一种检测亚硫酸盐的生物发光探针及其制备方法和用途与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测亚硫酸盐的生物发光探针及其制备方法和用途。

背景技术：

亚硫酸盐是一类很早即在世界范围内广泛使用的食品添加剂，可作为食品漂白剂，防腐剂；可抑制非酶褐变和酶促褐变，防止食品褐变，使水果不至黑变，还能防止鲜虾生成黑斑；在酸性介质中，还是十分有效的抗菌剂。由于亚硫酸盐对于食品储存等有重要的作用，在食品领域中广泛应用。因此，亚硫酸盐很容易随着食品进入人体。虽然人体中有一种亚硫酸氧化酶，可以催化亚硫酸盐与氧结合生成无毒害的so4^2-；但是，如果亚硫酸盐在人体中的含量过多，无法及时转化成无毒害的so4^2-，就会对人体造成危害。

研究表明，当人体亚硫酸盐过量时，可造成胃肠障碍，引起剧烈腹泻；严重的会慢性中毒，引起头疼，肾脏障碍，红血球和血红蛋白减少等症状。最近研究还表明亚硫酸盐可对染色体及dna造成损伤。由于亚硫酸盐对人体危害较大，而日常摄入又比较容易，因此，如果能够对体内亚硫酸盐进行检测，对于临床研究和治疗具有重要意义。

生物发光探针因其高灵敏性、高分辨率而成为检测亚硫酸盐强有力的工具。目前，用于检测亚硫酸盐的探针正在不断发展，但是都存在不少问题，如：检测限达不到要求，检测灵敏度低，反应时间长，抗干扰能力差，不能用于活体动态可视化检测等。

因此，开发一种对亚硫酸盐选择性高、检测灵敏度高、检测速度快，抗干扰能力强，可用于活体动态可视化检测的生物发光探针具有重要的临床意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测亚硫酸盐的生物发光探针及其制备方法和用途。

本发明提供了一种如式i所示的化合物，或其盐，或其立体异构体：

其中，

n为1～5的整数；

r1、r2、r3、r4、r5、r6分别独立选自氢、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基。

进一步地，所述化合物如式ii所示：

其中，n为1～5的整数；r1选自氢、羧基、c1～c3烷基。

进一步地，所述化合物如式iii所示：

其中，n为1～5的整数。

进一步地，所述化合物的结构式如式iv所示：

本发明还提供了一种前述的化合物的制备方法，它包括如下步骤：

n为1～5的整数，

步骤1：将原料i与原料ii于有机溶剂中混合溶解，加入缩合剂、碱和催化剂反应，得中间体iii；

步骤2：将中间体iii溶解于甲醇和二氯甲烷混合溶液中，再加入含d-半胱氨酸的甲醇水溶液，惰性气体保护下反应，即得。

进一步地，

步骤1中，所述原料i、原料ii、缩合剂、碱和催化剂的摩尔比为(1～4)：(0.5～1)：(2～4)：(2～4)：(0.1～0.5)；所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为(2～4)：(20～40)(mmol：ml)；

和/或，步骤2中，所述中间体iii与d-半胱氨酸的摩尔比为(0.5～1)：(1～2)；所述中间体iii与甲醇和二氯甲烷混合溶液的摩尔体积比为(0.5～1)：(10～20)(mmol：ml)；所述中间体iii与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为(0.5～1)：(3～6)(mmol：ml)；

优选地，

步骤1中，所述原料i、原料ii、缩合剂、碱和催化剂的摩尔比为1.2：1：2：2：0.1；所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为1.2：20(mmol/ml)；

和/或，所述步骤2中，中间体iii与d-半胱氨酸的摩尔比为1：1；所述中间体iii与甲醇和二氯甲烷混合溶液的摩尔体积比为0.5：5(mmol/ml)；所述中间体iii与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为0.5：2(mmol/ml)。

进一步地，

步骤1中，所述有机溶剂为二氯甲烷；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述碱为有机碱；所述催化剂为4-二甲氨基吡啶；

和/或，步骤2中，所述甲醇和二氯甲烷混合溶液中甲醇和二氯甲烷的体积比为1：(1～3)；所述含d-半胱氨酸的甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为(1～2)：1；

