一种棉花叶蜜腺相关的分子标记InDel-GaNEC1、引物对及其应用的制作方法

文档序号：20875253发布日期：2020-05-26 16:25阅读：173来源：国知局

本发明涉及一种棉花叶蜜腺相关的分子标记indel-ganec1、引物对及其应用，属于基因工程领域。

背景技术：

dna分子标记与其他标记相比较，具有明显的优越性：①直接以dna的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制、不存在是否表达的问题；②数量多、遍及整个基因组，检测位点近于无限；③多态性高、自然存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；④表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状况无必然的连锁；⑤有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。

indel标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失，根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的pcr引物。

indel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。indel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行pcr扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行分型。indel标记准确性高、稳定性好，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。此外，indel标记能扩增混合dna样品和高度降解的微量dna样品，并进行有效分型。indel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。随着位于功能基因上indel标记的开发，结合染色体步移和基因精细定位，可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选，有利于优良基因的进一步开发和利用。

棉叶背面叶脉上有凹窝，即蜜腺，窝内有许多棒状突起，分泌蜜汁。观察发现，亚洲棉有蜜腺材料的叶片背面中脉上，离叶基约1cm处有一蜂窝状凹陷，即为蜜腺所在，窝内有许多乳头状突起，可分泌蜜汁，最多时在5条叶脉上可生5个蜜腺。有蜜腺材料叶蜜腺颜色在形成初期呈淡绿色，成熟期呈白色，随着叶片的长大和成熟，蜜腺逐渐变为黑色；无蜜腺材料在叶背面叶脉上缺少蜂窝状的凹陷蜜腺，因而叶片的主脉光滑，无蜜腺材料的叶片除了缺少叶蜜腺外，叶片的其他结构与有蜜腺材料基本一致。棉花由于蜜腺多，蜜期长，蜜物多，易发生虫害。因此挖掘与棉花叶蜜腺性状相关的分子标记具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种棉花叶蜜腺相关的分子标记indel-ganec1、引物对及其应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种棉花叶蜜腺性状相关的分子标记indel-ganec1，其核苷酸序列如seqidno.7所示。

一种上述分子标记indel-ganec1在棉花分子标记辅助育种中的应用。

一种上述分子标记indel-ganec1在选育棉花有无叶蜜腺品种中的应用。

一种检测上述分子标记indel-ganec1的引物对，由正向引物indel-ganec1-f和反向引物indel-ganec1-r组成。

正向引物indel-ganec1-f的核苷酸序列如seqidno.8所示，反向引物indel-ganec1-r的核苷酸序列如seqidno.9所示。

一种上述引物对在棉花分子标记辅助育种中的应用。

一种上述引物对在选育棉花有无叶蜜腺品种中的应用。

一种利用上述引物对鉴别棉花叶蜜腺性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测棉花叶片的基因组dna；

(2)以提取的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增；

(3)将pcr扩增产物进行电泳，根据电泳条带，鉴别棉花叶蜜腺性状。

pcr反应体系：ddh2o20.2μl、10×buffer(含mg²⁺)2.5μl、dntps(25mm)0.15μl、taq酶(5u/μl)0.15μl、10mm正向引物indel-ganec1-f0.5μl、10mm反向引物indel-ganec1-r0.5μl、模板1.0μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，运行35个循环；最后72℃延伸3min。

鉴别棉花叶蜜腺性状的方法为：当目的条带为一条，且目的条带长158bp时，可以确定待测棉花具有正常的叶蜜腺；当目的条带为一条，且目的条带长143bp时，可以确定待测棉花不具有叶蜜腺；当目的条带为两条，且目的条带的长度分别为158bp和143bp时，可以确定待测棉花具有正常的叶蜜腺。

