一种薏苡Waxy基因突变的PCR检测引物及其应用的制作方法

本发明属于植物育种领域，涉及一种薏苡waxy基因突变的pcr检测引物及其应用。

背景技术：

薏苡为禾本科薏苡属(coixl.)一年生或多年生草本植物，是“药(医)食同源”作物之典型代表，具有抗肿瘤、降血糖、抑制肿瘤血管生成及提高免疫力、美化肌肤等多种药理作用，可治疗水肿、慢性胃肠溃疡、肺痿、赘疣、关节炎、氙气和子宫肿瘤等疾病。

薏苡和其他禾谷类作物一样，其籽粒也有粳糯性之分，由胚乳中直链淀粉和支链淀粉含量及比例决定。淀粉在胚乳中的合成是一个复杂的代谢过程，而颗粒结合淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase，gbss)则是淀粉合成途径中的关键酶，它直接参与直链淀粉的生物合成，其酶活性的高低和表达与否都会影响胚乳的表观结构与纹理，这与直链、支链淀粉的含量及比例变化密切相关。gbss蛋白编码基因waxy则是控制籽粒粳、糯性的根本原因，野生型的waxy基因(wx)编码合成的gbss酶活性正常，籽粒中直链淀粉合成正常，表现为粳性(非糯性)；而糯性基因(wx)则是由于waxy基因的隐性功能突变引起的，致使gbss酶活合成异常或酶活性降低，最终导致直链淀粉不能或很少合成，从而使胚乳表现为糯性。糯性性状是早期农民选择和作物驯化的重要性状之一。2012年日本学者从日本和韩国栽培薏苡中克隆了野生型waxy基因及其功能突变体基因序列，发现在该基因的第10到11个外显子之间存在片段缺失，从而引起薏苡糯性，也为薏苡的分子辅助选育提供了理论基础。

目前，小麦、玉米、高粱、糜子、谷子、马铃薯、甘薯中的waxy基因发生了许多自然突变，并产生了众多糯性品种。waxy基因分型技术被广泛用于小麦、玉米、高粱、糜子、谷子、马铃薯、甘薯的糯性鉴定；但是关于薏苡waxy基因分型技术的研究却鲜有报道。

如申请号为cn201410709806.8的专利公开了一种大麦waxy基因snp突变的pcr-ctpp标记引物及方法，包括外引物g3935-twf2和g3935-twr2；内引物g3935-tnf2和g3935-tnr2；大麦waxy基因snp突变的pcr-ctpp标记方法，包括以下步骤：采用ctab法提取待检测植株基因组dna；利用提取的dna为模板进行特异性pcr扩增；将pcr扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。本发明使用四个引物结合一次pcr和电泳，便能在大麦群体中快速且经济地筛选出携带g3935突变为t位点的糯大麦材料，并能作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。

薏苡、麦子、玉米、高粱、糜子、谷子、马铃薯等作物的waxy基因虽然是同源的，但是其变异位点及导致糯性形成的机制也大不相同。因此在不同的作物中waxy的分子检测技术也存在特异性，麦子等作物的waxy基因分型技术是不能用于薏苡waxy基因分型。长期以来，薏苡基本上处于野生和半野生状态，很少进行遗传改良，加上其异化授粉作物特性，致使薏苡品种的异质性较高，提纯复壮和品种选育难度大。分子辅助选育从dna水平对植株进行检测和选择，不受环境因素影响，因此有必要建立薏苡waxy基因分型技术，从分子水平上区分薏苡的粳、糯性并提高选择效率，这对于加快薏苡育种进程具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种薏苡waxy基因突变的pcr检测引物及其应用，具体是通过以下技术方案实现的：

一种薏苡waxy基因突变的pcr检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：

pcr正向引物：5’-ggacgtcagcgagtgggacc-3’，结合区域为第9外显子保守区；

pcr反向引物：5’-acgagtccaccggtggacgc-3’，结合区域为第11外显子保守区。

本发明还提供了一种上述薏苡waxy基因突变的pcr检测引物在薏苡选育中的应用，用于薏苡单株粳、糯性分型。

优选地，所述薏苡waxy基因突变的pcr检测引物在薏苡选育中的应用，包括以以下步骤：

(1)田间种植与留苗：选取成熟饱满的薏苡籽粒，采用直播法进行播种，行距40～80cm、株距10～50cm，播种量1～10粒/窝以保证出苗率，3～6叶期定苗留苗；

(2)薏苡waxy基因分型：在薏苡苗期，取少量薏苡叶片提取薏苡基因组dna，以提取的薏苡基因组dna为模板，采用pcr检测引物进行特异性pcr扩增反应；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分型检测；