优选地，

步骤1中，所述有机碱为三乙胺；

和/或，步骤2中，所述甲醇和二氯甲烷混合溶液中甲醇和二氯甲烷的体积比为1：1.5；所述含d-半胱氨酸的甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1：1。

进一步地，

步骤1中，所述反应为在0～15℃条件下反应1～5h；

和/或，步骤2中，所述加入含d-半胱氨酸的甲醇水溶液为在-10～10℃条件下滴加含d-半胱氨酸的甲醇水溶液；

和/或，步骤2中，所述反应为在0～25℃条件下反应0.5～4h；

和/或，步骤2中，所述反应后所得产物用盐酸调剂ph至2～6，析出固体后过滤、干燥；

优选地，

步骤1中，所述反应为在0℃条件下反应2h；

和/或，步骤2中，所述加入含d-半胱氨酸的甲醇水溶液为在0℃条件下滴加含d-半胱氨酸的甲醇水溶液；

和/或，步骤2中，所述反应为在25℃条件下反应0.5h；

和/或，步骤2中，所述反应后所得产物用盐酸调剂ph至5，析出固体后过滤、干燥。

本发明还提供了前述的化合物，或其盐，或其立体异构体在制备生物发光探针中的用途；优选地，所述生物发光探针为检测亚硫酸盐的生物发光探针。

进一步地，所述生物发光探针为在溶液环境和/或活体水平检测亚硫酸盐的生物发光探针。

本发明生物发光探针对亚硫酸盐中的亚硫酸根离子具有高选择性和高响应性，能够单一准确的选择亚硫酸盐，检测时灵敏度很高，可检测出浓度很低的亚硫酸盐，用于亚硫酸盐的精密检测。同时，本发明生物发光探针还能在活体水平对外源性亚硫酸盐和亚硫酸盐氧化酶缺乏症引起的亚硫酸盐蓄积进行动态可视化分析，有利于临床上对亚硫酸盐的检测，具有广阔的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1制备的本发明化合物(探针)的¹hnmr图谱。

图2为实施例1制备的本发明化合物(探针)的¹³cnmr图谱。

图3为实施例1制备的本发明化合物(探针)的esi-hrms图谱。

图4为实施例1制备的本发明化合物(探针)的hplc图谱。

图5为本发明生物发光探针对不同阴离子的选择情况。

图6为本发明生物发光探针对亚硫酸根离子浓度不同的亚硫酸盐溶液的响应情况。

图7为小鼠注射外源性亚硫酸盐后生物发光信号随时间的变化。

图8为小鼠体内生物发光信号强度随外源性亚硫酸盐浓度的变化。

图9为本发明生物发光探针在亚硫酸盐氧化酶缺乏症中的成像情况。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、本发明化合物(生物发光探针)的制备

本发明化合物的合成路线如下：

步骤1：将1.2mmol原料i与1mmol原料ii于20ml有机溶剂二氯甲烷中混合溶解，加入2mmol缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)、2mmol有机碱三乙胺(tea)、0.1mmol催化剂4-二甲氨基吡啶(dmap)，于0℃条件下反应2h生成中间体iii157mg，收率为87.3％。

中间体iii：mp:94.0-95.4℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.30(d,j＝8.8hz,1h),8.15(d,j＝2.4hz,1h),7.48(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),2.89(t,j＝6.6hz,2h),2.80(ddd,j＝6.8,5.6,1.2hz,2h),2.17(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ206.75,171.22,150.27,149.34,137.48,136.26,125.22,123.12,115.82,113.24,37.48,29.45,27.83.

