评估索拉非尼疗效的分子标记及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医学生物检测技术领域，尤其涉及一种评估索拉非尼疗效的突变基因及其检测试剂盒。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤,其年诊断率在全球癌症中排名第五，也是癌症相关死亡的第三大主要原因。每年有近70万例新发病例，中国占全球新诊断hcc的50％以上。我国由于乙肝携带者人口众多(超过1.2亿)，而乙肝引起的慢性肝炎、肝硬化和肝癌是我国肝癌发生的主要致病因素。索拉非尼是fda批准用于治疗晚期肝癌的唯一临床药物，可以抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡。它是一种口服多激酶抑制剂，可以通过抑制ras/raf/mek/erk信号通路中raf-1、b-raf阻断肿瘤细胞增殖；此外，索拉非尼通过靶向肝细胞因子受体(c-kit)、fms样酪氨酸激酶(flt-3)、血管内皮生长因子受体(vegfr)-2、vegfr-3、血小板衍生生长因子受体(pdgfr-β)和其他酪氨酸激酶抑制血管生成，因此具有双重抗肿瘤作用。虽然能较显著地延长晚期肝癌患者的总体生存时间，但是由于hcc的遗传异质性，一部分患者对索拉非尼具有固有耐药性。因此，对索拉非尼耐药的生物指标的鉴定有助于评估索拉非尼的疗效。

oct4基因属于pou转录因子家族，是调控胚胎干细胞(embryonicstem，cell，es)特性的重要转录因子，研究还发现oct4参与肿瘤干细胞(cancerstemcells，cscs)及肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransitions，emt)过程的调控。近年文献报道，oct4在多种人类恶性肿瘤中均有表达，且与肿瘤的增殖、凋亡、转移及上皮－间质细胞转化等生物学行为关系密切，samardzija等(samardzijac,luworrb,quinnma,etal.coalitionofoct4aandβ1integrinsinfacilitatingmetastasisinovariancancer[j].bmccancer,2016,16:432.)通过研究表明，oct4在卵巢癌的转移过程中起重要作用；yin等(yinx,zhangbh,zhengss,etal.coexpressionofgeneoct4andnanoginitiatesstemcellcharacteristicinhepatocellularcarcinomaandpromotesepithelial-mesenchymaltransitionthroughactivationofstat3/snailsignaling[j].jhematoloncol,2015,8:23.)发现oct4可通过激活stat3/snail信号通路启动肝细胞癌的上皮－间质细胞转化过程。有学者研究(hut,lius,breiterdr,wangf,tangy,suns.octamer4smallinterferingrnaresultsincancerstemcell-likecellapoptosis.cancerres2008；68:6533-6540.)认为oct4是维持肿瘤干细胞样细胞存活关键的转录因子,其在很多恶性肿瘤中都有表达。wen([13]wenk,fuz,wux,fengj,chenw,qianj.oct-4isrequiredforanantiapoptoticbehaviorofchemoresistantcolorectalcancercellsenrichedforcancerstemcells:effectsassociatedwithstat3/survivin.cancerlett2013；333:56-65.)等研究认为oct4能调控结肠癌干细胞表面标记分子cd133、cd44等的表达，推测oct4可能通过控制肿瘤干细胞转录，维持其活性，从而参与结肠癌的发生、发展。

目前，并没有可靠的证据证明单一化疗药物可以改善进展期肝癌患者的生存期，联合化疗药物亦是如此。临床上常用的化疗药包括顺铂、多柔比星、5－氟尿嘧啶等，其中多柔比星是近期研究的热点。近年来研究发现，在肝癌组织及癌旁组织中oct4表达均高于正常组织。但目前尚未有关于通过oct4基因突变评估索拉非尼对肝细胞癌治疗效果的研究。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供了可用于评估索拉非尼疗效的分子标记及其检测试剂盒。

本发明的第一个方面，提供了一种评估索拉非尼疗效的分子标记，所述分子标记包括pou5f1突变基因、oct4蛋白、oct4突变蛋白中的一种或几种。

其中，所述oct4蛋白的编码基因为pou5f1基因，其具有如seqidno：5所示的碱基序列。

优选地，所述pou5f1突变基因的突变位点为c.g52c(基因第52位碱基鸟嘌呤突变为胞嘧啶)。

优选地，所述pou5f1突变基因具有如seqidno：1所示的碱基序列。

seqidno：1

atggcgggacacctggcttcggatttcgccttctcgccccctccaggtggtcgaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctccgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga

