精神分裂症小鼠模型前额皮层circRNA测序分析试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物、检测方法及试剂盒。

背景技术：

精神分裂症(schizophrenia,sz)是一种在遗传和神经发育缺陷基础上产生的慢性、致残性精神障碍。然而直到目前为止，精神分裂症的诊断现状仍不能令人满意，例如诊断的主观性强、及时性不足等，而且由于此病的症状为非特异性，不易与其它精神疾病相鉴别。因此，临床上迫切需要探寻一种有效的生物标志物，来进一步提高精神分裂症诊断的准确性。随着分子生物学技术和遗传学数据分析方法的进步,精神分裂症易感基因方面的研究也取得了一定的进展。随着后基因组时代的来临,转录组学技术作为率先发展起来的新技术已得到广泛应用,其为研究基因功能及基因结构的重要手段,可将基因组遗传信息与症状学联系起来。

环状rna(circrna)是区别于传统线性rna的一类新型rna，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的circrna是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性；由于circrna对核酸酶不敏感，所以比线性rna更为稳定，这使得circrna在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。研究显示，circrna在不同物种中起到mirna海绵的作用，称之为竞争性內源rna(cerna)，能竞争性结合mirna，从而调控靶基因的表达，例如有研究发现的一个circrna-cdr1as(也称为cirs-7)，在其序列上有超过60个保守的mir-7结合位点，因此，起到有效的mir-7海绵作用，能够影响mir-7靶标基因活性。在斑马鱼实验中，该circrna的表达能够损害中脑发育，与敲除mir-7效果一致。通过高通量测序和生物信息学分析手段，研究者在哺乳动物转录组中发现了数以千计的circrna，说明circrna很有可能就是一类新的调控型內源竞争性rna(cerna)。这说明，circrna可能通过竞争性结合疾病相关的mirna在疾病调控中发挥着非常重要的作用。很多circrna是由蛋白编码基因产生，但是还没有结果显示circrna在细胞中编码蛋白，circrna也因此被定义为一类新型非编码rna。其主要通过“1个以上的外显子反向剪接成环”形成，是非线性的、自我环化的非编码rna分子，常定位于细胞质中。circrna分位于细胞质中富含mirna结合位点，能结合并抑制mirna，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。常规存在于线性rna分子中的3’和5’端在circrna中被连接形成了闭合环状结构。因此，circrna具有高表达和稳定的特性，它在与其它线性內源竞争性rna共同作用过程中能够显示异常突出的cerna活性。除了cerna活性，circrna也有可能与rna结合蛋白rbps结合，或与其它rna碱基互补结合甚至结合rna的翻译蛋白，从而影响基因的正常功能。

基于双重刺激神经发育假说建立的神经发育小鼠模型，是通过环境应激或药物刺激干扰神经发育的关键阶段，引起中枢神经系统发育的不可逆改变，继而引起动物成年后持久的行为改变，可模拟出精神分裂症的症状学特征。介于伦理学角度的约束及获取人脑组织的困难性，选择小鼠精神分裂症模型来研究精神分裂症的发病机制则成为必然。因此，本发明意在探讨精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层circrna表达水平、检测方法及试剂盒。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物、检测方法及试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物，所述标记物为circrna1、circrna2、circrna3、circrna10。

在本发明的第二方面，提供了上述精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物的检测方法，包括以下步骤：脑组织采集对照组(nc)、精神分裂症模型组(sz)、治疗组(treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑，将小鼠脑腹面朝上放入冰袋预冷的小鼠脑冠状切片模具(037-001,huayueyangbiotechnology,beijing,china)，用双面刀片将小鼠全脑切成1mm厚的冠状切片，将粘附有脑冠装片的刀片平铺于冰袋上。对照小鼠脑解剖图谱，参照bregma位置找到ap(-1.3～-3.3)，用直径1mm平口针头戳取脑冠状片目标区域脑组织，浸入装有10ulrna组织保存液rnaguarder(zh0103-a,huayueyangbiotechnology,beijing,china)的1.5ml离心管中，后移入-80℃冰箱冻存备用。rna抽提、建库提取样品总rna，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体rna后；加入打断试剂将rna打断成短片段，以打断后的rna为模板,用六碱基随机引物合成一链cdna，然后配制二链合成反应体系合成二链cdna，在cdna二链合成时以dutp代替dttp,然后连接不同接头，再利用ung酶法将含有dutp的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cdna一链；使用试剂盒纯化cdna一链；纯化的cdna一链再进行末端修复、加a尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行pcr扩增；构建好的文库用agilent2100bioanalyzer质检合格后，使用illuminahiseqtm2500或其他测序仪测序。real-timepcr(rt-pcr)验证根据测序结果及标准rna序列，设计circrna探针及引物。依据差异倍数fc≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠前额皮层10个差异circrna进行rt-rcr检测。每个circrna样本平行重复3次。比较nc组和sz组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circrna再在sz组和treated组样本中进行rt-pcr检测。

在本发明的第三方面，提供了一种：精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标志物试剂盒，其能够测定circrna1、circrna2、circrna3、circrna10表达水平。

