本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及cyp2d6基因多态性和拷贝数的检测领域。
背景技术：
cyp2d6是第一个被确认由单基因控制的p450酶，cyp2d6是位于第22号染色体上，其含有9个外显子和8个内含子，总长5400bp左右，是一个完整的功能性基因。有研究发现，cyp2d6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为cyp2d7p基因和cyp2d8p基因，cyp2d7p基因与cyp2d6基因有97％的核酸序列同源性，而且带有tata盒，但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶(t)，从而改变了读码框架，使转录提前终止；cyp2d8p基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。cyp2d7p和cyp2d8p基因在人体足迹中均不表达，只有cyp2d6在肝、肠、肾和人脑中表达。
现代研究发现，肝脏中cyp2d6的含量仅占p450肝脏蛋白总量的2％，但是它却参与代谢约25％的临床用药，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种cyp2d6等位基因的变异，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。为了简化基因型解释和提高表型预测，临床药物基因组学实施联盟(cpic)根据“activityscore”(as)ystem将等位基因的活性分数分为全功能型等位基因(分数值1)，功能减少型等位基因(分数值0.5)，无功能型等位基因(分数值0)，将所有等位基因活性分数相加得到as值，根据as值评估各类cyp2d6型别人群的活性分数确定pm(弱代谢型，as值0)、im(中间代谢型，as值＝0.5)、em(正常代谢型as值1-2)和um(超快代谢型as值>＝2)4种代谢类型。
cyp2d6基因的两种正常基因型为cyp2d6*1和cyp2d6*2，其中cyp2d6*2为c2850t突变。中国人群中五种常见突变基因型为cyp2d6*3、cyp2d6*4、cyp2d6*5、cyp2d6*10和cyp2d6的基因拷贝数变异。cyp2d6*3为a2549del缺失突变，cyp2d6*4为c100t和g1846a共同突变，cyp2d6*5为整个基因缺失突变，cyp2d6*10为c100t突变，此外还有整个基因的拷贝数变异。
目前测量cyp2d6基因多态性和拷贝数的方法主要有pcr荧光定量、直接测序法、pcr-单链构象多态性分析(sscp)检测，液相和固相芯片法等。直接测序法、pcr-单链构象多态性分析检测无法检测拷贝数变异，目前的pcr法仅检测多态性或者拷贝数变异的其中一种，且由于假基因同源性高的原因灵敏度低。而液相或固相芯片法能够同时检测多态性和拷贝数变异，但需要采购配套的液态或固态芯片耗材以及专用的芯片读取仪器，需要合成探针芯片，成本高，且需要和其它基因一起设计，探针芯片不能太少，不能单独用来检测cyp2d6，灵敏度均不高，检测结果可重复性差。
因此，本领域需求一种能够同时检测cyp2d6基因的多态性和拷贝数，并且灵敏度高，不需要专用的仪器，以及成本低的产品。
技术实现要素：
有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种寡核苷酸对组合物在制备检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途，所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如seqidno:1～5所示；
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如seqidno:6～10所示；
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
所述测序引物和所述标签序列是本领域技术人员根据所选择的具体测序平台能够通过常规方法所确定。
所述标签序列是4-12个n碱基，例如可以是8个n碱基。
标签序列的目的是通过分子溯源，还原原始分子，例如如果同一起点和终点的相同序列，这个分子标签序列一致，则判为同一分子，不同分子标签序列，则为不同分子，进而能够去除pcr扩增偏倚，提高准确性，利于准确的判断拷贝数。
在一个具体实施方案中，当使用illumina平台时，其测序引物可以是例如，acacgacgctcttccgatct。
使用本发明的组合物能够同时检测cyp2d6基因的多态性和拷贝数，并如实施例所示，本发明的组合物对57例样品进行检测，分别检测出了cyp2d6基因的多态性和拷贝数，不需要专用的仪器，成本低。
进一步地，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如seqidno:11所示的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如seqidno:12所示的序列。
