专利名称：一种生物膜及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，尤其是细胞免疫领域，具体涉及一种激活T淋巴细胞并促进T淋巴细胞增殖的试剂及方法。该试剂及方法可应用于临床细胞免疫治疗，也可用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。
背景技术：
T淋巴细胞是人体最重要的免疫细胞之一，由胸腺内的淋巴干细胞分化而来，成熟后迁移到外周血；按其功能可分为三个亚群辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞的正常功能对于维护机体的健康及其重要，它们的缺陷和功能异常可导致包括自身免疫性疾病和肿瘤等在内的各种疾病。目前，免疫学研究包括各种对T淋巴细胞的 基础和临床应用的研究日益深入且发展迅速，在人T细胞来源和数量受限的现实情况下，对T细胞的需求日益迫切。因此，有必要建立一个有效，方便的体外T细胞活化和增殖方法来获取大量具功能活性的T细胞以满足需求。近年来，随着过继性细胞免疫治疗恶性肿瘤的迅速发展，对体外T细胞活化和增殖的科研和临床需求越来越大。众所周知，尽管包括手术，化疗和放疗等综合手段的应用对恶性肿瘤的治疗取得了一定的进步，但是，上述传统治疗手段对恶性肿瘤的疗效总体来说还很不理想。寻求各种新药物、新技术、新方法来治疗恶性肿瘤不仅势在必然，而且现代医学的进步也为新治疗手段的发展提供了可能。其中一个极具潜能并在近期取得突破性进展的手段就是过继性T细胞免疫治疗法。这种治疗手段是将分离得到的患者自身的各种T细胞，包括周围血效应性(⑶8+或⑶4+) T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)，自然杀伤细胞样T淋巴细胞(CIK)等，在体外通过各种手段如基因改造，肿瘤抗原刺激，细胞因子诱导等激活T细胞，再回输至患者体内以发挥其直接杀灭肿瘤细胞和激发抗肿瘤免疫反应等作用而达到治疗目的。也由于患者T细胞来源和数量受限，因此，建立一个有效的体外培养系统来活化和增殖上述各种T细胞，以满足过继性T细胞免疫治疗需求，是极为必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是常规淋巴细胞扩增方法得到的淋巴细胞细胞增殖倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对该问题提供一种用于淋巴细胞活化及扩增的方法及试剂盒。本发明第一方面提供了一种分离的生物膜，该生物膜可以用于装载生物活性分子。进一步地，该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。本发明第二方面提供了生物膜的制备方法，是通过裂解能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。优选地，本发明所述的生物膜的制备方法，包含以下步骤1)获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞；
2)获得步骤I)所述细胞的细胞裂解液；
3)离心获得权利要求1所述的生物膜，并使其均质化。优选地，所述均质化方法为超声波法。优选地，所述细胞为纤维母细胞。进一步优选地，所述生物膜制备方法包含以下步骤
1)获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞；
2)获得步骤I)所述纤维母细胞的细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟； 3)4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清；
4)4°C条件下，将上清以10，000 G离心5分钟，取上清；
5)4°C条件下，将上清以100，000 G离心60分钟，取沉淀；
6)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4°C条件下以100，000G将沉淀离心45分钟，取
沉淀；
7)4°C条件下，将所得沉淀继续以100，000G离心45分钟，取沉淀；
8)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度的超声波处理I分钟，使其均质化，获得所述的生物膜。35%强度的超声波是指45 Watt，20 KHz的超声波(Q125超声波仪，美国Qsonica)。本发明第三方面提供了一种刺激淋巴细胞增殖的方法，该方法包含以下步骤
1)获得上述任一项所述的生物膜；
2)使生物膜与一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子形成复合物；