本发明的有益效果：

本发明提供一种棉花叶蜜腺性状相关的分子标记indel-ganec1，通过检测棉花种子或者幼苗植株是否具有上述分子标记，能够有效地在早期确定其是否具有叶蜜腺，为选育无蜜腺抗虫棉花提供有力的手段。具体地，具有indel-ganec1所示核苷酸序列且在分子标记位点纯合的个体，表现为棉花具有正常的叶蜜腺；缺失indel-ganec1所示核苷酸序列且在分子标记位点纯合的个体，表现为棉花的叶蜜腺的缺失；具有indel-ganec1所示核苷酸序列且在分子标记位点杂合的个体，表现为棉花具有正常的叶蜜腺。进一步，当采用针对该分子标记的特异性引物对待测棉花植株进行pcr扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)检测时，通过目的条带的条数和长度，能够有效地确定待测棉花植株是否具有叶蜜腺的表型。具体地，当目的条带为一条，且目的条带长约158bp时，可以确定待测棉花具有正常的叶蜜腺；当目的条带为一条，且目的条带长约143bp时，可以确定待测棉花不具有叶蜜腺；当目的条带为两条，且目的条带的长度分别为约158bp和143bp时，可以确定待测棉花具有正常的叶蜜腺。由此，本发明的分子标记与棉花叶蜜腺性状紧密相关，能够有效用于棉花的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种中对叶蜜腺有无的选育需求，对棉花育种材料进行早期选择，进一步有效提高育种的效率和准确性，提高棉花繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出棉花有无蜜腺的优良品种。例如，利用该分子标记的特异性引物对待测棉花植株进行扩增、page凝胶电泳，选择扩增产物目的条带为一条且长约143bp的棉花植株，即可容易地筛选获得不具有叶蜜腺的棉花植株，从而可以直接应用于分子育种实践。

利用本发明的分子标记进行棉花分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

附图说明

图1为棉花蜜腺的gwas分析结果。图中，a为染色体，b为12号染色体的分化信号，c为12号染色体的snp-cluster。

图2为有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料基因ganec1的cds序列比对图。

图3为有叶蜜腺父本p1、无叶蜜腺母本p2以及杂交f1代的pcr扩增产物的电泳检测结果。

图4为部分f2代个体的pcr扩增产物的电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：分子标记indel-ganec1的获得

1、gwas分析

使用emmax软件(http://genetics.cs.ucla.edu/emmax/)，对1425003个高质量的snp(maf>0.05，缺失率<20％)进行叶片蜜腺的gwas分析遗传分析。全基因组显著性阈值用公式p＝0.05/n(其中n是独立snp的有效数量)进行评估(miao-xinli,juilianm.y.yeung,staceys.cherny,pakc.sham.evaluatingtheeffectivenumbersofindependenttestsandsignificantp-valuethresholdsincommercialgenotypingarraysandpublicimputationreferencedatasets[j].humangenetics,2012,131(5):747-756)。亚洲棉种群显著性的p值为～1.0×10^-6。

蜜腺的gwas分析结果显示，发现在12号染色体(～19.5mb到～20.1mb)上发现了一个强关联信号(图1a)。放大chr12上的分化信号显示，～0.64mb区域(19.57～20.21mb)显示出显著的群体分化，平均fst值为0.40，而全基因组规模的平均fst值为7.8×10^-3(图1b)。在chr12上放大snp-cluster，其起始位置为19.55～20.07mb，与fst区有500kb(19.57～20.07mb)的重叠区域，表明500kb片段是无蜜腺性状的重要候选区域。500kb区域有11个基因，其中ga12g1408、ga12g1409和ga12g1412在外显子区域有snps，ga12g1413、ga12g1416和ga12g1417在内含子区域有snps(图1c)。所有这些基因都是无蜜腺性状的候选基因，对外显子存在snp的候选基因进行测序发现ga12g1409在两种材料上存在明显的序列差异，再一次佐证了ga12g1409为蜜腺相关基因，并将该蜜腺基因命名为ganec1。

2、基因测序比对

基因ganec1在有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料中测序结果为：在无蜜腺材料中该基因存在一段15bp的碱基缺失以及一个非同义的单核苷酸突变。具体操作如下：

(1)设计基因扩增引物：

cds1409-f：5’-atgctccaccctaaccataaacc-3’(seqidno.1)

cds1409-r：5’-cctattttgaattggcgaagatcaat-3’(seqidno.2)

