中放置一定时间后，消化收集细胞，计数仪计 数，得出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24小时后，将细胞材料复合物于培养液中晃 动，并换入另一培养皿培养，收集培养皿培养液并消化收集贴壁的细胞，将原培养液中细胞 一并计数，得出未粘附的细胞数： 细胞粘附率=(接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞数)/(接种的细胞数-流 失的细胞数)。
[0021] 进一步的，所述的步骤（4)的具体操作方法是：将BMSCs按（1~10) X 106/cm2细 胞接种在蚕丝蛋白生物膜上，置5%C02、37°C培养箱培养4h后加入含10%胎牛血清的a-MEM 培养基，以后每2d换液，共培养5d，形成人工角膜贴片，备用。
[0022] 进一步的，所述的步骤（5)的具体操作方法是：将体外构建的骨髓间充质干细胞 与蚕丝蛋白生物膜共培养形成的复合物贴片移植到受损角膜上。患者全身麻醉后，用丁卡 因眼液对眼表进行麻醉后，用圆刀片刮除全部角膜上皮，并用生理盐水彻底冲洗。取略大于 角膜直径的移植片(面积为1. 5X1. 5 cm2)，上皮面朝上覆盖于眼表，用10-0尼龙线连续缝 合贴片边缘及球结膜，观察移植贴片平覆，其下无积血等情况后局部给予红霉素眼膏，术毕 予0.3%妥布霉素/ 0.1%地塞米松滴眼液局部使用3周。结果显示，上述人工角膜贴片植 入后随着时间推移可完全降解，角膜也逐步恢复透明，能更好地修复角膜缺损，满足机体对 视力的要求。
[0023] 本发明人工细胞膜角膜的优势在于： 1.传统的人工角膜基质是使用角膜基质细胞作为种子细胞，由于这种细胞若来源于 自体角膜基质细胞对个体健侧角膜损伤较大，且细胞培养耗时太久；若来源于异体角膜基 质细胞则存在排异反应发生的可能性。本发明方法中生物角膜贴片采用BMSCs作为种子细 胞。BMSCs获取方便，解决了供体来源问题，体外增殖能力强，有多向分化潜能，不存在免疫 排斥反应，同时，BMSCs有旁分泌功能，参与免疫调节，还有减轻炎症的作用，从而促进角膜 的损伤修复。
[0024] 2.本发明方法中采用的BMSCs来源于同种异体，可以预先完成生物膜角膜贴片 的制备，对角膜损伤者及时治疗。避免因采用自体细胞治疗时，自体细胞获取及培养过程耗 时久，延误治疗时间，而导致患者失明的情况。
[0025] 3.本发明方法中采用蚕丝蛋白构建的生物膜具有水溶性，在制备过程中可避免 有毒溶剂的使用，生物安全性好；本身是天然蛋白质多肽，具有优良的生物相容性和组织相 容性，不引起排斥反应和炎性反应；支持细胞生长，促进融合，在机体内可逐渐降解吸收，降 解和吸收的速度与组织细胞的生长繁殖速度相匹配；最终降解产物是氨基酸或寡肽，对机 体没有毒害作用；具有良好的坚韧性和与人体角膜相似的各种物理和化学性能，为细胞在 载体中生长和物质代谢提供足够的空间。它既可以单独应用于角膜组织结构的重建，又可 与其他组织材料联合应用，在人工角膜材料的应用中有良好的前景。
[0026] 4.本发明方法构建的生物膜角膜贴片，使用时仅需将贴片缝合于受损角膜上，手 术简单，易于掌握，术后常规抗炎处理，护理方便，治疗效果非常有效。
[0027] 5.本发明方法制备的生物膜贴片既能减少对供体角膜的需求量，又降低供体移 植带来的感染及免疫排斥的风险，更可提供数量充足的高活性细胞，具有极佳的应用前景。
【附图说明】
[0028] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1 :本发明生物膜角膜贴片制备流程图； 图2 :P2代BMSCs倒置相差显微镜照相（X 400); 图3 :A为负载BMSCs的空白玻璃细胞爬片组；B为负载BMSCs的蚕丝蛋白生物膜实验 组； 图4:移植手术后角膜愈合的统计学分析：透明度、新生血管、存活率。A生存分析，B透 明度分析，C新生血管分析； 图5 :生物膜角膜贴片移植后的角膜愈合：PKH26细胞示踪。
【具体实施方式】