优选地，所述oct4突变蛋白为所述pou5f1突变基因所编码的蛋白；进一步优选地，所述oct4具有如seqidno：2所示的氨基酸序列。

seqidno：2

metalaglyhisleualaseraspphealapheserproproproglyglycysglyaspglyproglyglyprogluproglytrpvalaspproargthrtrpleuserpheglnglyproproglyglyproglyileglyproglyvalglyproglysergluvaltrpglyileproprocysproproprotyrgluphecysglyglymetalatyrcysglyproglnvalglyvalglyleuvalproglnglyglyleugluthrserglnprogluglyglualaglyvalglyvalgluserasnseraspglyalaserprogluprocysthrvalthrproglyalavallysleuglulysglulysleugluglnasnproglugluserglnaspilelysalaleuglnlysgluleugluglnphealalysleuleulysglnlysargilethrleuglytyrthrglnalaaspvalglyleuthrleuglyvalleupheglylysvalpheserglnthrthrilecysargpheglualaleuglnleuserphelysasnmetcyslysleuargproleuleuglnlystrpvalgluglualaaspasnasngluasnleuglngluilecyslysalagluthrleuvalglnalaarglysarglysargthrserilegluasnargvalargglyasnleugluasnleupheleuglncysprolysprothrleuglnglnileserhisilealaglnglnleuglyleuglulysaspvalvalargvaltrpphecysasnargargglnlysglylysargserserserasptyralaglnarggluasppheglualaalaglyserpropheserglyglyprovalserpheproleualaproglyprohispheglythrproglytyrglyserprohisphethralaleutyrserservalpropheprogluglyglualapheproprovalservalthrthrleuglyserpromethisserasn

本发明的第二个方面，提供了一种评估索拉非尼疗效的试剂盒，所述试剂盒包括根据pou5f1突变基因设计的pcr引物。

优选地，所述pcr引物具有如seqidno：3、seqidno：4所示的碱基序列。

seqidno：3

gggacacctggcttcggatt

seqidno：4

aacccccggcccgattcctg

发明的第三个方面，提供了另一种评估索拉非尼疗效的试剂盒，包括oct4蛋白的单/多克隆抗体或oct4突变蛋白的单/多克隆抗体、免疫组化实验试剂。

优选地，所述免疫组化实验试剂包括二甲苯、乙醇、h2o2、体积分数为3％的h2o2-甲醇液、1％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素和辣根过氧化物酶。

本发明的第四个方面，提供了本发明所述的分子标记在制备评估索拉非尼疗效的试剂或检测设备中的应用。

优选地，所述索拉非尼疗效包括索拉非尼治疗肝癌的效果。

优选地，所述检测试剂包括：引物、探针、抗体、核酸芯片中的一种或多种。

优选地，所述检测设备包括：含有检测所述pou5f1突变基因的基因芯片的检测平台。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：本发明提供了评估索拉非尼疗效的分子标记，均能够判断术后肝癌患者对于索拉非尼药物的反应性，对临床用药、病人术后监控和序贯治疗具有重要的指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是肝癌组织中oct4表达量分别为低、中、高的典型样本的染色情况；

图2是免疫组化法检测100名肝癌患者oct4蛋白表达水平与其recist分组情况；

图3是结合oct4表达水平，对服用索拉菲尼患者预后的预测；

图4是结合afp表达水平，对服用索拉非尼患者预后的预测；

图5是oct4表达量与肝癌细胞对瑞戈非尼疗效的相关性；

图6是肝癌组织中oct4编码基因突变与患者对索拉非尼的反应性情况；

图7是体外实验验证肝癌细胞中野生型及突变型oct4的表达量对索拉非尼反应性的影响。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

实施例1临床组织样本的选取

100例原发性肝细胞癌组织标本随机取自于2009年1月-2013年6月在第二军医大学东方肝胆外科医院接受肝切除手术的hcc病人。书面知情同意书均于术前获得。入组和排除的标准：术前体能评分who0-1；肝功能child-pugh分级为a级；无肉眼可见腹水；无肝性脑病；术前未接受任何放化疗；均为根治性切除；所有病人术后病理均证实为肝细胞癌。按照国际抗癌联盟(uicc)2002第六版进行tnm分期。本研究100例肝细胞癌患者中男性为90例，女性10例，男女比例为9：1；平均年龄49.46±10.2岁，范围29-74岁；本组病例hbsag阳性患者比例为87％(87/100)；无围手术期死亡病例。

