一种生物膜角膜贴片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是再生医学和组织工程领域，涉及一种生物膜角膜贴片及其制备方 法和应用，具体的说，涉及一种由人骨髓间充质干细胞与蚕丝蛋白生物膜构建形成的角膜 贴片及其制备方法，用于治疗角膜损伤的等疾病。
【背景技术】
[0002] 角膜是眼球最前部的突出部分，直接与外界环境相接，因而容易遭受外界的损伤。 人眼角膜共分5层，角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。最外层的角膜上皮 具有屏障功能，是保持良好视力的关键。角膜位于眼球最前面，由于经常暴露于空气中，容 易感染细菌，其发生机械性及化学性损伤的概率较高，从而导致角膜炎症甚至角膜溃疡。角 膜溃疡是眼科致盲的常见眼表疾病，溃疡波及深部者愈合时间长，反复发作造成角膜细胞 的严重破坏形成角膜溃疡甚至穿孔，治疗棘手。且该疾病具有诊断不明，病程易反复、迀延 的特点。对于药物难以控制的角膜溃疡，常行角膜移植。
[0003]目前，临床上传统治疗角膜溃疡等疾病的方法一般有以下几种：（一）传统的角膜 移植，术后短期角膜透明，其主要缺点为仅中央〇7mm光学透明区移植，对干细胞缺失无 效，因排斥反应明显，需要长期使用免疫抑制剂配合治疗；（二）自体角膜缘移植，虽然无免 疫排斥反应，但材料来源受限，主要缺点为增加健眼患病的危险性，不能360度环装移植， 效果受限；（三）异体角膜缘移植，供体材料极为有限，治疗机会非常少，并且免疫排斥反应 明显，需要长期用药，费用很高。以上移植方法，费用昂贵，不能及时得到角膜材料，以及术 后可能发生排斥反应而限制了其在治疗角膜溃疡中的应用。
[0004] 近年来，组织工程化人工角膜技术日趋成熟，为临床上治疗角膜疾病提供了一个 新的思路。它是以可降解材料为支架，在体外进行细胞培养，让细胞在材料表面及内部进行 三维生长、分化为多层细胞，最后得到类似于供体角膜的"人工供体角膜"，主要由种子细胞 和支架材料构成。
[0005] 理想的构建组织工程角膜种子细胞应该具备以下条件：容易分离培养，有较强的 增殖能力且能长期保持其特有的生物活性和特性，无免疫原性，无异源污染等。骨髓间充质 干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)获取方便，体外增殖能力强，有多向分化潜 能，能向骨、脂肪、软骨、神经等各个胚层的组织分化，因此被广泛地应用于再生医学。同时， BMSCs有旁分泌功能，参与免疫调节；不表达MHC-II或共刺激分子，无免疫原性；对CD4+/ CD8+ T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等都有抑制作用。在角膜碱烧伤的治疗方面，研宄 报道BMSCs有减轻炎症的作用，从而促进角膜的损伤修复。BMSCs的这种治疗作用，为调节 炎症反应和减少移植物排斥提出了一种新思路。
[0006] 用于组织工程构建活性人工角膜的支架材料，其生物相容性要好，种子细胞能够 在其内正常生长且形成近似体内器官的正常结构，并具备角膜特有的透明、屈光、透氧等特 性。目前较常用的支架材料有脱上皮的角膜基质、羊膜、胶原、天然珊瑚、纤维蛋白等材料。 现有的几种生物支架材料存在一定的缺点：天然高分子材料虽生物相容性好，但力学性能 欠佳，降解过快，不利于细胞营养物质向材料内扩散。由于伦理道德的影响，羊膜自身亦存 在供体来源缺乏的问题，且羊膜存在传播肝炎、人类免疫缺陷病毒（HIV)等感染性病毒的风 险，加上羊膜的透明性低，植入体内难以完全恢复角膜的透明性，影响了患者视觉功能的恢 复，这些问题都极大地限制了羊膜在临床中的进一步推广和应用。
[0007] 蚕丝蛋白是一种可降解的生物大分子，因其力学性能良好、可调范围大，骨再生能 力好，在组织工程领域，常被作为植入材料用于研宄其成骨作用。蚕丝蛋白具有水溶性，在 制备过程中可避免有毒溶剂的使用，生物安全性好，可在体内降解。另外，蚕丝蛋白本身是 天然蛋白质多肽，生物相容性好，不易激发免疫反应。蚕丝蛋白在体内和体外均可降解，降 解时间稳定，最终降解产物是氨基酸或寡肽，对机体没有毒害作用。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，结合再生医学和组织工程技术，本发明利用骨髓间充质干 细胞作为种子细胞；构建蚕丝蛋白生物膜作为载体，制备形成角膜贴片。针对角膜溃疡、角 膜缺损、角膜混浊等一系列的角膜损伤疾病的治疗，本发明种子细胞与支架的紧密附和，既 可提供充足营养又能有效阻止新生血管，对眼表修复和重建具有显著效果，有良好的应用 前景。
