生物膜抑制肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了生物膜抑制肽及其应用，生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其制备方法简单，能够通过常规的固相合成方法进行合成，纯化后的生物膜抑制肽能够抑制表皮葡萄球菌生物膜形成和表面粘附，能够与其他抗菌药物联合应用于抑制耐药性表皮葡萄球菌，对临床治疗表皮葡萄球菌感染具有重要意义。
【专利说明】生物膜抑制肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及生物膜抑制肽，还涉及生物膜抑制肽的应用。
【背景技术】
[0002] 以表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis)为代表的病原菌常黏附于植入 或侵袭性操作的医疗器械表面，包括导管、假体、人工心脏瓣膜、人工关节等，并形成细菌生 物膜（Bacterialbiofilm，BF)。与浮游细菌不同，BF细胞间有着严密的化学信号传导交流 信息，并建立致密的三维立体空间结构，该结构能逃避宿主免疫系统的攻击，并对抗生素产 生耐药性，在临床上常表现为迁延不愈，造成了极大的临床危害。然而，目前针对表皮葡萄 球菌感染缺少有效的防治手段。因此，急需一种对表皮葡萄球菌的BF形成具有抑制作用的 药物，为临床治疗耐药性表皮葡萄球菌感染奠定了基础。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供生物膜抑制肽，为表皮葡萄球菌感染提供 新的药物；本发明的目的之二在于提供生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌生物膜形成 的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌表面 粘附的药物中的应用。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 1、生物膜抑制肽，所述生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 2、所述的生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的药物中的应用。
[0007] 优选的，所述表皮葡萄球菌为表皮葡萄球菌ATCC35984。
[0008] 3、所述的生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌表面粘附的药物中的应用。
[0009] 优选的，所述表皮葡萄球菌为表皮葡萄球菌ATCC35984。
[0010] 本发明的有益效果在于：本发明公开了生物膜抑制肽，该多肽是基于内酰胺 酶抑制蛋白与内酰胺酶之间空间结构，通过计算机分子三维模拟设计构建的多肽分 子，对获得的多肽分子进行对生物膜的抑制研究，结果显示生物膜抑制肽能够明显抑制表 皮葡萄球菌BF的形成和表面粘附，此结果提示0 -内酰胺酶和BF之间或是各种耐药机制 之间存在相关联系，但需进一步深入研究。由于生物膜抑制肽具有抑制表皮葡萄球菌BF的 形成和表面粘附，所以可以与其他抗菌药物联合用于耐药性表皮葡萄球菌感染的治疗，为 表皮葡萄球菌感染的治疗提供新的候选药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0012] 图1为生物膜抑制肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的生长曲线。
[0013] 图2为结晶紫法测定生物膜抑制肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制效果。
[0014] 图3为结晶紫法测定生物膜抑制肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制作用的 0D值（注：*表示与对照组比较P〈0. 05 表示与对照组比较P〈0. 01)。
[0015] 图4为激光共聚焦检测生物膜抑制肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制作 用X40 (A为对照组，粘附的细菌较多，形成的BF结构致密；B为生物膜抑制肽组，粘附的细 菌较少，结构较为疏松）。
[0016] 图5为结晶紫法测定生物膜抑制肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的粘附作用（注： **表示与对照比较P〈〇. 01)。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018] 本发明以下实施例使用的菌株为表皮葡萄球菌ATCC35984,胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)培养基、异硫氰酸荧光素标记的刀豆球蛋白（FITC-ConA)和碘化吡啶（PI)购自美 国Sigma公司，Mueller-Hint〇n(MH)肉汤培养基购自北京陆桥公司，CS136XT多肽合成仪 购自美国CSBio公司，E2695分析型高效液相色谱仪购自美国Waters公司，LC6000制备型 高效液相色谱仪购自北京创新通恒公司，AutoflexSpeed质谱仪购自德国Bruker公司， Multiskanspectrum酶标仪购自美国Thermo公司，LSM780激光共聚焦购自德国ZEISS公 司。