步骤2：将1mmol中间体iii溶解于10ml甲醇和二氯甲烷混合溶液中(甲醇和二氯甲烷的体积比为1:1.5)，然后在0℃条件下缓慢滴加4ml含1mmold-半胱氨酸的甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)，然后在惰性气体保护，25℃下反应0.5h，得含探针粗产物的反应液，将反应液用盐酸调节ph至5，析出固体后过滤、干燥，即得本发明化合物(生物发光探针)96mg，收率为79.7％

本发明化合物(生物发光探针)：mp:140.6-142.3℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23(s,1h),8.20(d,j＝8.8hz,1h),8.00(d,j＝2.4hz,1h),7.36(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),5.47(dd,j＝9.8,8.4hz,1h),3.89-3.67(m,2h),2.89(t,j＝6.4hz,2h),2.83-2.72(m,2h),2.17(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ206.80,171.34,171.00,164.36,161.04,150.36,149.30,135.99,124.65,121.93,115.69,78.13,37.52,34.81,29.48,27.85.esi-mscalcd.forc16h14n2o5s2(m+h)379.0344,found379.0420.本发明化合物的各种图谱见图1～4。

以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、本发明生物发光探针对亚硫酸根离子的选择性

1、试验方法

(1)溶液的配制

体外实验所用溶剂：50mm的tris-hcl缓冲溶液(ph7.4，含10mmmgcl2)。

本发明生物发光探针溶液的配制：首先用dmso将实施例1制备的化合物溶解，得到浓度为10mm的探针储备液；然后利用溶剂tris-hcl缓冲溶液将探针储备液稀释成浓度为10μm的探针溶液。

酶工作液的配制：60μg的商品化荧光素酶(luciferase)冰上溶于3ml溶剂tris-hcl缓冲溶液，加入2mm的atp，即得(现配现用)。

(2)本发明生物发光探针对亚硫酸根离子的选择性试验：准备含阴离子f^-、cl^-、br^-、i^-、no3^-、no2^-、hco3^-、co3^2-、h2po4^-、hso4^-、so4^2-、scn^-、s2o3^2-和so3^2-的阴离子溶液，各阴离子溶液是将对应的钠盐固体分别单独溶解于溶剂tris-hcl缓冲溶液所得，阴离子溶液中各阴离子浓度均为100μm，是探针浓度的10倍。将50μl阴离子溶液分别与等体积浓度为10μm的探针溶液于96孔板37℃孵育60min，随后每个实验孔加入50μl酶工作液，加入酶工作液后1min之内立即用小动物活体成像系统拍摄记录各孔的生物发光信号，测量孔板内的生物发光现象以及光子数变化情况。

2、试验结果

本发明生物发光探针对不同阴离子的选择情况如图5所示。由图5可知：本发明生物发光探针对亚硫酸根离子(so3^2-)的选择性很高，是其他阴离子的50倍。说明本发明生物发光探针对亚硫酸根离子(so3^2-)具有单一性选择，可用于检测亚硫酸盐。

试验例2、本发明生物发光探针对亚硫酸根离子的响应性

1、试验方法

(1)溶液的配制

体外实验所用溶剂：50mm的tris-hcl缓冲溶液(ph7.4，含10mmmgcl2)。

亚硫酸盐溶液的配制：利用体外实验所用溶剂配制亚硫酸盐na2so3，得到亚硫酸根离子浓度不同的na2so3溶液，亚硫酸根离子浓度为0μm、1μm、2μm、5μm、25μm、50μm、100μm、250μm、500μm、800μm和1000μm。

本发明生物发光探针溶液的配制：按照试验例1所述的方法配制浓度为10μm的探针溶液，首先用dmso将实施例1制备的化合物溶解，得到浓度为10mm的探针储备液；然后利用溶剂tris-hcl缓冲溶液将探针储备液稀释成浓度为10μm的探针溶液。

酶工作液的配制：与实施例1相同。

(2)本发明生物发光探针对亚硫酸根离子的响应性试验：将50μl探针溶液和50μl不同浓度的亚硫酸盐溶液混合，于96孔板37℃孵育60min，随后每个实验孔加入50μl酶工作液，加入酶工作液后1min之内立即用小动物活体成像系统拍摄记录各孔的生物发光信号，测量孔板内的生物发光现象以及光子数变化情况。

2、试验结果

本发明生物发光探针对亚硫酸根离子浓度不同的亚硫酸盐溶液的响应情况如图6所示。由图6可知：本发明生物发光探针对亚硫酸根离子的响应性很好(r²＝0.995，0～400μm，说明在亚硫酸根离子浓度为0～400μm范围内，底物亚硫酸根离子与探针相互作用之后，所检测到的生物发光信号与亚硫酸根离子浓度呈现出良好的线性关系，r²越接近于1说明两者的相关性越强)，对亚硫酸根离子的检测限可达0.002μm。说明该生物发光探针检测亚硫酸根离子时灵敏度很高，可检测出浓度很低的亚硫酸根离子，可用于亚硫酸盐的精密检测。