通过使用上述序列，能够使得以rpp30对应的扩增子(2倍体)为基准参照，通过cyp2d6与rpp30的分子数的比较能够更准确的推断cyp2d6的拷贝数。
在第二方面，本发明还提供了一种寡核苷酸对组合物，其包括：所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：
gagaacaggtcagccaccactatgca(seqidno:1)，
gctggatgagctgctaactgagcaca(seqidno:2)，
ggcagtggcagggggcctggtga(seqidno:3)，
ccttacccgcatctcccacccccaa(seqidno:4)，
ggggtcaccaggaaagcaaagaca(seqidno:5)；
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：
caggttctcatcattgaagctgctctc(seqidno:6)，
ggatgacctgggacccagcccag(seqidno:7)，
gtagcgtgcagcccagcgttggc(seqidno:8)，
gacgcccctttcgccccaacggt(seqidno:9)，
ccatggtggctgggccggggc(seqidno:10)；
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
进一步地，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如seqidno:11所示的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如seqidno:12所示的序列。
进一步地，所述寡核苷酸对组合物进一步包括扩增引物。
所述寡核苷酸对组合物的第一区域即是测序引物，还是扩增引物的靶标序列。
所述扩增引物可以由本领域技术人员根据寡核苷酸对组合物的第一区域的序列以及所使用的测序芯片的种类进行常规设计而得到。
进一步地，所述扩增引物还具有条形码(barcode)序列，目的是区分样品，多样品混合检测时能够从测序数据中拆分样品，从而区分每个样品的测序数据。
在一个具体实施方案中，所述扩增引物例如可以是：
正向：
aatgatacggcgaccaccgagatctacactcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag；
负向：
caagcagaagacggcatacgagat[barcode]gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag
在优选的实施方案中，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为ggctctgcgcggacttgtggaga(seqidno:11)的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为cagccgctcaccgtgagttgccc(seqidno:12)的序列。
在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的寡核苷酸对组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括提取dna所需试剂，用于多重连接探针扩增技术(mlpa)所需的试剂，用于pcr的其他试剂，如mg2+、dntps、dna聚合酶、pcr缓冲液等中的至少一种。
第四方面，本发明还提供了上述试剂盒在检测cyp2d6基因的多态性和拷贝数中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述多态性和拷贝数为选自cyp2d6*3、cyp2d6*4、cyp2d6*5、cyp2d6*10和cyp2d6的基因拷贝数变异中的一种或更多种。
在第五方面，本发明提供了用于检测cyp2d6基因的多态性和拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样品的dna；
2)使用上述本发明的寡核苷酸组合或试剂盒对步骤1)获得的dna进行mlpa；
3)将得到的产物进一步扩增之后测序；
4)分析结果。
所述将得到的产物进一步扩增，是指将所述经过mlpa得到的产物进一步扩增其拷贝数，扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应、等温扩增(例如rpa)等。
具体实施方式
实施例
1、设计引物