(2)pcr扩增：

pcr扩增的反应体系(50μl)如下：5×primestarbuffer10μl、dntpmixture4μl、cds1409-f(10μm)1μl、cds1409-r(10μm)1μl、cdna1μl，primestarhstaq(5u/μl)1μl，超纯水32μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火70s，68℃延伸45s，32个循环；最后68℃延伸5min。

(3)电泳：

pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用qiagen凝胶纯化试剂盒(qiagen，valencia，ca)进行纯化。

(4)pcr纯化产物连接测序载体

按照艾德莱生物有限公司的零背景ppoto-bluntsimple平末端克隆试剂盒(目录号：cv17)将凝胶纯化的pcr扩增子克隆入该载体中，并转化大肠杆菌dh5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落pcr，把阳性克隆进行测序。测序引物为载体通用引物：

m13-f：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’(seqidno.3)

m13-r：5’-caggaaacagctatgacc-3’(seqidno.4)

(5)测序结果分析

扩增的cds序列如下：

>ganec1less：

>ganec1

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatccttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacccgtgtactcgtcgttgatcgctctatttccttctccgagttgtcgttgaagatgggggagatgtgtggaacatcggtgagtttacgttgccagttgccaacagaagacttggacgcgctggtttcgattacttccggtgaagaactcgcctacctcatcgaggaatacgatcggttggcatcgcctgcatcctttttaaagatacgagctttccttgggatgccaaaatcaaccacaaaatcaatttctctatcatcctcgtccttaacgttatcatccacttcatcttcaaattcatcttcatcgtcatcaactccccggtcttcctgcgtacgtcatatccccaggactccccccgtcgctttccctccttgctcctccaagaaatcaaccacaaacaatattccttgctatggttatctagttcatcatggcaaccatattcagatttacgttagaactggaaacactggcaattgcaatagcaggaaccagcatcataaactgtttacctattttgaattggcgaagatcaattag(seqidno.6)测序结果表明：pcr扩增得到的基因组大小为736bp，cds序列大小为648bp，采用dnaman软件对获得的序列进行预测分析，发现该基因具有1个外显子，位置分别为146-233bp。ganec1在两种材料中存在序列差异，在无叶蜜腺材料当中存在一个15bp的碱基缺失以及一个非同义的单核苷酸突变，二者分别位于cds序列的547-561bp处和530bp处。缺失的序列为：catattcagatttac(seqidno.7)，对应的氨基酸为：hiqiy，突变的碱基为t-g，对应改变的氨基酸为l-r(图2)，该片段的缺失和单核苷酸的突变是导致无叶蜜腺棉花形成的根本原因。因此本发明设计以seqidno.7所示的核苷酸序列作为棉花叶蜜腺性状相关的分子标记，命名为indel-ganec1，该分子标记表现为缺失长度多态性，其片段大小为15bp。

实施例2：利用分子标记indel-ganec1鉴定棉花叶蜜腺的方法

1、基因组dna的提取

(1)称取3g新鲜棉花叶片于研钵中，加液氮并迅速研磨成粉末。迅速转移至1个2ml的离心管，并加入800μl已预热的ctab裂解液(65℃)，混匀后置于65℃烘箱30-40min，且每隔10min缓慢颠倒混匀一次。

(2)取出离心管，加入800μl体积比24:1的氯仿和异戊醇，缓慢上下颠倒100次，至混匀不分层为止。

(3)4℃条件下，12000rpm离心10min。

(4)用剪去尖的枪头吸取上清液并转移至另一个2ml离心管中。

(5)加入与上清液等体积的体积比24:1的氯仿和异戊醇，上下缓慢颠倒100次，至混匀不分层为止。

(6)4℃条件下，12000rpm离心10min。

(7)用无尖的枪头吸取上清液应转移至另一个1.5ml离心管中。

(8)加入0.8倍体积的冰冷异戊醇(提前放-20℃冰箱)，缓慢颠倒30次，直至出现絮状dna生成，静置30min。

(9)用小枪头挑出dna至1.5ml离心管中，加入70％(v/v)乙醇洗2次，无水乙醇洗1次。

(10)过夜干燥，加ddh2o，溶解dna，直至完全溶解，作为模板(浓度大于50ng/μl)，-20℃保存待用。

2、引物设计

正向引物indel-ganec1-f：5’-ttgccagtgtttccagttctaa-3’(seqidno.8)

