀等方法可能会同时杀灭微生物和藻类细胞，存在弊端。由于抗生素抗菌谱及细菌群落的组成特征间的特异性关系，单一抗生素无法灭杀藻际环境中所有的细菌，例如青霉素只对生长繁殖期的细菌具备灭杀特性。进而导致现有技术中物理方法、单一抗生素等灭杀方法存在缺陷，无法获取无菌化的纯藻株。因此，由于微藻细胞和细菌间个体性以及对抗生素的敏感性的差异性，可以利用混合抗生素投加方法除去与藻共存或污染的细菌。米氏凯伦藻属于裸甲藻目，藻体单细胞，是世界范围内的常见的有毒赤潮藻，本技术针对其易产生生物膜、对抗生素有较强耐受性的特点，经4种典型抗生素青霉素、卡那霉素、庆大霉素及链霉素处理并结合平板培养，在国内首次成功获得了海洋赤潮微藻米氏凯伦藻的除菌藻株。

微藻是海洋初级生产力的重要组成部分，通过进行光合作用制造丰富的有机物，使海洋生态系统有序进行，是影响海洋生态环境和水产养殖业的关键因素之一。海洋微藻包括了一个大而尚未开发的生物类群，因此，提供了一个待开发的资源宝库。这些特性决定了微藻在医药、水产养殖、环保等领域有着重要的开发和科学研究价值。而纯培养在海洋藻类的生理生态学、生物化学等领域的研究中是必不可少的，是探究藻菌关系和开发利用微藻资源的先提条件。以往该领域中研究的藻种实际上多为微藻和细菌(共存或污染)的混和体,不能准确地研究藻菌间相互作用,特别是不能探索藻细胞与某一特定细菌的相互关系。这些问题的存在使得研究工作难以深入，是造成在藻菌关系领域研究中同国际存在差距的原因之一，本方案的产品力图解决此系列问题。因为以无菌藻为材料进行藻菌相互作用研究,因排除其他微生物的干扰,则可以真实反映藻类细胞与特定海洋细菌,特别是与藻密切相关的细菌及其群落的相互关系。因此,获得除菌微藻,是研究藻菌关系的关键，也是本方案产品的优势所在。

而本方案产品以得到无菌藻株为目标，借助抗生素联合处理方案得到一株无菌米氏凯伦藻的纯藻株，进而可利用纯藻株进行藻菌间相互作用研究。本产品因排除其他微生物的干扰，相比微藻-细菌混合体则可以更客观真实反映藻类细胞与特定海洋细菌，特别是与藻细胞密切相关的细菌及其群落的相互关系，进而有序开展藻菌间相互作用及其机理机制研究，使得在该领域的工作得以深入开展研究。借助本方案的产品可为利用特定细菌(生物法)防控以米氏凯伦藻为优势藻种的赤潮及微藻资源宝库的开发等领域奠定坚实的研究支撑。因此，本产品方案是研究米氏凯伦藻株-细菌关系的关键。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前在国内外研究中所采用的纯藻种实际上基本为微藻与细菌的混合体，使得研究工作难以深入。

解决上述技术问题的难度：利用加热低温法、过滤法、超声波、高压法和辐射法(γ-射线、微波、红外线)通过一些器械设备等手段消除微藻细菌，这类物理方法需要耗费大量的财力但却效果不明显，可操作性不强，另外强电场、辐射法也会对微藻细胞起到伤害作用，而且在操作过程中会对周边环境带来负担。且由于藻际细菌体型微小、结构简单、环境适应力强、代谢旺盛繁殖迅速、种类多的特点，给灭菌带来较大难度。因此，急需找到一种效果好、成本低、可操作性强且不伤害藻类细胞的除菌方法。

解决上述技术问题的意义：通过调研、文献查阅及微藻培养液中细菌对抗生素敏感性测试等，利用4种典型有效的抗生素混合投加方法以达到除菌目的，解决了上述技术问题。其适用于去除米氏凯伦藻藻际细菌的应用，具有效果好、起效快、应用成本低、可操作性强、未发现抗药性且对藻细胞无伤害等优点。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法、无菌检验方法。

本发明是这样实现的，一种赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法，所述赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法包括以下步骤：

第一步，配制青霉素、卡那霉素、庆大霉素及链霉素，同时加入100ml已培养6天待除菌的米氏凯伦藻培养液中，培养24h；

第二步，追加上述混合抗生素一次，培养24h后，再追加混合抗生素一次.在用混合抗生素处理3天后，取处理后的微藻培养液0.lml涂布2216e琼脂培养基平板，密封平板，20℃培养20天，观察有无细菌菌落出现；