本发明将mlpa与测序结合在一起而设计引物，首先，本发明在cyp2d6*2(c2850t，rs16947)、*3(a2549del，rs35742686)、*4(g1846a，rs3892097)、*10(c100t，rs1065852)位点设计mlpa探针对，f引物3’端最后一个碱基为多态性位点，f和r的特异性结合序列的tm值≧72℃，然后，f引物特异性序列5’端加上8个n碱基的分子标签序列和illumina平台测序引物acacgacgctcttccgatct，r引物特异性序列3’端加上illumina平台测序引物agatcggaagagcacacgtc。再在cyp2d6基因内保守区域exon9和cyp2d6基因外保守区域设计参照引物对。
表1、探针引物
表2、扩增引物
2、探针混合物配制
将上述引物稀释至10μm，再等量混合，稀释至0.3nm每条探针，即为探针混合物。
3、mlpa试剂盒变性连接
mlpa试剂盒为荷兰mrc-holland公司的
血液提取人基因组dna后，取20ng(体积不大于5μl，小于5μl补水)于0.2mlpcr管中，放置于pcr仪器上95℃，5min变性，25℃备用。
准备杂交缓冲液，按照每个样品1.5μlmlpa缓冲液(yellowcap)+1.5μl探针混合物的量进行混合，并震荡混匀，取3μl加入到已经变性好25℃备用的人基因组dna中，放置于pcr仪器中，进行下一个程序：95℃1min，60℃。60℃孵育16～20h，进行连接反应。
配制连接反应液，按照每个样品3μlligase-65缓冲液a(mrc-holland)，3μlligase-65缓冲液b(mrc-holland)，1μlligase-65酶(mrc-holland)，25μlddh2o进行混合，并震荡混匀。完成连接反应后，进入下一程序54℃，取32μl混合物在pcr仪器上加入到54℃孵育的杂交反应液中，进入下一个程序54℃15min，98℃5min，15℃，温度降至15℃后即可将样品从pcr仪器中拿出来。
4、pcr扩增
准备pcr扩增mix，pcr扩增试剂盒为neb的q5热启动高保真dna聚合酶，每个样品按照下表配制：
配制后，震荡混匀，取15μlpcr混合液加入10μl连接反应液，于pcr仪器中进行下列程序：98℃30s，35cycs(98℃10s，63℃15s，72℃20s)，72℃20min，4℃。pcr完成后，加入25μl(1.0×)的xp磁珠混匀，静置5min，放置于磁力架上澄清，吸弃上清，不要吸到沉淀，加入80％乙醇，吹打10次后，澄清吸弃上清，再用80％乙醇洗涤1次，吸弃上清，从磁力架上取下，于37℃烘干，时间不要超过3min，加入ddh2o混匀，静置3min，放置于磁力架上澄清，取上清，勿吸到磁珠，即为纯化好的dna产物。dna产物用qubit2.0荧光计(lifetechnologies)测浓度。
5、上机测序
测完浓度的样品按照等摩尔量计算进行混合，混合后测浓度，再按照所需数据量跟其它样品混样，将混合的上机样品稀释至合适浓度进行变性稀释至合适的上机浓度。使用illumina公司的测序仪nextseq500测序，测序试剂盒使用nextseqhighoutputkitv2(75cycle)。
6、数据分析
根据样品barcode序列进行样品测序数据拆分，得到每个样品的fastq下机数据。分别对每个样品的fastq数据进行分析，将fastq数据进行质控，使用trimmomatic软件剪除adapter序列、过滤低质量的reads后，得到cleanreads。对cleanreads按不同扩增子进行拆分并与模板序列进行比对。筛选扩增子左、右探针正确连接的reads，并根据每个reads5’端的前8随机碱基序列标签统计每个扩增子对应的唯一分子数。根据统计到的各扩增子的唯一分子数计算检测样品cyp2d6基因型别。
cyp2d6拷贝数推算主要包括如下步骤：以rpp30对应的扩增子为基准参照(2倍体)，将位于cyp2d6基因9号外显子上的保守序列扩增子e9对应的分子数进行比较推断cyp2d6基因在被测样品中的拷贝数情况，即cyp2d6e9的分子数比上rpp30的分子数，比值在0.9到1.1间则认为cyp2d6为正常的2拷贝，若比值为在1.5±0.1范围内则为3拷贝；cyp2d6基因的*2、*3、*4和*10各型别拷贝数推断方法类似，以e9的分子数为基准参照，将各型别特异的扩增子统计到的分子数与其相比较，通过比值推断cyp2d6各型别以及对应拷贝数。
7、结果分析
对57例样品进行测序，推断rpp30和cyp2d6各扩增子统计到的分子数以及型别、拷贝数，并且同时为了进一步证明通过本发明的方法所得到的结果的正确性，还通过传统的sanger测序法对这57例样品进行结果验证，所有结果如下表1所示：
表1
根据cpic指南，cyp2d6活性为0的等位基因为：*3，*4，*5；活性为0.5的等位基因为：*10；活性为1的等位基因为：*1，*2。cyp2d6代谢类型根据as分级，0＝pm，0.5＝im，1-2＝nm，>2＝um。57例样品统计代谢类型如下表2所示：
表2
与仅检测多态性的方法对比，6例样品存在as值不一致，3例样品(g0000000024、g0000000037、g0000000040)代谢类型结果判定不一致，如表3所示：
表3
同时，为了进一步验证本发明的方法是否正确，将上述与多态性的方法对比结果不一致的样品进行经芯片捕获靶向测序法验证。
实验结果表示，上述6例样品经芯片捕获靶向测序法验证snp和拷贝数，其结果和本方法一致。