细胞周期蛋白A1特异性T细胞受体及其用途的制作方法
关于序列表的陈述
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用结合到说明书中。包含序列表的文本文件的名称为360056_460wo_sequence_listing.txt。文本文件为269kb，创建于2019年2月10日，正在通过efs-web电子提交。
背景技术：
涉及离体细胞扩增和输注肿瘤反应性t细胞的过继免疫疗法是一种新兴的治疗方式，特别是在常规治疗失败的患者中(stromnes等，immunol.版本号257:145-64,2014)。在一些情况下，肿瘤反应性t细胞包含对肿瘤特异或在肿瘤上过表达的抗原具有特异性的内源性、外源性和/或工程化的受体。
癌症-睾丸抗原细胞周期蛋白a1(ccna1)是一种替代性的a型细胞周期蛋白，由于其在急性髓细胞白血病(aml)和许多上皮癌(包含睾丸癌、子宫内膜癌和卵巢癌)中过度表达，因此是治疗各种癌症的有吸引力的靶标。细胞周期蛋白a1被认为促进细胞增殖和存活，已被证明在小鼠中是致白血病的，并且在超过50％的aml患者的白血病干细胞中被检测到。
本文提供了鉴定与细胞周期蛋白a1反应的肿瘤反应性t细胞的方法、鉴定对细胞周期蛋白a1特异的t细胞受体(tcr)的方法、以及使用本文描述的方法鉴定的特异性tcr。
附图说明
图1描绘了针对hla-a2限制性表位的细胞周期蛋白a1tcr发现方案。示出了hla-a2前导肽227-235(seqidno：1)、341-351(seqidno：2)和370-379(seqidno：3)在细胞周期蛋白a1蛋白序列(seqidno：4)的位置。
图2示出了用细胞周期蛋白a1重叠肽库刺激cd8+t细胞导致抗原特异性细胞系的产生。
图3a-图3b示出了通过计算单个t细胞克隆的四聚体解离常数(kd)来鉴定高亲和力hla-a2：01/细胞周期蛋白a1tcr。
图4示出了用于分离、鉴定和表达选自高亲和力克隆的高亲和力tcr的示意图。
图5a-图5d示出了hla-a2：01/细胞周期蛋白a1tcr识别肽脉冲靶标并杀死hla匹配的细胞周期蛋白a1+白血病细胞系和原代aml细胞。
图6示出了用于体内安全性测试的顶部hla-a2：01/细胞周期蛋白a1tcr候选物的诱变示意图。
具体实施方式
在某些方面，本公开提供了细胞周期蛋白a1特异性的结合蛋白(例如，t细胞受体(tcr))，其与主要组织相容性复合物(mhc)(例如，人白细胞抗原(hla))有关，用于例如过继免疫疗法来治疗癌症。
在某些实施例中，本文所述的组合物和方法将具有治疗效用，用于治疗与ccna1过表达(例如，以统计学上显著的方式，可检测到的ccna1表达的水平大于在正常或无病的细胞中可检测到的ccna-l的表达水平)相关的疾病和病症。此类疾病包含各种形式的过度增殖性疾病，例如急性髓细胞性白血病。这些和相关用途的非限制性实例在本文中进行了描述，包含体外、离体和体内刺激ccna1抗原特异性t细胞反应，例如通过使用表达对ccna1肽具有特异性的tcr的重组t细胞(例如，fldrflscm(seqidno：1)、sliaaaafcla(seqidno：2)或yslseivpcl(seqidno：3))。
在更详细地阐述本公开之前，提供在本文中使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。贯穿本公开阐述了附加定义。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包含所述范围内的任何整数的值并且在适当的时候包含其分数(例如，整数的十分之一和十分之一)。同样，除非另有说明，否则本文所叙述的与任何物理特征，例如聚合物亚基、尺寸或厚度有关的任何数值范围应理解为包含所叙述的范围内的任何整数。如本文所用，除非另外指出，否则术语“大约”是指所指示的范围、值或结构的±20％。应当理解，本文所用的术语“一个”和“一种”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案之一、两者或它们的任意组合。如本文所用，术语“包括(include)”、“具有”和“包含(comprise)”是同义使用的，这些术语和其变体旨在被解释为非限制性的。
另外，应当理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组，其程度与单独阐述每种化合物或化合物组的程度相同。因此，特定结构或特定取代基的选择在本公开的范围内。
术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，或者限制为实质上不影响要求保护的发明的基本特征的材料或步骤。例如，当结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包含其延伸、删除、突变或其组合(例如，氨基酸或羧基末端或结构域之间的氨基酸)，其共同起作用时贡献结构域、区域、模块或蛋白质的长度的最多20％(例如，15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)，并且基本上不会影响结构域、区域、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶结合亲和力)(即，将活性降低的幅度不超过50％，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)时，蛋白质结构域、区域或模块(例如，结合结构域、铰链区、接头模块)或蛋白质(可以具有一个或多个结构域、区域或模块)“基本上由特定氨基酸序列组成”。