第三步，利用血球计数法计数藻细胞生长密度以排除抗生素对微藻细胞的影响，同时以未加抗生素的微藻培养液为对照。

进一步，所述青霉素50μg·ml^-1、卡那霉素50μg·ml^-1、庆大霉素25μg·ml^-1及链霉素25μg·ml^-1。

本发明的另一目的在于提供一种由所述赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法培养的赤潮微藻米氏凯伦藻。

本发明的另一目的在于提供一种所述赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌检验方法，所述赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌检验方法包括以下步骤：

第一步，取已去除抗生素影响的米氏凯伦藻培养液0.1ml涂布2216e固体培养基平板，密封平板，生化培养箱中20℃培养20天，观察有无细菌及真菌菌落出现；

第二步，取米氏凯伦藻培养液1ml加至5ml2216e液体培养基中，20℃培养20天，观察培养液是否混浊。

进一步，所述取已去除抗生素影响的米氏凯伦藻培养液培养6天。

进一步，所述观察培养液是否混浊同未加藻液的微生物培养基作对照。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过前期调研、文献查阅及微藻培养液中细菌对抗生素敏感性测试等，筛选出4种典型有效的抗生素。本发明能够获得微藻的无菌培养物，使得开展藻-菌间相互作用及海洋微藻抗菌机理等后续的工作得以顺利进行。本发明利用微藻比细菌具有更强的抗生素耐受性的特点，以抗生素为工具排除微藻培养液中的细菌，成功获得了一株无菌海洋浮游性微藻米氏凯伦藻的纯藻种。

本发明利用此混合抗生素添加方法达到理想除菌效果具备了两大优点：(1)具有高效杀菌活性；(2)对微藻细胞生长毒性低。由于抗生素抗菌谱的差异以及微藻培养液中细菌群落的组成特征，决定了不可能存在一种可将微藻中所有细菌杀灭的抗生素，因此为提高除菌效果，采用一定浓度比抗生素混合联合投加方法，以达到除菌目的。藻际细菌中可能存在着对实验中所采用的某一种抗生素不敏感的细菌，只有采用联合加入才能将其杀灭。将抗生素合理搭配，按照相应浓度设置，组合杀菌。青霉素可通过抑制细胞壁的合成引起溶菌，它对生长旺盛的细菌效果明显，属繁殖期杀菌剂；而链霉素等氨基环醇类抗生素能通过干扰蛋白质合成抑制细菌生长，主要作用于静息细胞，属于静止期杀菌剂。两类抗生素联合投加功效更甚。最后通过肉眼观察、镜检测验、液体培养基观察、平板培养基观测，验证方法获得成功。

本发明根据米氏凯伦藻藻种特性，针对微藻易产生生物膜，难以获得其无菌培养物的难点，采用平板培养结合抗生素处理获得了米氏凯伦藻无菌藻株，此方法在国内鲜有报道。获得无菌纯藻种的方法有过滤、离心脱洗、紫外线灭杀和抗生素等处理方法。抗生素用于海洋微藻除菌的成功案例的报道相对其他方法较多。

附图说明

图1是本发明实施例提供的赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法流程图。

图2是本发明实施例提供的赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌检验方法流程图。

图3是本发明实施例提供的实验对比示意图；

图中：(a)无菌处理前米氏凯伦藻藻液；(b)无菌处理后米氏凯伦藻藻液。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在国外该领域中研究的藻种实际上多为微藻和细菌(共存或污染)的混和体，不能准确地研究藻菌间相互作用，特别是不能探索藻细胞与某一特定细菌的相互关系。国内外利用物理方法灭杀藻际细菌，主要是通过一些器械设备等手段消除微生物，有超滤膜过滤法、超声波、紫外线辐射等。另外强电场也会对藻类细胞起到伤害作用。这些物理方法需要耗费大量财力但却效果不明显，可操作性不强，而且在操作过程中会对周边环境带来负担。本产品方案下利用混合抗生素除菌，方法切实可行，可操作性强，也不会对微藻细胞造成伤害。除菌微藻的获得，为以后多领域深层次的研究提供了便利的条件。关于藻菌相互之间，特别是特定的影响微藻生长的细菌的筛选获得及细菌对微藻生长、形态影响等方向有待进一步研究，为深入探索藻-菌间相互关系及作用机理奠定了物质材料基础，具有长远的生态学意义。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法、无菌检验方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌培养方法包括以下步骤：