3)使生物膜-淋巴细胞增殖刺激因子复合物与淋巴细胞接触。优选情况下，所述的刺激淋巴细胞增殖的方法还包括使淋巴细胞进一步与白细胞介素-2 (IL-2)接触。优选情况下所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。需要说明的是，本发明的生物膜可通过抗生物素蛋白Avidin与生物素偶联的各种生物活性分子结合，将生物活性分子转运到合适的位置，促进其发挥生物学功能。本发明第四方面提供了上述所述的生物膜在刺激淋巴细胞增殖中的应用，优选地淋巴细胞为T淋巴细胞。T淋巴细胞包括⑶3+淋巴细胞，⑶4+淋巴细胞，⑶8+淋巴细胞和Treg调节性T淋巴细胞。本发明还提供了一种刺激淋巴细胞增殖的试剂盒，包含上述的生物膜或通过上述方法制备的生物膜。优选地，该试剂盒还包含一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子，进一步优选地，淋巴细胞增殖刺激因子为生物素偶联的淋巴细胞增殖刺激因子；进一步优选地，试剂盒还包含白细胞介素_2。在另一种优选情况下，所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。有益效果
本发明提供的生物膜可以和悬浮培养的T淋巴细胞相互粘附，充分提高生物活性分子和T淋巴细胞相互作用的效应。此外，在细胞培养条件下，生物膜可以被有效地自然降解，对T淋巴细胞无任何不良副作用，并能最大程度简化T淋巴细胞活化和扩增的培养程序和步骤，避免了类似产品中需要清除用以吸附生物活性分子的磁珠而导致的额外步骤和污染机会。本发明提供的方法具有操作简便、高效地活化和增殖T细胞等特点；本发明提供的试剂盒具有成本低、易于规模化生产等突出优势，可用于淋巴细胞的基础研究及临床应用研究。
下面结合附图对本发明做进一步描述
图1是通过流式细胞仪对T淋巴细胞表型进行检测的结果。图2是使用本发明提供的活化扩增试剂促进T淋巴细胞增殖的结果。
具体实施例方式本发明提供了一种可以装载各种生物活性分子的生物膜材料，该生物膜材料具有细胞亲和力，可以和悬浮培养的T细胞相互粘附，从而能充分提高生物活性分子对T细胞的效应作用；该生物材料随后在自然培养条件下可被降解，对T细胞生长无任何毒副作用。现有的一些刺激淋巴细胞增殖的方法是通过应用磁珠来装载生物活性分子；磁珠是非生物材料，与T细胞缺乏亲和性，而且，在细胞培养中需要额外步骤清除磁珠。因此，与其相比较，本发明对体外T细胞的活化和增殖更加高效，操作更为简便。首先通过全基因合成法获得人源化修饰后的Avidin cDNA序列，并将该序列通过常规PCR方法克隆至真核表达载体中；通过脂质体法转染，将重组表达载体转染至细胞中，并通过抗生素筛选获得稳定表达人源化的Avidin的细胞株。下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、生物膜的制备1、构建稳定表达人源化Avidin (抗生物素蛋白)的纤维母细胞株(Fibroblast —Avidin)
1 )使用分子生物学方法获得人源化修饰后的Avidin cDNA (序列如GenBank:AJ616762.1),并将其构建于pcDNA3.1载体上，重组后的载体命名为pcDNA-Avidin。pcDNA3.1载体购置于Invitrogen,目录号为V790-20。具体过程如下
A)委托苏州金唯智生物科技有限公司合成Avidin基因，该基因5’端具有NheI限制酶切的粘末端，3’端具有Xba I限制酶切的粘末端；
B)用Nhe I 和 Xba I (New England Biolabs, Inc, Cat # R0131S 和 R0145S)酶切pcDNA3.1载体，回收及纯化酶切产物(Qiagen，Cat # 28704)；
C)通过T4DNA连接酶(Promega，Cat# M1801)16° C过夜，将合成的Avidin基因连接于酶切后的载体上；
D)连接产物转化感受态细胞T0P10(Invitrogen, Cat # C4040-03)，并获取阳性菌落
克隆；
E)阳性菌落扩增培养提取质粒(Qiagen,Cat # 27104),并通过测序证实Avidin cDNA正确连接于pcDNA3.1中。2)将pcDNA-Avidin重组载体转染到培养的纤维母细胞中，所述纤维母细胞(Dermal Fibroblasts)购置于 ATCC，Cat# PCS-201-012。
具体步骤如下
A)纤维母细胞置于含10%胎牛血清的1640培养液中进行常规细胞培养；
B)用Lipofectamine 2000 试剂(Invitrogen, Cat # 11668030)按试剂盒提供的实验体系及步骤将重组pcDNA-Avidin载体转染入纤维母细胞中。3 )通过新霉素(Sigma, Cat # N6386,400ug/ml)筛选14天,获得耐药的细胞克隆。4)挑取细胞克隆，扩大培养后获得细胞裂解液，通过Western Bloting (所用ant1-Avidin抗体购自ABcam, Cat # ab7235)验证Avidin的表达；选取未定表达Avidin的纤维母细胞建立细胞株(稳定表达Avidin的纤维母细胞株命名为Fibroblast-Avidin)。2、配制生物膜裂解/缓冲液(50 ml)
蔗糖(终浓度250 mM)4. 28 g
I M HEPES (PH 7. 4，终浓度 20 mM)I ml