试验例3、小鼠注射外源性亚硫酸盐后生物发光信号随时间的变化

1、试验方法

(1)试验动物：transgenicfvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。

(2)试验分组：

实验组(so3^2-)：先腹腔注射0.2ml亚硫酸盐溶液(生理盐水配制的na2so3溶液，浓度为100μm)，再腹腔注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)，体内孵育10min；

空白对照组(ns)：先腹腔注射0.2ml生理盐水，再腹腔注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)，体内孵育10min。

(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupleddevice，ccd)每隔3min拍摄一次，持续30min，每次曝光时间10s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。

2、试验结果

小鼠注射外源性亚硫酸盐后生物发光信号随时间的变化如图7所示。由图7可知：实验组中小鼠体内的生物发光信号在15min左右达到最大，20min后逐渐降低；而对照组中小鼠的生物发光信号变化趋于平缓。实验组生物发光信号是对照组的2倍。即本发明的探针可对活体水平外源性的亚硫酸盐进行可视化和成像分析。

试验例4、小鼠体内生物发光信号强度随外源性亚硫酸盐浓度的变化

1、试验方法

(1)试验动物：transgenicfvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。

(2)试验分组：

实验组：腹腔注射0.2ml含不同亚硫酸根离子浓度的亚硫酸盐溶液(生理盐水配制的na2so3溶液，浓度分别为10μm、50μm、100μm和150μm)，再腹腔注射等体积实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)；

对照组(vehicle)：腹腔注射0.2ml生理盐水，再腹腔注射等体积实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)。

(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupleddevice，ccd)每隔3min拍摄一次，持续30min，每次曝光时间10s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。

2、试验结果

小鼠体内生物发光信号强度随外源性亚硫酸盐浓度的变化如图8所示。由图8可知：对照组仅有微弱生物发光信号，而实验组均有显著性增强的生物发光信号，并且该信号强度会与外源性亚硫酸盐浓度呈现正相关关系。即本发明的探针具有可视化分析活体内亚硫酸盐水平动态变化的能力。

试验例5、本发明生物发光探针在亚硫酸盐氧化酶缺乏症中的成像应用

1、试验方法

(1)试验动物：transgenicfvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。

(2)试验分组：

实验组：根据参考文献(herken,e.n.,e.kocamaz,o.erel,h.celikandv.kucukatay,2009.effectofsulfitetreatmentontotalantioxidantcapacity,totaloxidantstatus,lipidhydroperoxide,andtotalfreesulfydrylgroupscontentsinnormalandsulfiteoxidase-deficientratplasma.cellbiol.toxicol.25(4),355-362.)，造亚硫酸盐缺乏症的小鼠模型，然后腹腔注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)；

对照组：正常未处理小鼠腹腔注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(10μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)。

(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupleddevice，ccd)每隔3min拍摄一次，持续30min，每次曝光时间10s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。

2、试验结果

本发明生物发光探针在亚硫酸盐氧化酶缺乏症中的成像情况如图9所示。由图9可知：对照组小鼠体内生物发光信号强度随时间变化较为平缓，而实验组小鼠体内生物发光信号随时间延长逐渐增强，并且在21min达到最大值并趋于平衡。即本发明的探针能够对亚硫酸盐氧化酶缺乏症引起的亚硫酸盐蓄积在可视化水平起到一定的指示作用。

综上，本发明生物发光探针对亚硫酸盐中的亚硫酸根离子具有高选择性和高响应性，能够单一准确的选择亚硫酸盐，检测时灵敏度很高，可检测出浓度很低的亚硫酸盐，用于亚硫酸盐的精密检测。同时，本发明生物发光探针还能在活体水平对外源性亚硫酸盐和亚硫酸盐氧化酶缺乏症引起的亚硫酸盐蓄积进行动态可视化分析，有利于临床上对亚硫酸盐的检测，具有广阔的应用前景。