如本文所用，“免疫系统细胞”是指源自骨髓的造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系，即髓系祖细胞(其产生诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴样祖细胞(会产生淋巴样细胞，例如t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性的免疫系统细胞包含cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4-cd8-双重阴性t细胞、gdt细胞、调节性t细胞、天然杀伤细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“apc”，它们是当与肽复合的apc表面上的主要组织相容性复合物(mhc)受体与t细胞表面上的tcr相互作用时可以激活t细胞的专门细胞。
如本文所用，“造血祖干细胞”是指未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限制地繁殖，并且能够分化为其他细胞类型，包括t细胞谱系的细胞。造血干细胞可以为例如但不限于从胎儿肝脏、骨髓、脐带血分离。
如本文所用，“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如免疫系统细胞)的细胞。示例性的造血祖细胞包含具有cd24lolin-cd117+表型或在胸腺中发现的那些(称为祖细胞)。
如本文所用，术语“宿主”是指以异源或外源核酸分子进行遗传修饰以产生目的多肽(例如，高亲和力或增强亲和力的抗ccna-ltcr)的细胞(例如，t细胞)或微生物。在某些实施例中，宿主细胞可任选地具有或被修饰以包含赋予与异源或外源蛋白质的生物合成相关或不相关的所需特性的其他遗传修饰(例如，包含可检测的标记；删除、改变或截短的内源tcr；增加的共刺激因子表达)。在某些实施例中，宿主细胞是用编码ccna-1抗原肽特异的tcrββ、tcrα链或两者的异源或外源核酸分子转导的人造血祖细胞。在某些实施例中，宿主细胞是自体的、同种异体的或同基因的，以使其接受包含编码本发明的结合蛋白的多核苷酸的宿主细胞。
“t细胞”或“t淋巴细胞”是在胸腺中成熟并产生t细胞受体(tcr)的免疫系统细胞，其可以从例如外周血单核细胞(pbmc)中获得(富集或分离)并且在本文中被称为“块(bulk)”t细胞。分离t细胞后，可以在扩增之前或之后将细胞毒性(cd8+)和辅助(cd4+)t细胞分为幼稚t细胞亚群、记忆t细胞亚群和效应t细胞亚群。t细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；与tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd3、cd127和cd45ra的表达增加，而cd45ro的表达减少)，记忆t细胞(tm)(经历过抗原性和长寿的)和效应细胞(经历过抗原的和有细胞毒性的)。tm可以进一步分为中央记忆t细胞(与幼稚t细胞相比，tcm、cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95的表达增加，而cd54ra的表达减少)和效应记忆t细胞(tem，与幼稚t细胞或tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra的表达减少，而cd127的表达增加)。效应t细胞(te)是指经历过抗原的cd8+细胞毒性t淋巴细胞，与tcm相比，其cd62l、ccr7、cd28的表达降低，并且颗粒酶和穿孔素呈阳性。辅助t细胞(th)为cd4+细胞，其通过释放细胞因子来影响其他免疫细胞的活性。cd4+t细胞可以激活和抑制适应性免疫应答，而诱导哪种作用将取决于其他细胞和信号的存在。可以根据已知技术收集t细胞，并且可以通过已知技术，例如通过与抗体的亲和力结合、流式细胞术或免疫磁选择来富集和耗尽各种亚群及其组合。其他示例性t细胞包含调节性t细胞，例如cd4+cd25+(foxp3+)调节性t细胞和treg17细胞，以及tr1、th3、cd8+cd28+和qa-1限制性t细胞。