反向引物indel-ganec1-r：5’-cggtcttcctgcgtacgtcata-3’(seqidno.9)

3、pcr反应体系

4、pcr反应程序

将上述配制好的试剂混合液转移到pcr管或板中，放入pcr仪器，进行pcr扩增，pcr反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，运行35个循环；最后72℃延伸3min。pcr扩增产物经纯化后于4℃下保存。

5、电泳

将各pcr扩增产物取部分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。当目的条带为一条，且目的条带长约158bp时，可以确定待测棉花具有正常的叶蜜腺；当目的条带为一条，且目的条带长约143bp时，可以确定待测棉花不具有叶蜜腺；当目的条带为两条，且目的条带的长度分别为约158bp和143bp时，可以确定待测棉花叶蜜腺具有正常的叶蜜腺。

实施例3：利用分子标记鉴定棉花叶蜜腺

1、实验材料

实验用棉花材料ga0028(无蜜腺)与ga0029(有蜜腺)为国家棉花种质资源中期库提供，2015年和2016年种植在河南安阳中国农业科学院棉花研究所(icr)试验田。以有蜜腺棉花ga0029作为父本p1，无蜜腺棉花ga0028作为母本p2，进行杂交，获得杂交f1代，f1代自交得到f2代群体。

2、实验方法

利用实施例2的方法对有蜜腺父本p1、无蜜腺母本p2以及杂交f1代和f2代进行鉴定，结果见图3和4。

3、实验结果

结果表明，有叶蜜腺父本p1扩增产物为158bp大小的扩增片段，无叶蜜腺母本p2扩增产物为143bp大小的扩增片段，杂交f1代具有正常叶蜜腺则同时含有158bp和143bp两个扩增片段(图3所示白色实线f1标识所示)。图4显示了部分f2代个体扩增产物的电泳检测结果，含有叶蜜腺单株扩增出158bp的条带(图4白色实线上标识的3、13、18、21)或扩增出158bp和143bp两个片段(图4白色实线上标识的1、4、5、6、11、15、16、17、19、23、24)，不含叶蜜腺的单株均扩增出143bp的条带(图4白色实线上标识的2、7、8、9、10、12、14、20、22)，由此，证明该分子标记在叶蜜腺性状判定方面具有很高的准确性，与棉花叶蜜腺性状紧密相关。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>一种棉花叶蜜腺相关的分子标记indel-ganec1、引物对及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

atgctccaccctaaccataaacc23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

cctattttgaattggcgaagatcaat26

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

tgtaaaacgacggccagt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

caggaaacagctatgacc18

<210>5

<211>633

<212>dna

<213>棉花(gossypiumspp.)

<400>5

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatc60

cttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacccgtgtactcgtc120

gttgatcgctctatttccttctccgagttgtcgttgaagatgggggagatgtgtggaaca180

tcggtgagtttacgttgccagttgccaacagaagacttggacgcgctggtttcgattact240

tccggtgaagaactcgcctacctcatcgaggaatacgatcggttggcatcgcctgcatcc300

tttttaaagatacgagctttccttgggatgccaaaatcaaccacaaaatcaatttctcta360

tcatcctcgtccttaacgttatcatccacttcatcttcaaattcatcttcatcgtcatca420

actccccggtcttcctgcgtacgtcatatccccaggactccccccgtcgctttccctcct480

tgctcctccaagaaatcaaccacaaacaatattccttgctatggttatcgagttcatcat540

ggcaacgttagaactggaaacactggcaattgcaatagcaggaaccagcatcataaactg600

tttacctattttgaattggcgaagatcaataag633

<210>6

<211>648

<212>dna

<213>棉花(gossypiumspp.)

<400>6