在本发明的第四方面，提供了一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物，所述标记物为circrna3、circrna10。

在本发明的第五方面，提供了上述精神分裂症神经发育小鼠模型转归生物标记物的检测方法：取适量抗精神病药(奥氮平)治疗后精神分裂症神经发育小鼠模型的前额皮层组织，从中提取总rna，并进行正态化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量pcr，得到circrna20表达水平。以选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-actin作为rt-pcr实验内参，以δct值(δct＝cttarget-ctβ-actin)表示目标rna的相对表达水平；使用fpkm法(fragmentsperkbpermillionreads)统计目标rna表达量；采用nb(负二项分布检验)检验目标rna差异显著性。通过建立circrna20表达水平的常模，得到标准化值。

在本发明的第六方面，提供了一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归检测试剂盒，其能够测定前额皮层组织中circrna3、circrna10的含量。

在本发明的第七方面，提供circrna靶基因网络图及前额皮层中差异circrnago/kegg富集分析结果。

本发明的有益效果在于：

1、可客观检测精神分裂症神经发育小鼠模型的circrna表达水平，提高精神分裂症神经发育小鼠模型的准确性、标准化和成功率；

2、有望通过circrna模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定circrna表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路恢复正常，进而治疗精神分裂症；3、有望通过检测特定circrna表达水平对用药进行疗效预测；

4、有望通过检测特定circrna表达水平对精神分裂症患者转归及预后情况进行预测；

5、有望通过circrna模拟物和拮抗物对精神分裂症某种症状进行精准化治疗。

附图说明

图1a表示模型组前额皮层差异rna全转录组分析的聚类图；图1b表示用药组前额皮层差异rna全转录组分析验证的聚类图(筛选条件:p<0.05且差异倍数>2)，红色代表相对高表达，绿色代表相对低表达。

图2kegg富集对应通路图。

具体实施方式

1、研究对象

本研究使用c57bl/6小鼠，其常被认为是“标准”的近交系小鼠，具有高度的遗传背景稳定性，是继人类之后第一个完成基因组测序的哺乳动物。亲代7～8周龄c57bl/6小鼠，自江苏大学实验动物中心(实验动物生产许可证编号：scxk(苏)2013-0011)购入，spf级，雄性20只，雌性45只，按雌雄、同性别每4～5只分笼饲养，在新动物饲养房内继续饲养2周后开始子代鼠繁育。动物饲养房温度21±1℃，光照昼夜颠倒(关灯：08:00～20:00，开灯20:00～08:00)，除特殊说明外，所有动物均有充足食物和水供其自由取食。

子代鼠繁育：为使雌性小鼠发情期一致以便获得受孕期一致的孕鼠，依据meyer等的报道，在交配前3天按每2～3只雌鼠与1只雄鼠铁丝网隔开合笼饲养，于第4天08:00去除铁丝网，每4～5h检查一次交配情况，查到阴道栓记为孕0天(gd0)。超过5天末受孕雌鼠即予排除。

本研究获得解放军第904医院动物实验伦理委员会批准。

2、研究方法

①母体孕期免疫刺激：免疫刺激组(p+)小鼠在雌鼠gd9时按6mg/kg剂量尾静脉注射(i.v.)poly(i:c)，poly(i:c)溶液均用无菌生理盐水配制，并稀释至1.2mg/ml，最终以5ml/kg的体积进行注射，非免疫刺激组(p-)则注射无菌生理盐水。所有注射溶液均现配现用。

②子代鼠青春期应激：经poly(i:c)或生理盐水注射处理后的雌鼠所产子代鼠于出生后第21天(pnd21)进行断奶和分笼(饲养笼规格：28cm×18cm×14cm)，为减少窝别效应的影响，同窝小鼠按性别平均分配到青春期应激组(s+)和无应激组(s-)中。子代鼠按性别及处理因素，同性别同处理因素按每3-4只/笼饲养。青春期应激组在pnd31～40天进行慢性不可知应激干预，无应激组则正常饲养不予其他任何干预处理。参考ducottet和sandra的设计，青春期慢性不可知应激按如下方法依次给予：浸湿锯末垫料(day1)、饲养笼倾斜45°(day2)、足底电击(day3)、食物剥夺(day4)、无垫料(day5)、束缚应激(day6)、水剥夺(day7)、夜间相照明(day8)、强迫游泳(day9)、社交应激(day10)。

③药物干预本研究所用奥氮平(olanzapine,olz)标准品由中国仪器药品检定研究院(id：v4v2069gu，编号：100948-200801)提供。将接受双重应激的小鼠分为用药组(treated)和模型组(sz)，接受olz干预的用药组小鼠，均通过小鼠日常饮水给予，给药剂量1.5mg/(kg·d)，饮水瓶经过避光处理，避免药液因光照分解。给药当天测得小鼠体重和前4天的饮水消耗量，计算首次给药的饮水浓度。olz以少量冰醋酸溶解后，用蒸馏水稀释至1mg/ml，用nahco3调节ph至6.0±0.2，根据每笼小鼠体重和饮水消耗量计算饮水给药浓度，将配制好的药液稀释至目标浓度。用药组小鼠每笼每4天重新测量一次体重及饮水消耗量，校正饮水药物浓度，并更换饮水药液。模型组则正常饮水。