“t细胞受体”(tcr)是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变的结合结构域、恒定结构域、跨膜区域和短的细胞质尾巴；参见，例如，janewayelal.,immunobiology:theimmunesysteminhealthanddisease,3rded.,currentbiologypublications,p.4:33,1997)，其能够特异性结合与mhc受体结合的抗原肽。tcr可以发现在细胞表面或呈可溶性形式，通常由具有阿α和β链(分别称为tcrα和tcrβ)或γ链和δ链(也称为tcrγ和tcrδ)的异二聚体组成。与免疫球蛋白一样，tcr链的细胞外部分(例如，α链、β链)包含两个免疫球蛋白结构域、位于n端的可变结构域(例如，α链可变结构域或vα，β链可变结构域或vβ；通常基于kabat编号的氨基酸1至116，rabatetal.,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,usdept.healthandhumanservices,publichealthservicenationalinstitutesofhealth,1991,5thed.)和与细胞膜相邻的一个恒定域(例如，α链恒定域或cα，通常是基于rabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或cβ，通常是基于rabat的氨基酸117至295)。同样与免疫球蛋白类似，可变结构域包含由构架区(fr)隔开的互补决定区(cdr)(joresetal.,proc.nat’lacad.sci.u.s.a.87:9138,1990；chothiaetal.,emboj.7:3745,1988；也参见lefrancetal.,dev.comp.immunol.27:55,2003)。在某些实施例中，tcr在t细胞(或t淋巴细胞)的表面上发现并与cd3复合物缔合。如本公开中使用的tcr的来源可以来自各种动物物种，诸如人、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳动物。
术语“可变区”或“可变结构域”是指和tcr与抗原的结合相关的tcrα链或β链(或γδtcr的γ链和δ链)的结构域。幼稚tcr的α链和β链(分别为vα和vβ)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(fr)和三个cdr。vα结构域由两个独立的dna片段(可变基因片段和连接基因片段(v-j))编码；vβ结构域由三个独立的dna片段(可变基因片段、多样性基因片段和连接基因片段(v-d-j))编码。
与“高变区”或“hvr”同义的术语“互补决定区”和“cdr”在本领域中已知是指赋予抗原特异性和/或结合亲和力的tcr可变区内的氨基酸的非连续序列。通常，在每个α链可变区(αcdr1、αcdr2、αcdr3)中存在三个cdr，在每个β链可变区(βcdr1、βcdr2、βcdr3)中存在三个cdr。cdr3被认为是负责识别经处理抗原的主要cdr。cdr1和cdr2主要与mhc相互作用。但是，也已示出α链和β链的cdr1环分别与抗原肽的n末端和c末端相互作用，并且可能有助于肽特异性和mhc结合。
如本文所用，“tcr复合物”是指通过cd3与tcr的缔合形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrα链和tcrβ链组成。或者，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrγ链和tcrδ链组成。
如本文所用、“tcr复合物的组分”是指tcr链(即tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ)、cd3链(即cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)或由两条或更多条tcr链或cd3链(例如tcrα和tcrβ的复合体、tcrγ和tcrδ的复合体、cd3e和cd3δ的复合体、cd3γ和cd3ε的复合体或tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合体)。
如本文所用，“抗原”或“ag”是指引起免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生、特定免疫学上具有活性的细胞(例如，t细胞)的激活或两者。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见，抗原可以合成，重组产生或衍生自生物学样品。可以包含一种或多种抗原的示例性生物样品包含组织样品、肿瘤样品、细胞、生物液或其组合。抗原可以由经过修饰或基因工程表达抗原的细胞产生。示例性抗原包含ccna-1。
术语“表位”或“抗原表位”包含被关联结合分子识别并特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇，例如免疫球蛋白、t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体、或其他结合分子、结构域或蛋白质。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，ccna-1蛋白或其片段可以是包含一个或多个抗原表位的抗原。
