学单标记染色，CK12表达阳性 说明细胞为成熟角膜上皮细胞，CK13表达阳性，说明细胞为结膜上皮细胞。
[0054] 对照组：术后2w、4w、10w :CK13抗原表达均呈阳性，且CK12与CK13表达位置不发 生重叠，说明对照组角膜上皮为结膜细胞覆盖，无角膜上皮细胞生长。
[0055] 单纯蚕丝蛋白膜移植组：术后2w:多数组织CK13表达阳性；术后4w:几乎全部组 织CK13呈阳性；术后10w :CK13染色阳性，说明上皮为结膜上皮覆盖。
[0056] 生物膜角膜贴片移植组：术后2w :CK12染色阳性，上皮为单层细胞；术后4w :CK12 阳性，细胞已生长为复层结构；术后l〇w:CK12染色阳性，上皮细胞结构基本正常，不表达 CK13,说明角膜上皮覆盖角膜表面，移植后，细胞仍在继续分化、增殖。
[0057] 5)角膜组织HE染色 对照组：术后2w，局部上皮有细胞覆盖，排列紊乱，变性，炎细胞浸润，新生血管形成； 术后4w，有上皮覆盖(经免疫组织化学染色鉴定为结膜上皮)，基质结构紊乱，新生血管多； 术后1〇?，上皮结构紊乱，基质排列紊乱，有瘢痕形成，新生血管可见。
[0058] 单纯蚕丝蛋白膜移植组：术后2w，部分上皮缺损，部分上皮细胞增生，炎细胞浸 润，可见新生血管，纤维母细胞增生，基质增厚；术后4w，部分上皮覆盖，结构紊乱，不全角 化，基质增厚，炎细胞浸润，新生血管；术后1〇?，上皮细胞层数减少，排列不整齐，基质厚度 基本正常，可见新生血管。
[0059] 生物膜角膜贴片移植组：术后2w，上皮略增生，基质较多炎细胞浸润，可见新生血 管；术后4w，大部分上皮覆盖，细胞层数接近正常，基质充血较2w时明显减少；术后10w，上 皮完整，基质厚度正常，排列有序，残留少许淋巴细胞，少量新生血管。
[0060] 结论：手术移植后，经大体观察、HE、免疫组织化学检查及角膜评分统计学分析， BMSC-蚕丝蛋白生物膜角膜贴片移植组疗效明显好于单纯蚕丝蛋白膜移植组和对照组，其 中BMSCs在角膜受损部位分化为上皮细胞，修复受损角膜，达到治疗的效果。
[0061] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种生物膜角膜贴片，其特征在于，是由接种于支架材料上的种子细胞和形成三维 空间的生物膜支架构建组成，其中所述的种子细胞是骨髓间充质干细胞（BMSCs)，所述的生 物膜支架是蚕丝蛋白生物膜。2. 根据权利要求1所述的一种生物膜角膜贴片，其特征在于，所述的骨髓间充质干细 胞的来源于同种异体；接种密度为（1~1〇)\10 6/(^2，优选7\106/(^2。3. 根据权利要求1所述的一种生物膜角膜贴片，其特征在于，所述的蚕丝蛋白生物膜 的质量含量为1%~10%，优选2% ;膜干燥温度条件为10°C~60°C，优选25°C ;膜干燥的湿 度条件为25%~60%，优选50%。4. 权利要求1所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，由下述步骤组成： (1)蚕丝蛋白生物膜支架的制备；（2)骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定；（3)骨髓间充 质干细胞的接种；（4)生物膜角膜贴片的制备；（5)生物膜角膜贴片的移植。5. 根据权利要求4所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (1) 蚕丝蛋白生物膜支架的制备的具体操作步骤是：称取适量桑蚕丝置于0. 5%的无水碳酸 钠溶液中，浴比1 :50,于90°C~100°C处理30min，重复3次(最后一次用去离子水);脱胶后 洗净，60°C烘箱干燥后得到精炼蚕丝；将脱胶完的生丝溶解在9. 5mol/L的溴化锂溶液中， 然后将溶液在去离子水中透析3d ;透析完的丝蛋白溶液离心去除极少量絮状沉淀物后，用 重量法标定丝蛋白溶液的浓度，然后加入适量的去离子水将溶液稀释至丝蛋白的质量分数 为1%~10%;将Iml再生蚕丝蛋白溶液移入3cmX3cm的塑料盒中，在10°C~60°C温度， 25%~60%相对湿度下，放置过夜，使其自然干燥成膜(约需24h);所得的再生蚕丝蛋白膜膜 厚约为5 y m，蒸馏水浸泡48小时，每隔8h时更换蒸馏水；取出材料薄膜，干燥后分别用PBS 及培养基各浸泡ld，备用。6. 