(3)株系选择：根据凝胶电泳分型结果，淘汰杂合体单株，保留纯合体单株。

本发明提供的方法在苗期即可对薏苡单株从分子水上进行粳、糯性分型，然后对目标单株进行隔离套袋，实现对粳、糯性薏苡种质的提纯复壮和单株选育；加速育种进程。

优选地，所述pcr扩增反应体系为：总体积25μl，包含taqpcrmastermix12.5μl，10μmpcr正向引物1μl，10μmpcr反向引物1μl，ddh2o9.5μl，模板dna30～50μg。

优选地，pcr扩增反应程序的退火温度为65～69.7℃。

本发明研究了不同退火温度对pcr检测结果的影响，pcr反应在退火温度为65～69.7℃时，都能得到比较清晰的pcr产物扩增条带，在退火温度为67℃效果最好。

优选地，pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性50s，67℃退火50s，72℃延伸5min，32个循环，最后72℃延伸10min，12℃保存。

优选地，所述pcr扩增产物采用0.8％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，纯合粳性单株只扩增出850bp条带，杂合粳性单株同时扩增出850bp和550bp条带，纯合糯性植株只扩增出550bp条带。

优选地，所述pcr扩增产物采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明方法可以专一的识别薏苡waxy基因的突变位点和进行基因分型，由于waxy基因的分型标记属于共显性标记，能有效区分薏苡单株的粳、糯性是否杂合，可用于粳性和糯性薏苡品种的选育，从而加速育种进程。

(2)本发明从分子水平上对薏苡单株进行粳、糯性鉴定和筛选，不受植物生长环境影响，稳定性好、准确性高。

附图说明：

图1为48个薏苡单株的waxy基因分型鉴定结果；编号1-48表示株系编号，其中，编号1-24，31-34，37为糯性纯合体；25，29，35，44，47为粳性纯合体；26-28，30，38-43，45，48为粳性杂合体；m为dna分子量marker。编号1-30为‘兴仁白壳’薏苡品种；编号31-40为‘广西白薏苡’品种，编号41-48为‘安国薏苡’品种。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

引物设计：

根据waxy基因序列对特定区段进行pcr引物设计，设计pcr正向引物(fp)为：5’-ggacgtcagcgagtgggacc-3’，结合区域为第9外显子保守区；反向引物(rp)为5’-acgagtccaccggtggacgc-3’)，结合区域为第11外显子保守区。

实施例1

薏苡选育:

(1)选取成熟饱满的‘兴仁白壳’薏苡品种籽粒，采用直播法进行播种，行距50cm、株距30cm，播种量7粒/窝以保证出苗率，3叶期定苗留苗。

(2)随意选取30株薏苡苗，编号为1-30，取少量薏苡叶片提取薏苡基因组dna，以提取的薏苡基因组dna为模板，采用pcr引物进行特异性pcr扩增反应；

pcr反应体系的总体积25μl，含有taqpcrmastermix12.5μl，10μm的正向引物1μl，10μm反向引物1μl，ddh2o9.5μl，dna模板30～50μg。

pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃变性50s，65℃退火50s，72℃延伸5min，32个循环，最后72℃延伸10min，12℃保存。

pcr产物采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，纯合粳性单株只扩增出850bp条带，杂合粳性单株同时扩增出850bp和550bp条带，纯合糯性植株只扩增出550bp条带。

30株薏苡苗，24株只扩增出550bp条带(编号：1-24)，为糯性纯合体植株；2株只扩增出850bp条带(编号：25、29)，为粳性纯合体植株；4株同时扩增出扩增出850bp和550bp条带(编号：26,27,28和30)为粳性杂合体植株，如图1所示。

(3)根据凝胶电泳分型结果，淘汰4株粳性杂合体植株，保留其余的纯合体单株，在开花期每株选取3个单茎，进行单株套袋并分别做好标记。成熟期收获袋子里的茎节，脱粒保存。