④前脉冲抑制(ppi)实验本研究通过声惊跳反射ppi测试系统(sr-lab,sandiegoinstruments,sandiego,ca,usa)对ppi功能进行检查。整个测试过程由4种刺激类型组成：单个pulse(120dba、时长40ms的白噪音)、单个prepulse(包含69、73、77、81及85dba5种不同声压级的白噪音，即分别高于背景噪音4、8、12、16和20dba，持续20ms)、prepulse+pulse(prepulse与pusle开始输出的时间间隔为100ms)和background(仅背景噪音65dba)。整个刺激序列包含最初的6个pulse、中间的12个block(pulse×1，prepulse×5、prepulse+pulse×5及background×1，伪随机化排列处理)和结尾的6个pulse。声音刺激序列相邻两个刺激的间隔为15±5s(即为10～20s)。评价指标：对应于每个不同强度prepulse+pulse，ppi功能以前脉冲抑制率(ppi％)表示，公式为：ppi％＝[(pulse平均反应强度－prepulse+pulse平均反应强度)/pulse平均反应强度]×100％。其中，开始和结尾各6个pulse不纳入计算。

⑤脑组织采集对照组(nc)、精神分裂症模型组(sz)、治疗组(treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑，将小鼠脑腹面朝上放入冰袋预冷的小鼠脑冠状切片模具(037-001,huayueyangbiotechnology,beijing,china)，用双面刀片将小鼠全脑切成1mm厚的冠状切片，将粘附有脑冠装片的刀片平铺于冰袋上。对照小鼠脑解剖图谱，参照bregma位置找到ap(-1.3～-3.3)，用直径1mm平口针头戳取脑冠状片目标区域脑组织，浸入装有10ulrna组织保存液rnaguarder(zh0103-a,huayueyangbiotechnology,beijing,china)的1.5ml离心管中，后移入-80℃冰箱冻存备用。

⑥rna抽提、建库提取样品总rna，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体rna后；加入打断试剂将rna打断成短片段，以打断后的rna为模板,用六碱基随机引物合成一链cdna，然后配制二链合成反应体系合成二链cdna，在cdna二链合成时以dutp代替dttp,然后连接不同接头，再利用ung酶法将含有dutp的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cdna一链；使用试剂盒纯化cdna一链；纯化的cdna一链再进行末端修复、加a尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行pcr扩增；构建好的文库用agilent2100bioanalyzer质检合格后，使用illuminahiseqtm2500或其他测序仪测序。

⑦real-timepcr(rt-pcr)验证根据测序结果及标准rna序列，设计circrna探针及引物。依据差异倍数fc≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠前额皮层10个差异circrna进行rt-rcr检测。每个circrna样本平行重复3次。比较nc组和sz组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circrna再在sz组和treated组样本中进行rt-pcr检测。

全部数据使用graphpadprism7.0和statviewversion5.0软件进行统计分析。选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-actin作为rt-pcr实验内参。以δct值(δct＝cttarget-ctβ-actin)表示目标rna的相对表达水平。使用fpkm法(fragmentsperkbpermillionreads)统计目标rna表达量。采用nb(负二项分布检验)检验目标rna差异显著性。使用独立样本t检验、单因素方差分析、非参数检验kruscal-wallistest分析组间目标rnaδct值差异。差异转录组合集采用go功能分析与kegg通路分析。使用pearson法进行差异rna间相关性分析。所有统计分析均为双侧显著性检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

3、研究结果

①各组小鼠前额皮层中差异表达circrna的测序分析

与对照组相比，模型组存在137种差异表达的circrna，其中62种上调、75种下调。见附图1a。

用药组与模型组对比发现，circrna存在132个差异表达，其中75个上调、57个下调。见附图1b。

②各组小鼠前额皮层中差异rna的rt-pcr验证

对照组和模型组中10个circrnart-pcr验证结果显示，circrna1，circrna2，circrna3，circrna10存在统计学差异(p<0.05或p<0.0001)，其余均无显著差异(p﹥0.05)。见表1。表2显示了4个模型组中有显著差异的circrna用药后的表达水平。其中circrna3、circrna10在模型组中表达下调，在用药组中表达上调(p<0.0001)，且差异表达趋势与全转录组测序一致。

表1对照组和模型组前额皮层中circrnaδct值比较

表2对照组和模型组前额皮中circrnaδct值比较

③模型组中circrna的功能分析

前额皮层中差异circrna3，circrna10的go/kegg富集分析，结果见表3、4，附图2。

表3circrna4对应靶基因的kegg显著性富集分析

表4circrna10对应靶基因的kegg显著性富集条目

综上所述，我们认为circrna20能够作为反映精神分裂症神经发育小鼠模型生物标记物。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。