[0019] 实施例1、合成生物膜抑制肽
[0020] 生物膜抑制肽（以下简称PT-8多肽）含有8个氨基酸残基，其序列为：Pro Tyr Gly Gly Phe Ser Phe Thr(PYGGFSFT)(SEQ ID NO. 1)，利用人工标准固相合成方案，在固 相多肽合成仪上进行，固相支持剂为树脂，流动相为二甲基甲酰胺/二氯甲烷（1 :1)。经 过多步反应合成如SEQ ID NO. 1所示的多肽。合成肽使用LC6000高效液相色谱仪，C18柱 (Kromasil 20X250mm C18120A)进行纯化，收集产物峰获得纯度96.8%的PT-8多肽，真空 干燥，称量，20mg/瓶分装，-20°C保存备用。然后进行质谱鉴定，分子量为874. 4Da，结果表 明ESI-MS m/z:875. 5[M+H]和438. 25[M+2H]，PT-8的分子离子峰与合成预期结果一致。
[0021] 实施例2、PT-8多肽抑菌试验
[0022] (1)微量肉汤稀释法测定PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的最低抑菌浓度 (MIC)
[0023] 取表皮葡萄球菌ATCC35984接种于哥伦比亚血平板上，在37°C培养24h后挑取 单个菌落于装有l〇ml MH肉汤的锥形瓶中，37 °C振摇24h，然后收集菌液并将菌液稀释至 106CFU/ml，将稀释后的菌液分别接种于96孔板中，每孔100 y L，再加入实施例1合成的多 肽至终浓度分别为256 y g/ml、128 y g/ml、64 y g/ml、32 y g/ml、16 y g/ml、8 y g/ml、4 y g/ ml、2ii g/ml和1 ii g/ml，并控制终体积为200ii L，MH肉汤为空白对照，然后置于37°C、5% C〇2条件下培养24h，肉眼观察以抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC值，同一浓度水平 重复3次。结果显示，PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的MIC值大于256ii g/ml，说明 PT-8多肽对表皮葡萄球菌细菌ATCC35984无直接抑菌作用。
[0024] (2)测定PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的生长曲线
[0025] 取表皮葡萄球菌ATCC35984接种于哥伦比亚血平板上，在37°C培养24h后挑取单 个菌落于装有l〇mlTSB培养基的锥形瓶中，37°C振摇24h，然后收集菌液并将菌液稀释至 106CFU/ml，将稀释后的菌液分别接种于24孔板中，每孔500yL，再加入500yL实施例1合 成的多肽至终浓度为 256yg/ml、128yg/ml、64yg/ml、32yg/ml和 16yg/ml的PT-8 的 TSB培养基，于37°C下同时培养，每2h测量菌液在600nm波长下的吸光度值。根据测定结 果以菌液600nm波长下的吸光度值OD_为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线，结果如图1 所示。结果显示，各浓度的PT-8多肽均不会抑制表皮葡萄球菌ATCC35984的生长。
[0026] (3)PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制率
[0027] 采用96孔板结晶紫染色法测定BF抑制率，测定和计算方法参考文献（SarkarR， ChaudharySK,SharmaA,etal.Anti-biofilmactivityofMarula-astudywiththe standardizedbarkextract.JEthnopharmacol, 2014,154 (1) :170_175)〇 具体方法为： 在聚苯乙烯材质的96孔板各排中，分别加入100yLTSB培养基配制的PT-8多肽，并控制 PT-8 多肽终浓度分别为 256iig/ml、128iig/ml、64iig/ml、32iig/ml和 16iig/ml，然后接种 100yL菌液使细菌浓度为106CFU/ml，同时以TSB培养基200iiL为空白对照组，以TSB培 养基100]iL和菌液100liL混合液为阴性对照组，然后将培养板置于37°C恒温培养箱培养 20h，培养后吸取孔内菌液，PBS洗涤3次，风干后加入200iiL质量分数为1 %的结晶紫溶 液染色l〇min，PBS洗涤3次；加入200yL体积分数为33 %的醋酸溶液溶解BF-结晶紫复 合物，结果如图3所示。并用酶标仪测定波长590nm处吸光度值，重复3次，按如下公式计 算BF抑制率（％ ) = (0D_-0D样品）/0D_X100%。由图2和图3可知，在不含PT-8多 肽的对照孔中，表皮葡萄球菌ATCC35984形成明显BF，经酶标仪检测0D值为1. 21±0. 28。 然而在含有PT-8多肽的培养基中，细菌形成的BF菌量明显减少，基本呈剂量依赖性，16? 256iig/ml浓度的PT-8对细菌BF平均抑制率分别为5. 44%、2. 98%、23. 74%、44. 11%、 59.69%。当浓度为64yg/ml及以上时，试验组与对照组间有显著性差异（P〈0. 05)，说明 PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF形成具有明显抑制作用。