s101：将抗生素配制为相应浓度，青霉素(50μg·ml^-1)、卡那霉素(50μg·ml^-1)、庆大霉素(25μg·ml^-1)及链霉素(25μg·ml^-1)，同时加入100ml已培养6天待除菌的米氏凯伦藻培养液中，培养24h；

s102：追加上述混合抗生素一次，培养24h后，再追加混合抗生素一次.在用混合抗生素处理3天后，取处理后的微藻培养液0.lml涂布2216e琼脂培养基平板(涂布三板)，密封平板，20℃培养20天，观察有无细菌菌落出现；

s103：利用血球计数法计数藻细胞生长密度以排除抗生素对微藻细胞的影响，同时以未加抗生素的微藻培养液为对照。

如图2所示，本发明实施例提供的赤潮微藻米氏凯伦藻的无菌检验方法包括以下步骤：

s201：取已去除抗生素影响的米氏凯伦藻培养液(培养6天)0.1ml涂布2216e固体培养基平板(涂布三板)，密封平板，生化培养箱中20℃培养20天，观察有无细菌及真菌菌落出现；

s202：取米氏凯伦藻培养液1ml加至5ml2216e液体培养基中，20℃培养20天，观察培养液是否混浊(同未加藻液的微生物培养基作对照)。

下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、材料：米氏凯伦藻(kareniamikimotoi)由中国海洋大学微藻研究实验室提供.培养微藻选用f/2培养基。培养条件：智能光照恒温培养箱中，温度(20±3)℃，光照强度3000lx，光暗比12h:12h，每天固定时间摇动3～5次，防止藻细胞贴壁生长。除菌用抗生素—青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素购于solarbio公司。细菌2216e液体培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，陈海水1000ml，ph7.5；(2)2216e固体培养基：液体培养基+15g琼脂。

2、方法：将抗生素配制为相应浓度，青霉素(50μg·ml^-1)、卡那霉素(50μg·ml^-1)、庆大霉素(25μg·ml^-1)及链霉素(25μg·ml^-1)，同时加入100ml已培养6天待除菌的米氏凯伦藻培养液中，培养24h；然后追加上述混合抗生素一次，培养24h后，再追加混合抗生素一次。在用混合抗生素处理3天后，取处理后的微藻培养液0.lml涂布2216e琼脂培养基平板(涂布三板)，密封平板，20℃培养20天，观察有无细菌菌落出现。利用血球计数法计数藻细胞生长密度以排除抗生素对微藻细胞的影响，同时以未加抗生素的微藻培养液为对照。上述处理过程均严格遵循无菌操作规则。

米氏凯伦藻藻液无菌检验方法：1.取已去除抗生素影响的米氏凯伦藻培养液(培养6天)0.1ml涂布2216e固体培养基平板(涂布三板)，密封平板，生化培养箱中20℃培养20天，观察有无细菌及真菌菌落出现。2.取上述米氏凯伦藻培养液1ml加至5ml2216e液体培养基中，20℃培养20天，观察培养液是否混浊(同未加藻液的微生物培养基作对照)。

3、结果：微藻培养液经培养后，未发现培养液变混浊或有丝状物产生的现象，表明无真菌菌落。利用镜检及血球计数法检测混合抗生素处理下米氏凯伦藻的生长状况良好，可排除除菌用抗生素对微藻的影响.细菌培养检验结果表明，米氏凯伦藻培养液经混合抗生素处理初步认定无菌后，经微生物培养试验(2216e琼脂培养基平板和2216e液体培养液培养试验)结果显示微藻培养液内无细菌菌落存在，且微藻生长状况良好，表明米氏凯伦藻的无菌化获得成功，成功获得了一株无菌米氏凯伦藻的纯藻种。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

在培养6d后的自然带菌的米氏凯伦藻藻液中有藻细胞下沉现象，在镜检下有部分微藻细胞出现老化图3(a)。除菌米氏凯伦藻细胞保持明显上浮，培养液基本澄清，镜检下未出现老化现象图3(b)。经抗生素无菌化处理成功得到一株米氏凯伦藻的纯藻株，本发明用以进一步探索藻细胞与某一特定细菌的相互作用关系。例，有害微藻米氏凯伦藻引起的赤潮的防治为当今热门话题，本发明进而筛选得到几株对纯藻株的米氏凯伦藻细胞具有抑制作用的细菌，并进一步探索抑藻菌-米氏凯伦藻细胞间的作用机理，为防控以米氏凯伦藻引起的赤潮提供科学依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。