人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体。

背景技术：

肿瘤坏死因子(tnfα)是一种人体炎症反应相关蛋白，过量的tnfα会导致自身免疫性疾病的发生。研发针对tnfα的抗体将有利于降低体内的tnfα含量，加速其在体内的清除，从而治疗相关自身免疫性疾病。目前已有的针对tnfα的抗体由于在临床使用中易产生抗抗体现象，导致该抗体对部分病人失去治疗效果，因此开发新的针对tnfα的人源单克隆抗体有利于缓解该问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明提供了一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体，其轻链序列如seqno.1所示，其重链序列如seqno.3所示。

上述针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体对应的碱基序列，其轻链序列如seqno.4所示，其重链序列如seqno.5所示。

本发明的有益效果：通过筛选和基因改造后，所获抗体的特异性好、中和活性强、抗聚集性增强，适用于制备针对自身免疫性疾病的治疗性药物。

附图说明

图1-1为tango软件预测fc9抗体氨基酸序列的易聚集区。

图1-2为tango软件预测fc9抗体突变后氨基酸序列的易聚集区。

图1-3为fc0和fc9的重链突变区域比较图。

图2为sds-page对fc9抗体的检测图。

图3为elisa分析fc9抗体与人tnfα的结合图。

图4为fc9抗体降低人tnfα对l929细胞的杀伤效果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：fc0抗体序列的获得

按照已有的文献(zhuz,dimitrovds,methodsmolbiol,2009)构建了人源fab噬菌体展示文库，并基于该文库对人tnfα蛋白进行了四轮的筛选，并通过单克隆phageelisa，将其中的阳性克隆送测序，得到了fc0候选克隆的碱基序列，并经氨基酸翻译软件(https://web.expasy.org/translate/)，得到了其氨基酸序列，轻链氨基酸序列如seqno.1所示，其重链氨基酸序列如seqno.2所示。

实施例2：利用tango软件对获得的fc0氨基酸序列进行优化

利用tango软件(http://tango.crg.es/)对fc0候选克隆的氨基酸序列进行易聚集区预测，发现其中存在较强的易聚集区域，如图1-1，因此对该区域进行点突变，得到fc9抗体，其轻链氨基酸序列如seqno.1所示，其重链氨基酸序列如seqno.3所示，对应碱基序列，轻链如seqno.4所示，重链如seqno.5所示。突变后的氨基酸序列经tango软件重新预测，发现该易聚集区被明显改善，如图1-2，1-3。

实施例3：293f细胞表达fc9抗体并sds-page检测

将突变后的碱基序列克隆到双启动载体pvitro2-neo-mcs(invivogen)上，利用pei转染293f细胞后进行蛋白的表达，经过5-7天的表达，将293f细胞的培养上清经proteina(ge)纯化，将纯化后的蛋白经过浓换液后，得到溶于pbs缓冲液的fc9抗体。经sds-page电泳检测，发现其呈现轻链和重链两条带，如图2所示。

实施例4：elisa分析fc9抗体与人tnfα蛋白的结合

包被人tnfα蛋白在elisa板上，将fc9抗体经梯度稀释后作为一抗，hrp标记的goat-anti-humanigg-fc(abcam)作为二抗，显色后，通过信号强度变化计算ec50，约在0.4nm，如图3所示。

实施例5：fc9抗体降低人tnfα对l929细胞的杀伤。

人tnfα对l929细胞有较强的杀伤作用，用抗体中和掉人tnfα因子可以降低其对细胞的杀伤效果。为验证fc9抗体对人tnfα的中和作用，梯度稀释的fc9抗体分别与人tnfα混合后加入到提前一天铺好的l929细胞中，加完后放置于37℃培养箱培养，24h后弃去培养基上清，加入cck-8试剂显色，根据细胞的存活率就算fc9抗体对人tnfα的中和活性，约为20nm，如图4所示。

sequencelisting

<110>武汉班科生物技术股份有限公司

<120>人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体

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