[0028] (4)激光共聚焦检测PT-8多肽对表皮葡萄球菌ATCC35984的BF形成的影响
[0029]按照参考文献（WangQ，SunFJ，LiuY，etal.Enhancementofbiofilmformation bysubinhibitoryconcentrationsofmacro1idesinicaADBC-positiveand-negative clinicalisolatesofStaphylococcusepidermidis.AntimicrobAgentsChemother, 2010,54(6) :2707-2711)的方法，于盖玻片上自然生长形成BF。将盖玻片置于灭菌6孔培 养板底部，加入2. 5mlTSB培养基配制的PT-8多肽，然后接种2. 5ml菌液，以TSB培养基 2. 5ml和菌液2. 5ml混合液为阴性对照组，并控制体系中PT-8多肽浓度为128yg/ml，细菌 浓度为l〇6CFU/ml。将培养板置于37°C恒温培养箱培养24h后取出玻片，以适量PBS轻柔冲 洗以去除未粘附细菌，吸水纸吸干多余水分后用质量分数为2. 5%的戊二醛固定30min，再 用PBS洗片后用FITC-ConA(50iig/ml)避光染色30min，再次用PBS洗片后，PI(5iig/ml) 避光染色8min，用PBS冲洗后吸干多余水分，40%甘油封片，以激光共聚焦显微镜下放大倍 数40倍观察标记为绿色荧光的多糖和标记为红色荧光的细菌核，结果如图4所示。结果显 示，对照组粘附的细菌较多，形成的BF结构致密，而PT-8组粘附的细菌较少，结构较为疏 松，对成熟期结构紧密的BF有显著的抑制或破坏作用。
[0030] (5)细菌粘附实验
[0031] 采用96孔板结晶紫染色法测定BF抑制率，测定方法参考文献（DusaneDH，Pawar VS,NancharaiahYV,etal.Anti-biofilmpotentialofaglycolipidsurfactant producedbyatropicalmarinestrainofSerratiamarcescens.Biofouling,2011, 27(6) :645-654.)，在聚苯乙烯材质的96孔板各排中，分别加入100iiLTSB培养基配制的 PT-8,然后接种100iiL菌液，以TSB培养基200iiL为空白对照组，以TSB培养基100iiL和 菌液100yL混合液为阴性对照组，并控制体系中PT-8多肽浓度分别为256yg/ml、128yg/ ml、64iig/ml、32iig/ml和16iig/ml，细菌浓度为106CFU/ml。将培养板置于37°C恒温培 养箱培养4h，然后吸取孔内菌液，PBS洗涤3次，风干后加入200iiL1 %结晶紫溶液染色 10min，PBS洗涤3次；加入200yL33%醋酸溶液溶解BF-结晶紫复合物，用酶标仪测定波 长590nm处吸光度值，结果如图5所示。结果显示，在不含PT-8多肽的对照孔中，表皮葡萄 球菌ATCC35984细菌粘附性较好。而含有PT-8多肽的培养基中，细菌粘附较少，当浓度为 32yg/ml及以上时，试验组与对照组间有显著性差异（P〈0. 05)，说明PT-8多肽对表皮葡萄 球菌ATCC35984粘附具有明显抑制作用。
[0032] 研究结果表明PT-8多肽能够明显抑制表皮葡萄球菌ATCC35984的BF形成，BF是 细菌耐药性产生的重要机制，因此能够将PT-8多肽与其他抗菌药联合用于抑制耐药性表 皮葡萄球菌ATCC35984。
[0033] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1. 生物膜抑制肽，其特征在于：所述生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述的生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的药物中的 应用。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表皮葡萄球菌为表皮葡萄球菌 ATCC35984。
4. 权利要求1所述的生物膜抑制肽在制备抑制表皮葡萄球菌表面粘附的药物中的应 用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述表皮葡萄球菌为表皮葡萄球菌 ATCC35984。
【文档编号】A61K38/08GK104387452SQ201410690257
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】陈勇川, 孙凤军, 欧阳净, 熊丽蓉, 冯伟 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院