对收获的1-24、25、29号薏苡植株套袋里的薏苡仁进行表型检测，采用碘试剂染色法，1-24号薏苡植株的薏苡仁呈现棕红色，为糯性；25、29号薏苡植株的薏苡仁呈现蓝色，为粳性(非糯性)。染色结果验证了本发明提供的pcr引物在鉴定薏苡苗糯性、粳性、粳性杂合体的可靠性。

实施例2

薏苡选育:

(1)选取成熟饱满的‘广西白薏苡’品种籽粒，采用直播法进行播种，行距50cm、株距30cm，播种量7粒/窝以保证出苗率，3叶期定苗留苗。

(2)随意选取10株薏苡苗，编号为31-40，取少量薏苡叶片提取薏苡基因组dna，以提取的薏苡基因组dna为模板，采用pcr引物进行特异性pcr扩增反应；

pcr反应体系的总体积25μl，含有taqpcrmastermix12.5μl，10μm的正向引物1μl，10μm反向引物1μl，ddh2o9.5μl，dna模板30～50μg。

pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃变性50s，67℃退火50s，72℃延伸5min，32个循环，最后72℃延伸10min，12℃保存。

pcr产物采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，纯合粳性单株只扩增出850bp条带，杂合粳性单株同时扩增出850bp和550bp条带，纯合糯性植株只扩增出550bp条带。

10株薏苡苗，5株只扩增出550bp条带(编号：31-34,37)，为糯性纯合体植株；1株只扩增出850bp条带(编号：35)，为粳性纯合体植株；3株同时扩增出扩增出850bp和550bp条带(编号：38,39和40)为粳性杂合体植株，1株无扩增(编号：36)，如图1所示。

(3)根据凝胶电泳分型结果，淘汰3株粳性杂合体植株和1株无扩增植株，保留其余的纯合体单株，在开花期每株选取3个单茎，进行单株套袋并分别做好标记。成熟期收获袋子里的茎节，脱粒保存。

对收获的31-34,37-40号薏苡植株套袋里的薏苡仁进行表型检测，采用碘试剂染色法，31-34、37号薏苡植株的薏苡仁呈现棕红色，为糯性；35号薏苡植株的薏苡仁呈现蓝色，为粳性(非糯性)。染色结果验证了本发明提供的pcr引物在鉴定薏苡苗糯性、粳性、粳性杂合体的可靠性。

实施例3

薏苡选育:

(1)选取成熟饱满的‘安国薏苡’品种籽粒，采用直播法进行播种，行距80cm、株距50cm，播种量10粒/窝以保证出苗率，6叶期定苗留苗。

(2)随意选取8株薏苡苗，编号为40-48，取少量薏苡叶片提取薏苡基因组dna，以提取的薏苡基因组dna为模板，采用pcr引物进行特异性pcr扩增反应；

pcr反应体系的总体积25μl，含有taqpcrmastermix12.5μl，10μm的正向引物1μl，10μm反向引物1μl，ddh2o9.5μl，dna模板30～50μg。

pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃变性60s，69.7℃退火50s，72℃延伸5min，32个循环，最后72℃延伸10min，12℃保存。pcr产物采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，纯合粳性单株只扩增出850bp条带，杂合粳性单株同时扩增出850bp和550bp条带，纯合糯性植株只扩增出550bp条带。

8株薏苡苗，2株只扩增出850bp条带(编号：44,47)，为粳性纯合体植株；5株同时扩增出扩增出850bp和550bp条带(编号：41,42,43,45,48)为粳性杂合体植株，1株无扩增(编号：46),如图1所示。

(3)根据凝胶电泳分型结果，淘汰5株粳性杂合体植株和1株无扩增植株，保留其余的纯合体单株，在开花期每株选取3个单茎，进行单株套袋并分别做好标记。成熟期收获袋子里的茎节，脱粒保存。

对收获的44,47号薏苡植株套袋里的薏苡仁进行表型检测，采用碘试剂染色法，44,47号薏苡植株的薏苡仁呈现呈现蓝色，为粳性(非糯性)。染色结果验证了本发明提供的pcr引物在鉴定薏苡苗糯性、粳性、粳性杂合体的可靠性。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

序列表

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<110>贵州黔西南喀斯特区域发展研究院

<120>一种薏苡waxy基因突变的pcr检测引物及其应用

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