KCl (终浓度 10 mM)0. 0373 g
IM MgCl2 (终浓度1. 5 mM)75 U I
0. 5 M EDTA ((终浓度 I mM)100 U I
0. 5 M EGTA ((终浓度 I mM)100 U I
加双蒸水至50 ml
使用前取IOml生物膜裂解/缓冲液加入10 U I DTT (终浓度I mM)和50 yl蛋白酶抑制剂混合液(以上均为Sigma产品)。3、操作程序(所有离心操作均在4° C条件进行)
I)收集生长密度达80%的稳定表达Avidin的纤维母细胞(Fibroblast-Avidin)5 X IO7,加入生物膜裂解/缓冲液2 ml。2)用带25G针头的注射器将裂解细胞反复吹打10次，随后置冰上20分钟。3) 720 G离心5分钟，取上清。4)将上清以10，000 G离心5分钟，取上清。5)将上清再次以100，000 G离心I小时，取沉淀。6)加入2 ml生物膜裂解/缓冲液，以100，000 G离心45分钟，取沉淀。7)再次以100，000 G离心45分钟，取沉淀。8)加入2 ml PBS,用35%强度(35%强度的超声波是指45 Watt，20 KHz的超声波(Q125超声波仪，美国Qsonica))的超声波处理I分钟，使其均质化后即为所需要的生物膜。实施例2、生物膜与生物活性分子结合 生物分子
人重组 4-1BBL，Abnova, Cat# P4065
人重组 CD86，Sino Biological Inc, Cat# 10699-H08H
人抗 CD3 抗体
- Azide free, Abeam, Cat#ab86883
试剂
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin, sigma. Cat# 21217
操作程序
I)按试剂说明书程序，分别标记Biotin于人重组4-1BBL，人重组⑶86，人抗⑶3抗体。
2)将PBS洗漆标记后的各生物分子。3)在上述制备的2ml生物膜中分别加入IOug标记后的4-1BBL，⑶86，⑶3抗体。4° C孵育30分钟。实施例3、T淋巴细胞提取
I)在50 ml离心管中，配制2 X EDTA溶液(用DPBS稀释)，每管25ml。2)获得的25 ml血液，将其加入到上述EDTA溶液中，混匀。3)另取一只50 ml离心管，每管中均加入25 ml Ficoll溶液。4)将稀释后的血液用移液管沿管壁缓慢叠加于Ficoll溶液上，保持两液面界面清晰。 5)将离心管盖拧紧，封严，避免污染。6)离心离心机型号和转头型号为Thermo，IEC CL40R ；CAT#11210926,400g离心30分钟，升速5档，降速0档。7)离心后，管内液体分为三层，上层为稀释的血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为Ficoll，在中上层液面处有一白色云雾层狭窄带，即为富含淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞(PBMCs )。8)用酒精消毒离心管表面，用移液管轻缓地吸去大部分的上层血浆，收集血浆层和Ficoll交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMCs(勿过量吸取血浆层和下层的白细胞)，移入一新的离心管中。9)加入20 ml DPBS或无血清培养液，混匀后以200g离心10分钟，弃去上清液。10)用DPBS洗涤细胞两次，每次以500g离心10分钟，以洗去残留的Ficoll溶液。11)对获得的细胞进行计数，用细胞培养液将细胞浓度调配成2X IO5细胞/ml。DPBS 配方(IL 体系)
KCl0.201 g
KH2PO40. 204 g
NaCl8 g
Na2HPO4 12H204. 257 g
用IL超纯水溶解。实施例4、T淋巴细胞活化和增殖
用实施例2获得的结合有生物活性分子(⑶3抗体，⑶86分子，4-1BBL)的生物膜处理实施例3获得的T淋巴细胞，具体步骤如下
I)计数T淋巴细胞后，将IXlO5 T淋巴细胞接种于100 ul 1640培养液中。2)向培养液中加入20 ul实施例2获得的结合有生物活性分子的生物膜和3. 6 uIL-2 (终浓度为 30u/ml，IL2 购自(Cell Sciences, CAT#CRI100C)，在 37° C，5% CO2 培养箱内进行常规培养。3)每48小时，半量更换培养液，并按表I中的比例补充IL-2。4)以7天为一个周期，每周期计数T淋巴细胞的数量。5)以7天为一个周期，按表I中的比例再次加入实施例2获得的结合有生物活性分子(⑶3抗体，⑶86分子，4-1BBL)的生物膜，用以再次刺激T淋巴细胞。
权利要求
1.一种分离的生物膜，其特征在于该生物膜可以用于装载生物活性分子。
2.权利要求1所述的生物膜，其特征在于该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。
3.权利要求1-2任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于通过裂解能够稳定表达重组抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。