实施例2

免疫组化法检测实施例1中的100名肝癌患者术后服用索拉非尼后oct4蛋白表达水平与其mrecist分组情况，方法包括以下步骤：

(a)组织芯片的构建

首先对实施例1中的100例病人的每一个供体蜡块进行切片和苏木素-伊红(he)染色。显微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，分别选取有代表性的癌和癌旁组织各3个位点，利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的组织芯，插入有240个点阵的受体蜡块中，以4μm的厚度连续切片，所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。

(b)利用免疫组化实验试剂(包含但不仅限于：二甲苯、乙醇、3％h2o2甲醇液、抗原修复液、封闭液、dab显色试剂、甲基绿、苏木精-伊红、辣根过氧化物酶标记抗兔igg抗体、oct4抗体)，对切片后的肝癌组织进行免疫组化染色；

(c)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；

(d)利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，给出评分。根据评分计算肿瘤组织中oct4分子的表达量。可采用imagescope(aperio公司)软件对整张组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcount)程序对每个芯片点进行“阳性pixel”计算，定义为“oct4评分”。

结果为：

1)mrecist分组情况如图1所述，将oct4根据表达量从低至高评为0、1、2、3分。

2)评分结果如图2所示，图中cr+pr表示完全/部分缓解，sd表示疾病稳定，pd表示疾病进展。结合oct4表达量水平将肝癌组织芯片分为如下2类，经与随访结果比对得到：第一类：oct4低表达的患者服用索拉非尼后死亡率低；第二类oct4高表达的患者服用索拉非尼后死亡率高。因此，oct4高表达的患者对索拉非尼耐药(疾病进展)的比例更高。

实施例3

将实施例1中的100例病人采用索拉非尼干预，并采用实施例2的免疫组化法检测实施例1中的100名肝癌患者oct4蛋白、afp蛋白的表达水平，结果如下：

如图3所示，结合oct4表达水平，对服用索拉非尼患者预后的预测，在本队列中，根据oct4表达量将患者均为为两组，oct4表达量高的患者其总体生存期更短，预后更差；

如图4所示，结合afp(肝癌最常用的标志物)表达水平，对服用索拉非尼患者预后的预测，在本队列中，根据afp表达量将患者均为为两组，组间患者总体生存期无统计学差异；

上述结果表明，oct4表达水平可用于服用索拉非尼患者预后的预测，而afp表达水平不能用于服用索拉非尼患者预后的预测。

实施例4

将实施例1中的100例病人体外实验采用肝癌二线靶向药物瑞戈非尼干预，并采用实施例2的免疫组化法检测100名肝癌患者oct4蛋白的表达水平，结果如图5所示，体外实验说明oct4表达量与肝癌细胞对肝癌二线靶向药物瑞戈非尼(regofenib)疗效不相关。

实施例5全外显子测序

通过对肝癌术后服用索拉非尼的病人进行全外显子测序，结果如图6所示，图中cr+pr表示完全/部分缓解，sd表示疾病稳定，pd表示疾病进展。

重复出现的pou5f1基因突变(c.g52c)，导致其编码蛋白oct4第18位甘氨酸突变为精氨酸(p.g18r)。其中，pou5f1基因突变(c.g52c)后的碱基序列为：seqidno：1；oct4第18位甘氨酸突变为精氨酸(p.g18r)的氨基酸序列为：seqidno：2。

本实施例中oct4蛋白第18位甘氨酸突变为精氨酸的患者共有3例，该突变率为3.4％，经索拉非尼治疗及mricist评估后，2例为sd,一例为cr，按照临床mresist标准，pou5f1基因突变(c.g52c)或oct4蛋白突变(p.g18r)的患者索拉非尼治疗后大多处于治疗响应组。

实施例6体外实验

体外实验验证肝癌细胞中pou5f1野生型(碱基序列为：seqidno：5)及突变型(碱基序列为：seqidno：1)，导致其编码蛋白oct4第18位甘氨酸突变为精氨酸(p.g18r)oct4的表达量对索拉非尼反应性的影响。

seqidno：5

atggcgggacacctggcttcggatttcgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctccgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga

结果如图7所示，在肝癌中过表达野生型(pou5f1wt)后，细胞对索拉非尼明显耐药，而过表达突变型(pou5f1mut)，细胞对索拉非尼敏感性变化不大。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>上海东方肝胆外科医院

<120>评估索拉非尼疗效的分子标记及其检测试剂盒

<141>2019-10-07

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1083

<212>dna

<213>human

<400>1

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cccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggtt240

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tgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccga720

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