[0029]下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0030] 参照图1本发明生物膜角膜贴片制备流程图所示，本发明【具体实施方式】如下： 实施例1人工角膜的体外制备及检测 1.原料：培养基a-MEM，组分为维持细胞生长的必需氨基酸、蛋白质和多糖等；胎 牛血清（FBS)，细胞生长必需的营养成分，其产品严格按照胎牛血清质量标准执行； Tripsin-EDTA，消化细胞用。
[0031] 2.蚕丝蛋白生物膜材料的制备： 称取适量桑蚕丝置于0. 5%的无水碳酸钠溶液中，浴比1 :50,于90°C~100°C处理30 min，重复3次(最后一次用去离子水)。脱胶后洗净，60°C烘箱干燥后得到精炼蚕丝。将脱 胶完的生丝溶解在9.5 mol/L的溴化锂溶液中，然后将溶液在去离子水中透析3d。透析 完的丝蛋白溶液离心去除极少量絮状沉淀物后，用重量法标定丝蛋白溶液的浓度，然后加 入适量的去离子水将溶液稀释至丝蛋白的质量分数为2%。将lml再生蚕丝蛋白溶液移入 3cmX 3cm的塑料盒中在室温（25 °C，50%相对湿度）下放置过夜，使其自然干燥成膜(约需 24h)。所得的再生蚕丝蛋白膜膜厚约为5 ym，蒸馏水浸泡48小时，每隔8h时更换蒸馏水； 取出材料薄膜，干燥后分别用PBS及培养基各浸泡ld，备用。
[0032] 3.人骨髓间充质干细胞的原代培养及传代：取人骨髓5~10 ml，肝素抗凝，用等 量的PBS稀释，按2 : 1比例加在Ficoll淋巴细胞分离液上，400 g离心30min，取中间白 膜层，用PBS洗涤3遍，用含10%FBS的a-MEM培养基调整细胞浓度为1 X 106个/ml接种于 9cm培养皿中。运用差速贴壁法37°C，5%C02条件下培养48小时后半量换液，4d全量换液 弃去未贴壁的细胞。倒置相差显微镜下观察细胞的生长，待细胞长到85%融合时，用0. 25% trypsin-EDTA进行消化，按1 : 2的比例进行传代，之后约48小时换液一次，3~4日传代 一次。取传代4~6代后的细胞用于流式细胞检测及细胞的增殖和形态学实验，各组细胞 以2 X 105/孔，接种于铺有各组材料的24孔板中，37°C，5%C02条件下培养，每48~72小时 换液。
[0033] BMSCs的鉴定：将体外培养4~6代的BMSCs用PBS多次洗漆后；加入荧光标记的 抗体；4°C、孵育30min ;PBS洗去未结合的抗体，1%多聚甲醛固定；应用FACScan流式细胞仪 检测细胞表面抗原表达。
[0034] 4. BMSCs 的接种 BMSCs传代扩增到第三代后接种于支架材料上制得细胞材料复合物；于培养箱中放置 一定时间后，消化收集细胞，计数仪计数，得出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24小时 后，将细胞材料复合物于培养液中晃动，并换入另一培养皿培养，收集培养皿培养液并消化 收集贴壁的细胞，将原培养液中细胞一并计数，得出未粘附的细胞数： 细胞粘附率=(接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞数)/(接种的细胞数-流 失的细胞数)。
[0035] 5. BMSCs接种于蚕丝蛋白生物膜支架，将步骤2制得的细胞按7 X106/cm2接种于 蚕丝蛋白生物膜材料支架上，置5%C0 2、37°C培养箱贴壁4h后加入含10%胎牛血清的a-MEM 培养基，以后每2d换液，共培养5d，形成生物膜角膜贴片。每日倒置相差显微镜观察细胞生 长情况。
[0036] 生物膜角膜贴片的观察与鉴定：取覆载BMSCs培养5天的生物膜角膜贴片，做石蜡 切片，染色观察。
[0037] 6?结果显示： (1) BMSCs的培养鉴定： 原代BMSCs 24h后贴壁，完全伸展，呈梭形、多角形，形态不规则，小部分呈圆形的造血 细胞经PBS冲洗后弃除。培养7d细胞基本融合后传代，经2次传代，P2代细胞形态为成纤 维细胞样，胞体呈长梭形，核为椭圆形，形态一致，倒置显微镜下观察呈漩涡状、辐射状排列 (图2)，细胞生长迅速，4~5d传代。
[0038] 取体外分离培养4~6代的细胞，流式细胞仪检测其表面抗原。结果发现，细胞表 面⑶14、⑶34、⑶45表达阴性，⑶29、⑶44、⑶90表达阳性。正常间充质干细胞（MSC)不表 达⑶14、⑶34、⑶45,而强表达⑶29,表达⑶44、⑶90。以上结果表明本实验所分