[0009] 本发明的目的是提供一种全新的由骨髓间充质干细胞构建生物膜角膜贴片，该贴 片应用于角膜溃疡等角膜损伤疾病的治疗。
[0010] 本发明的另一个目的是提供上述生物膜角膜贴片的制备方法。
[0011] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种生物膜角膜贴片是由接种于支架材料上的种子细胞和形成三维空间的生物膜支 架构建组成，其中所述的种子细胞是骨髓间充质干细胞，所述的生物膜支架是蚕丝蛋白生 物膜。
[0012] 进一步的，所述的骨髓间充质干细胞的接种密度为（1~10)xio6/cm2,优选 7X106/cm2〇
[0013] 进一步的，所述的蚕丝蛋白生物膜的质量含量为1%~10%，优选2% ;膜干燥温度条 件为10°C~60°C，优选25°C ;膜干燥的湿度条件为25%~60%，优选50%。本支架材料既能 维持种子细胞的位置、形态，也能参与细胞分化状态的调控。
[0014] 进一步的，所述的骨髓间充质干细胞来源于同种异体。
[0015] 一种生物膜角膜贴片的制备方法，由下述步骤组成：（1)蚕丝蛋白生物膜支架的 制备；（2)骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定；（3)骨髓间充质干细胞的接种；（4)生物 膜角膜贴片的制备；（5)生物膜角膜贴片的移植。
[0016] 所述的步骤（1)的具体操作方法是：称取适量桑蚕丝置于0. 5%的无水碳酸钠溶 液中，浴比1 :50,于90°C~100°C处理30min，重复3次(最后一次用去离子水)。脱胶后洗 净，60°C烘箱干燥后得到精炼蚕丝。将脱胶完的生丝溶解在9. 5mol/L的溴化锂溶液中，然 后将溶液在去离子水中透析3d。透析完的丝蛋白溶液离心去除极少量絮状沉淀物后，用重 量法标定丝蛋白溶液的浓度，然后加入适量的去离子水将溶液稀释至丝蛋白的质量分数为 1%~10%。将lml再生蚕丝蛋白溶液移入3cmX3cm的塑料盒中，在10°C~60°C温度，25%~ 60%相对湿度下，放置过夜，使其自然干燥成膜(约需24h)。所得的再生蚕丝蛋白膜膜厚约 为5 y m，蒸馏水浸泡48小时，每隔8h时更换蒸馏水。取出材料薄膜，干燥后分别用PBS及 培养基各浸泡ld，备用。
[0017] 本发明的支架材料，其中蚕丝蛋白的质量分数为1%~10%，经动物体内回植实验 验证，该支架材料具有较好的生物相容性及适宜的体内降解速度，且降解产物无毒。
[0018] 进一步的，所述的步骤（2)的具体操作方法是：BMSCs分离及传代培养：取人骨髓 5~10ml，肝素抗凝，用等量的PBS稀释，按2 : 1比例加在Ficoll淋巴细胞分离液上，400g 离心30 min，取中间白膜层，用PBS洗涤3遍，用含10%FBS的a-MEM培养基调整细胞浓度为 1 X 106个/ml接种于9cm培养皿中。运用差速贴壁法37°C，5%C0 2条件下培养48小时后半 量换液，4d全量换液弃去未贴壁的细胞。倒置相差显微镜下观察细胞的生长，待细胞长到 85%融合时，用0. 25% trypsin-EDTA进行消化，按1 : 2的比例进行传代，之后约48小时换 液一次，3~4日传代一次。取传代4~6代后的细胞用于流式细胞检测及细胞的增殖和形 态学实验，各组细胞以2 X 105/孔，接种于铺有各组材料的24孔板中，37°C，5%0)2条件下培 养，每48~72小时换液。
[0019] BMSCs的鉴定：将体外培养4~6代的BMSCs用PBS多次洗漆后；加入荧光标记的 抗体；4°C、孵育30min ;PBS洗去未结合的抗体，1%多聚甲醛固定；应用FACScan流式细胞仪 检测细胞表面抗原表达。
[0020] 进一步的，所述的步骤（3)的具体操作方法是：BMSCs传代扩增到第三代后接种 于支架材料上制得细胞材料复合物；于培养箱