根据权利要求4所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (2) 骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定的具体操作步骤是： 第一步，取人骨髓5~10ml，肝素抗凝，用等量的PBS稀释，按2 : 1比例加在Ficoll淋 巴细胞分离液上，400g离心30 min，取中间白膜层，用PBS洗涤3遍，用含10%FBS的a-MEM 培养基调整细胞浓度为I X IO6个/ml接种于9cm培养皿中；运用差速贴壁法37°C，5%C0 2条 件下培养48小时后半量换液，4d全量换液弃去未贴壁的细胞； 第二步，倒置相差显微镜下观察细胞的生长，待细胞长到85%融合时，用0. 25% trypsin-EDTA进行消化，按1 : 2的比例进行传代，之后约48小时换液一次，3~4日传代 一次； 第三步，取传代4~6代后的细胞用于流式细胞检测及细胞的增殖和形态学实验，各组 细胞以2 X IO5/孔，接种于铺有各组材料的24孔板中，37°C，5%C02条件下培养，每48~72 小时换液； 第四步，BMSCs的鉴定：将体外培养4~6代的BMSCs用PBS多次洗漆后；加入荧光标 记的抗体；4°C、孵育30min ;PBS洗去未结合的抗体，1%多聚甲醛固定；应用FACScan流式细 胞仪检测细胞表面抗原表达。7. 根据权利要求4所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (3) 骨髓间充质干细胞的接种的具体操作步骤是：BMSCs传代扩增到第三代后接种于支架 材料上制得细胞材料复合物；于培养箱中放置一定时间后，消化收集细胞，计数仪计数，得 出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24小时后，将细胞材料复合物于培养液中晃动，并 换入另一培养皿培养，收集培养皿培养液并消化收集贴壁的细胞，将原培养液中细胞一并 计数，得出未粘附的细胞数。8. 根据权利要求4所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (4) 生物膜角膜贴片的制备的具体操作步骤是：将BMSCs按（1~10) X IOfVcm2细胞接种在 蚕丝蛋白生物膜上，置5%C02、37°C培养箱培养4h后加入含10%胎牛血清的a-MEM培养基， 以后每2d换液，共培养5d，形成人工角膜贴片，备用。9. 根据权利要求4所述的一种生物膜角膜贴片的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (5) 生物膜角膜贴片的移植的具体操作步骤是：将体外构建的骨髓间充质干细胞与蚕丝蛋 白生物膜共培养形成的复合物贴片移植到受损角膜上；患者全身麻醉后，用丁卡因眼液对 眼表进行麻醉后，用圆刀片刮除全部角膜上皮，并用生理盐水彻底冲洗；取略大于角膜直径 的移植片(面积为1. 5X1. 5 cm2)，上皮面朝上覆盖于眼表，用10-0尼龙线连续缝合贴片边 缘及球结膜，观察移植贴片平覆，其下无积血等情况后局部给予红霉素眼膏，术毕予〇. 3% 妥布霉素/ 〇. 1%地塞米松滴眼液局部使用3周。10. 权利要求1-3所述的一种生物膜角膜贴片和由权利要求4-9制备的一种生物膜角 膜贴片在角膜损伤疾病中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种生物膜角膜贴片及其制备方法与应用，具体是将同种异体来源的骨髓间充质干细胞种植于蚕丝蛋白生物膜上制成角膜贴片用于治疗角膜溃疡等角膜损伤。自人骨髓分离到单核细胞接种于a-MEM培养基中，扩增到第三代后按一定浓度接种于蚕丝蛋白生物膜上，共培养5d后进行移植手术。经动物实验证明，本角膜贴片具有良好生物相容性，避免了传统人工角膜基质对机体的毒性反应及诱发的排斥反应，植入后随着时间推移完全降解，角膜可恢复透明，能满足机体对视力的要求。
【IPC分类】A61L27/22, A61L27/50, A61L27/38
【公开号】CN104941001
【申请号】CN201510402587
【发明人】周萱, 王云娟
【申请人】奥思达干细胞有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月10日