犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法和应用与流程

文档序号：20875247发布日期：2020-05-26 16:25阅读：233来源：国知局

本发明是关于动物检验检疫技术领域，特别是关于一种犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法和应用。

背景技术：

犬新孢子虫(neosporacaninum)隶属于顶复亚门的胞内寄生原虫，可以感染多种动物，能够引起牛、犬等多种动物的神经肌肉系统功能障碍和妊娠动物繁殖障碍。为有效检测犬新孢子虫感染，研究人员已建立了多种血清学和免疫学检测方法，包括间接免疫荧光实验(ifat)、酶联免疫吸附试验(elisa)以及改良凝集试验(nat)等，其中elisa在检测犬新孢子虫感染最为广泛，但其对于早期感染和5月龄内犊牛感染时效果不佳。pcr扩增是目前运用最普遍的分子生物学工具，以及广泛用于多种疾病和感染的诊断。目前，已经有用于犬新孢子虫诊断的pcr方法，但在低丰度样本中存在灵敏度低、特异性差的特点。因此筛选出犬新孢子虫的特异基因并建立高灵敏度和高特异性的pcr检测方法对犬新孢子虫感染的诊断十分必要。国内外对于犬新孢子虫病的检疫诊断还相对滞后，对该病的检测远不能满足实际需要。因此，建立简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学检测方法势在必行。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种犬新孢子虫的特异基因序列，该特异基因序列在犬新孢子虫基因组中具有五个拷贝，从而更有利于根据犬新孢子虫基因组序列特征设计特异扩增引物，可准确、快速诊断犬新孢子虫感染所致的母畜流产病原以及对动物群体新孢子虫感染的调查。

为实现上述目的，本发明提供了犬新孢子虫的特异基因序列，所述特异基因序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一对扩增引物，所述扩增引物用于扩增上述犬新孢子虫的特异基因序列，所述扩增引物具有以下序列：上游引物f：5’-cgcacaagaaaccgaggaa-3’(seqidno.2)，下游引物r：5’-gaaggcgagaagcccaagt-3’(seqidno.3)。

本发明还提供了一种犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒，包括上述扩增引物。

本发明还提供了一种犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒，包括以下试剂：10×pcr反应液、上述扩增引物、阳性对照dna、阴性对照、和ddh2o。

在一优选的实施方式中，所述阳性对照dna为犬新孢子虫基因组dna。

在一优选的实施方式中，所述阴性对照为dh2o。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒的制备方法，包括以下操作：10×pcr反应液：300mm的dntps(购自日本takara公司)20μl，tris(购自美国pragma公司)2.42mg，kcl(购自美国sigma公司)7.45mg，mgcl2(购自美国sigma公司)0.258mg,200u的taq酶(购自日本takara公司)20μl，加入150μlddh2o，用hcl调ph至8.5，用ddh2o定容至200μl；阳性对照dna的制备：阳性对照dna为犬新孢子虫基因组dna，将培养的犬新孢子虫用细胞计数板计数，将10⁷个犬新孢子虫提取基因组dna，然后稀释为100μl；试剂盒的组装：按下列内容组装试剂盒：10×pcr反应液:200μl，10mm上游引物f:50μl；10mm下游引物r:50μl；阳性对照dna:100μl；ddh2o:2ml；其中，整个操作过程要求在无菌环境下进行。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，包括以下步骤：待检样品dna的提取：将待检样品用常规方法提取dna；pcr反应体系的准备：准备待检样品数+2的pcr反应管，每个pcr反应管均做好标记并根据标记按照pcr反应体系添加相应试剂；pcr扩增：将上述pcr反应管置于pcr仪中进行pcr扩增，其中pcr的反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min；以及pcr产物观察：称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解，等胶冷却后在加样孔中分别加样，120v电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果；其中，所述pcr反应体系包括：10×pcr反应液：2μl；待检样品dna或阳性对照或阴性对照；10mm上游引物f：1μl；10mm下游引物r：1μl；ddh2o：补足至20μl。