4.权利要求3所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤1)获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞；2)获得步骤I)所述细胞的细胞裂解液；3)离心获得权利要求1-2任一项所述的生物膜，并使其均质化。
5.权利要求4所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述均质化方法为超声波法。
6.权利要求2-5任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述细胞为纤维母细胞。
7.权利要求2所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤O获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞；2)向步骤I)所述纤维母细胞加入细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟； 3)4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清； 4)4°C条件下，将上清以10，000 G离心5分钟，取上清； 5)4°C条件下，将上清以100，000 G离心60分钟，取沉淀；6)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4° C条件下以100，000G将沉淀离心45分钟，取沉淀； 7)4°C条件下，将所得沉淀继续以100，000G离心45分钟，取沉淀； 8)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度即45Watt，20 KHz的超声波处理I分钟，使其均质化，获得权利要求1所述的生物膜。
8.一种刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于该方法包含以下步骤O获得权利要求1-2任一项所述的生物膜；2)使生物膜与一种或多种淋巴细胞刺激因子形成复合物；3)使生物膜-淋巴细胞刺激因子复合物与淋巴细胞接触。
9.权利要求8所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于使淋巴细胞进一步与白细胞介素-2 (IL-2)接触。
10.权利要求8或9任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
11.权利要求10所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于所述淋巴细胞刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。
12.权利要求1-2任一项所述的生物膜在刺激淋巴细胞活化和增殖中的应用。
13.权利要求12所述的应用，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
14.一种刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于包含权利要求1-2任一项所述的生物膜。
15.权利要求14所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于还包含一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子。
16.权利要求15所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞增殖刺激因子为生物素偶联的淋巴细胞增殖刺激因子。
17.权利要求14-16任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于还包含白细胞介素_2。
18.权利要求14-17任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
19.权利要求18所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞增殖刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供了一种分离的生物膜及其制备方法和应用；进一步的，本发明提供了一种利用该生物膜刺激T淋巴细胞增殖的方法及其应用；更进一步的，本发明提供了一种包含该生物膜的试剂盒。
文档编号C12N5/07GK103013906SQ201210340310
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者黄纲雄, 杨林 申请人:博生吉医药科技(苏州)有限公司, 黄纲雄