本发明涉及重组肠道病毒71型疫苗制备技术，尤其涉及一种重组肠道病毒71型病毒样颗粒粒径检测方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。
背景技术：
手足口病可由多种病毒感染引起。其中，肠道病毒71型(enterovirus71，ev71)较其他病毒毒株更易导致出现重症甚至死亡病例。因此，重组肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗的研发对于预防手足口病来说尤为重要。
重组的ev71病毒样颗粒是通过表达的蛋白间组装而成，其粒径大小反映了生理状态和生物学活性。在现有技术中，可以利用以动态光散射技术(dls)为原理基础的纳米级粒度仪检测病毒疫苗产品、抗体或其他生物制品粒径。
然而，发明人在研究本发明的过程中发现，经纯化工艺得到用于配制疫苗的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒原液，在原溶液ph6.3-7.5的磷酸盐缓冲液体系中，重组ev71病毒样颗粒随着时间的变化而易于聚集沉淀为肉眼可见的大颗粒，干扰病毒样颗粒粒径的检测。且现有技术的纳米级粒度仪分析时无法区分聚集沉淀的大颗粒与在溶液体系中处于分散状态的病毒样颗粒，影响粒径检测的准确性，无法真实反映处于分散状态的病毒样颗粒粒径大小。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是，提供一种重组肠道病毒71型病毒样颗粒粒径检测方法，该方法可有效解决重组肠道病毒71型病毒样颗粒间聚集沉淀的问题，使重组肠道病毒71型病毒样颗粒在溶液中充分分散并能维持其稳定性，从而准确地测定该病毒样颗粒的粒径大小。
本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种重组肠道病毒71型病毒样颗粒粒径检测方法在制备手足口病疫苗中的应用，该应用可有效解决重组肠道病毒71型病毒样颗粒间聚集沉淀的问题，使重组肠道病毒71型病毒样颗粒在溶液中充分分散并能维持其稳定性，从而准确地测定该病毒样颗粒的粒径大小。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种重组肠道病毒71型病毒样颗粒粒径检测方法，包括以下步骤：
在待检测的重组肠道病毒疫苗71型病毒样颗粒样品中，加入聚山梨酯80并混匀，至所述样品中聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-1mg/ml；
检测加入了所述聚山梨酯80的样品中所述病毒样颗粒的粒径。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-400μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为100μg/ml-300μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为200μg/ml-400μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为100μg/ml-200μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为150μg/ml-200μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-150μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80通过以下步骤加入：
配制含1.0-2.5mg/ml聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液，将配置好的所述磷酸盐缓冲液加入所述样品中。
在一些可能的实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.3-7.5。
在一些可能的实施方式中，采用以动态光散射技术(dls)为原理基础的纳米级激光粒度仪检测所述粒径。
相应地，本发明还公开了上述重组肠道病毒71型病毒样颗粒粒径检测方法在制备手足口病疫苗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过在检测样品的粒径前加入聚山梨酯80处理样品，令重组ev71病毒样颗粒能充分分散并维持其稳定性，从而解决了样品随着放置时间的延长而聚集沉淀的问题，达到了准确地检测分散在溶液体系中重组ev71疫苗病毒样颗粒的粒径大小的效果。
具体实施方式
下面详细描述本发明提供的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒的实施例；本实施例实现一次重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒粒径的检测主要包括以下步骤：
在待检测的重组肠道病毒疫苗71型病毒样颗粒样品中，加入聚山梨酯80并混匀，至所述样品中聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-1mg/ml；
检测加入了所述聚山梨酯80的样品中所述病毒样颗粒的粒径。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-400μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为100μg/ml-300μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为200μg/ml-400μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为100μg/ml-200μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为150μg/ml-200μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的终浓度为50μg/ml-150μg/ml。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80通过以下步骤加入：
配制含1.0-2.5mg/ml聚山梨酯80、ph值为6.3-7.5的磷酸盐缓冲液，将配置好的所述磷酸盐缓冲液加入所述样品中。
在一些可能的实施方式中，采用以动态光散射技术(dls)为原理基础的纳米级激光粒度仪检测所述粒径。
本发明实施例的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒粒径检测方法在制备手足口病疫苗中的应用，采用如前述实施例所描述的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒粒径检测方法，其余与现有技术相同，不再一一赘述。
为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例检测重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒粒径大小的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。
实例1：处理前与处理后样品粒径检测对比
仪器：
英国马尔文zen3600纳米粒度仪，sartoriusbt4202s电子分析天平。
试剂与试药：
聚山梨酯80：购自天津市大茂化学试剂厂，批号20180102；
ph6.3-7.5的磷酸盐缓冲液：由本公司生产车间配制提供。
流程：
配制含1.0-2.5mg/ml聚山梨酯80的ph6.3-7.5的磷酸盐缓冲液，取待检测的重组肠道病毒疫苗病毒颗粒样产品，分别加入上述含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液，制成聚山梨酯80浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、400μg/ml的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒处理后样品，每个浓度各制备三份。
分别将含不同浓度聚山梨酯80的病毒样颗粒处理后样品进行粒径检测，并以未经处理的该病毒样颗粒样品为对照，每份样品测试一次。
检测试验结果如下：
表一样品处理前与处理后粒径测量结果
结果表明，未经处理的样品由于病毒样颗粒间聚集沉淀产生大小不一的颗粒检测粒径结果偏离肠道病毒71型病毒样颗粒理论粒径值(34nm左右)。加入聚山梨酯80后，其检测值在粒径理论值附近，表明待检测样品的病毒样颗粒加入聚山梨酯80后能充分分散。
实施例2：样品处理前后的稳定性对比
仪器：
英国马尔文zen3600纳米粒度仪，sartoriusbt4202s电子分析天平。
试剂与试药：
聚山梨酯80：购自天津市大茂化学试剂厂，批号20180102；
ph6.3-7.5的磷酸盐缓冲液：由本公司生产车间配制提供。
流程：
配制含1.0-2.5mg/ml聚山梨酯80的ph6.3-7.5的磷酸盐缓冲液，取待检测的重组肠道病毒疫苗病毒颗粒样产品，分别加入上述含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液，制成聚山梨酯80浓度为150μg/ml的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒处理后样品。
将处理后的样品分别放置5分钟、15分钟、30分钟、60分钟后检测其粒径，同时以处理前的样品作为对照，同样放置5分钟、15分钟、30分钟、60分钟后检测粒径，每个时间段样品检测三次。
检测试验结果如下：
表二处理前后的样品不同时间段粒径测量结果
结果表明，未经处理的样品随着时间的延长，病毒样颗粒间不断聚集沉淀而产生大小不一的颗粒，且随着时间的延长，样品出现不稳定的现象导致三次平行检测的结果偏差较大。加入聚山梨酯80处理后，样品随着时间的延长，其检测结果仍能保持在33-34nm之间，且三次平行结果偏差小，说明加入聚山梨酯80处理后能将病毒样颗粒有效充分分散并能维持其稳定性。
通过上述各实例所检测的重组肠道病毒71型疫苗病毒样颗粒产品的粒径数据可知，本实施例达到了能充分分散样品、维持样品的稳定性，并能实现重组肠道病毒71性疫苗病毒样颗粒的粒径准确检测的效果。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。