在一优选的实施方式中，所述待检样品dna的用量根据提取基因组dna浓度决定，所述阳性对照和所述阴性对照的用量均为1μl。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的动物检验检疫领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用邻近蛋白生物素标记技术筛选到犬新孢子虫特异基因ncgra11b(seqidno.5)，随后在新孢子虫基因组数据库进行blast搜索，筛选到与以上基因序列相似度较高的四个特异基因ncgra11a(seqidno.4)、ncgra11c(seqidno.6)、ncgra11d(seqidno.7)、和ncgra11e(seqidno.8)。由于目前新孢子虫基因组测序尚未完全，以上涉及的五个特异基因在基因组上的位置以及各自的序列信息还不完整。通过pcr扩增、测序和拼接，我们获得了这五个基因的完整序列信息，并证实这五个基因均位于新孢子虫chrⅳ染色体上，成线性依次排列。经多序列比对，我们在上述五个特异基因中均发现了特异基因序列seqidno.1(即seqidno.1在犬新孢子虫基因组中具有五个拷贝)，进一步根据seqidno.1序列特征设计特异扩增引物，经多次扩增和筛选，最终确定了特异扩增引物seqidno.2和seqidno.3，并构建犬新孢子虫pcr检测试剂盒，应用于动物新孢子虫感染的临床检测和筛查，可准确、快速诊断犬新孢子虫感染所致的母畜流产病原以及对动物群体新孢子虫急性、慢性及隐性感染的调查，本试剂盒也可用于犬新孢子虫的分子鉴定。

(2)本试剂盒为临床诊断和犬新孢子虫病感染/流行的预测预报提供依据，所构建的试剂盒具有特异性好、准确率高的优势，且简便和易于操作。具有重大的社会意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的检测试剂盒特异性的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是根据本发明一实施方式的检测试剂盒灵敏度的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是根据本发明一实施方式的样品检测实例的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过实施例1-3对犬新孢子虫特异基因序列的引物设计、试剂盒的组装及使用方法进行具体描述。

实施例1

本发明根据pcr扩增原理，设计并合成了一组扩增犬新孢子虫特异基因序列seqidno.1的pcr引物，引物合成委托北京睿博兴科生物技术有限公司完成。引物合成后用灭菌蒸馏水制成100mm原液(储藏液)，再用ddh2o稀释到10mm作为工作液。引物序列如下：

上游引物f：5’-cgcacaagaaaccgaggaa-3’(seqidno.2)

下游引物r：5’-gaaggcgagaagcccaagt-3’(seqidno.3)

实施例2

试剂盒组装

1)10×pcr反应液：300mm的dntps(购自日本takara公司)20μl，tris(购自美国pragma公司)2.42mg，kcl(购自美国sigma公司)7.45mg，mgcl2(购自美国sigma公司)0.258mg，200u的taq酶(购自日本takara公司)20μl，加入150μlddh2o，用hcl调ph至8.5，用ddh2o定容至200μl。

2)阳性对照dna的制备：阳性对照dna为犬新孢子虫基因组dna，将培养的犬新孢子虫用细胞计数板计数，用10⁷个犬新孢子虫提取基因组dna，用水稀释至100μl。

3)试剂盒的组装：

按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)：

10×pcr反应液200μl

10mm上游引物f50μl

10mm下游引物r50μl

阳性对照dna100μl

ddh2o2ml

实施例3

本发明试剂盒的使用方法如下：

取待检样品，按常规方法提取基因组dna，用本试剂盒内试剂进行pcr扩增。pcr反应加样体系如下，总反应体系为20μl(标本dna的用量根据提取基因组dna浓度决定，最后用ddh2o补足20μl；阳性对照用量为1μl)：

10×pcr反应液：2μl

根据提取dna量决定标本dna

上游引物f(10mm)：1μl

下游引物r(10mm)：1μl

ddh2o：补足至20μl

将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并做好标记，置于pcr仪中。pcr反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min。

pcr产物观察：称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热约三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在各加样孔中分别加样，120v电压下电泳10分钟，之后取出琼脂胶在紫外灯下观察实验结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。

以下进一步通过实施例4-6对犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒的特异性、灵敏性度及临床动物试验进行具体描述。

实施例4

试剂盒特异性

以犬新孢子虫和弓形虫速殖子2个样本dna为模板，用本试剂盒内进行pcr扩增。pcr反应体系如下：

10×pcr反应液：2μl

样品：1μl

上游引物f(10mm)：1μl

下游引物r(10mm)：1μl

ddh2o：15μl

把样品依次加入并标记好，置于pcr仪中；pcr反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共34个循环，后72℃延伸5min。

pcr产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120v电压下电泳10分钟，之后取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图1的条带可以看出，最终确定pcr试剂盒为犬新孢子虫特异检测试剂盒(见图1)；图1中，dl2000plusdnamaker；1:犬新孢子虫基因组dna；2：弓形虫基因组dna；3：阴性对照(dh2o)。

实施例5

制备的试剂盒灵敏度

1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10^-1、1×10^-2个犬新孢子虫基因组dna，用本试剂盒内进行pcr扩增。pcr反应加样体系如下：

10×pcr反应液：2μl

样品：1μl

上游引物f(10mm)：1μl

下游引物r(10mm)：1μl

ddh2o：15μl

将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于pcr仪中。pcr条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min。

pcr产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120v电压下电泳10分钟，取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图2的条带可以看出，最终确定pcr试剂盒可检测到1个犬新孢子虫dna(见图2)：图2中，dl2000plusdnamaker；1-8:犬新孢子虫基因组dna梯度从1×10⁵-1×10^-2个；9：阴性对照(dh2o)。

实施例6

临床动物样品检测

采集北京地区流产牛组织样15份，用试剂盒对样本进行检测。

1)流产牛组织样本处理：使用研磨器将流产牛组织(2g)进行研磨，吸取100μl样于灭菌后的1.5ml离心管，用组织dna提取试剂盒提取基因组dna，按操作手册进行。

2)样品扩增

以提取好的样本dna为模板，用本试剂盒内试剂进行pcr扩增。pcr反应加样体系如下：

10×pcr反应液：2μl

样品：2μl

上游引物f(10mm)：1μl

下游引物r(10mm)：1μl

ddh2o：14μl

pcr扩增产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120v电压下电泳10分钟，取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图3的条带可以看出，最终确定pcr试剂盒可用于犬新孢子虫感染样品的检测，其敏感性明显高于扩增新孢子虫nc5序列。图3中，dl2000plusdnamaker；1-15:15份流产牛组织基因组dna；+：阳性对照；-：阴性对照；b：空白对照。nc5引物检测作为对照。

3)pcr产物测序

在紫外灯下将出现的扩增条带用洁净的手术刀切下，放入灭菌1.5ml离心管，使用北京索莱宝科技有限公司的dna胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。经pcr扩增共有4个阳性结果，对阳性结果进行序列测定，序列与目的序列完全一致，正确率为100％。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110>中国农业大学

<120>犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法和应用

<130>p191273dd1f

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>376

<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

<400>1

cgcacaagaaaccgaggaacccagccggcgtcgcaagcaggctgcactcgtggccgcagt60

gctggtagcggcggccgtctacggtctgcgttcgtctctcttgggggttgacaaggtgtc120

ttcgccgacggcactccaggggctcctaaaaaaaccagaaagcatgcacggcattgatcc180

tgatgcctccgtcgacttccaaccagacgcgtcggtcgagcggcaaatggaagtgccggc240

cgaaggtgcgggtgatgaagtgcgaggttggcagcatttagtccgggacttttcggcgat300

gttagcgggagaatatgcgctatccccgcgcgtcggagcggtggcctcggctgttgcact360

tgggcttctcgccttc376

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

<400>2

cgcacaagaaaccgaggaa19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaaggcgagaagcccaagt19

<210>4

<211>2322

<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

<400>4

atgtgtcgaggaggcaaaaatgtctcacatcgtttggcatccagagctggacttcttctg60

gtcgcctgctgcgcgtgcgctcttctctcttcgtcgccgcttcccacgcggcggtatttc120

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tccgcactggaagaagtggaaaagaatatcaagggagagtag2322

<210>5

<211>2883

<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

<400>5

atgcgtcgaggaagcgaaaacttccgccatcttttggcgtccagagctggacttcttctg60

gtcgcctgctgcgcgtgcgctcttctctcttcggcgccgcttcccacgcggcggtatttc120

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gaggcgatgaggaaaaacgttgacctcggccgcctcgcgcaggcagttgcttctttggcg2220

gaaacagtggagcagggacagcgagacggagttattgaggagcagatcgctccgctcgag2280

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taa2883

<210>6

<211>2565

<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

<400>6

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ctgctcggtgctgggccgcctccctcgtcgcggcgtctcctttccttcagtctcgccatt120

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<212>dna

<213>犬新孢子虫(neosporacaninum)

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