“主要组织相容性复合物”(mhc)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。mhci类分子是异质二聚体，其具有跨链的膜(具有三个α结构域)和非共价结合的β2微球蛋白。mhcii类分子由两个跨膜糖蛋白α和β组成，两者都跨膜。每个链都有两个结构域。mhci类分子将起源于细胞液的肽传递到细胞表面，在该细胞表面，肽：mhc复合物被cd8+t细胞识别出。mhcii类分子将起源于囊泡系统的肽传递到细胞表面，在该细胞表面，它们被cd4+t细胞识别。人mhc被称为人白细胞抗原(hla)。
如本文所用，“结合结构域”(也称为“结合区”或“结合部分”)是指具有以下能力的分子或其部分(例如，肽、寡肽、多肽、蛋白质)：特异性地且非共价地与靶标(例如，ccna-1、ccna-1肽：mhc复合物)缔合、联合或结合。结合结构域包含用于生物分子、分子复合物(即，包含两个或更多个生物分子的复合物)或其他目的靶标的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合伴侣。示例性结合域包含单链免疫球蛋白可变区(例如sctcr、scfv)、受体胞外域、配体(例如细胞因子、趋化因子)或合成多肽，它们由于其与生物分子、分子复合物或其他目标靶标结合的特异性能力而被选出。
如本文所用，“特异性结合”或“特异性地”是指结合蛋白(例如，tcr受体)或结合结构域(或其融合蛋白)与靶分子(例如，ccna-1肽)的缔合或结合。hla或四聚体(例如hla络合物)，其亲和力或ka(即具有1/m单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)等于或大于105m-1(等于-缔合反应的解离速率[konff]至解离速率[k0ff]，而不会与样品中的任何其他分子或组分显著缔合或结合。结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)可分类为“高亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合蛋白或结合结构域是指ka至少为107m-1，至少108m-1，至少109m-1，至少1010m-1，至少1011m-1的那些结合蛋白或结合结构域。，至少1012m-1或至少1013m-1。“低亲和力”结合蛋白或结合结构域是指ka最高为107m-1，最高为106m-1，最高为105m-1的那些结合蛋白或结合结构域。或者，亲和力可以定义为与m单元(例如105m-1至1013m-1)的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)。
在某些实施例中，受体或结合结构域可具有“增强的亲和力”，这是指与野生型(或亲本)结合结构域相比对靶抗原具有更强结合的选择或工程化的受体或结合结构域。例如，增强的亲和力可能是由于对靶抗原的ka(平衡缔合常数)高于野生型结合域，是由于对靶抗原的kd(解离常数)小于野生型结合域，或是由于靶抗原的解离速率(koff)小于野生型结合域的解离速率(koff)，或它们的组合。在某些实施例中，增强的亲和力tcr可以被密码子优化以增强在特定宿主细胞例如t细胞中的表达(scholten等，clin.immunol.119：135，2006)。
已知多种测定法用于鉴定与特定靶标特异性结合的本发明的结合域，以及测定结合域或结合蛋白亲和力，例如蛋白质印迹、elisa、分析超速离心、光谱法、表面等离振子共振
术语“ccna-1特异性结合蛋白”是指与ccna-1或其肽或片段特异性结合的蛋白或多肽。在一些实施例中，蛋白质或多肽以或至少以大约某个特定亲和力结合于例如细胞表面上ccna-1或其肽，例如与mhc或hla分子复合的ccna-1肽。在某些实施例中，ccna-1特异性结合蛋白以kd或以亲和力结合ccna-1衍生的肽：hla复合物(或ccna-1衍生的肽：mhc复合物)，kd小于约10-8m、小于约10-9m、小于约10-10m、小于约10-11m、小于约10-12m或小于约10-13m，该亲和力约等于、至少约等于例如通过相同的测定法测定的或大于或等于本文提供的示例性ccna-1特异性结合蛋白(例如本文提供的任何ccna-1特异性tcr)所表现出的亲和力。在某些实施例中，ccna-1特异性结合蛋白包含ccna-1特异性免疫球蛋白超家族结合蛋白或其结合部分。
评估亲和力或表观亲和力或相对亲和力的测定法是已知的。在某些实例中，通过评估与各种浓度的四聚体的结合来测量对tcr的表观亲和力，例如，通过使用标记的四聚体的流式细胞术。在某些实例中，tcr的表观kd使用标记的四聚体在一定浓度范围内的2倍稀释度进行测量，然后通过非线性回归确定结合曲线，表观kd被确定为产生最大半结合的配体的浓度。
术语“ccna-1结合结构域”或“ccna-1结合片段”是指负责特异性ccna-1结合的ccna-1特异性结合蛋白的结构域或部分。单独的ccna-1特异性结合域(即，没有ccna-1特异性结合蛋白的任何其他部分)可以是可溶的，并且可以以kd与ccna-1结合，kd小于约10-8m、小于约10-9m、小于约10-10m、小于约10-11m、小于约10-12m或小于约10-13m。示例性ccna-1特异性结合域包括ccna-1特异性sctcr(例如单链αβtcr蛋白，例如vα-l-vβ、vβ-l-vα、vα-cα-l-vβ或vαl-vβ-cβ，其中vα和vβ分别是tcrα和β可变结构域，cα和cβ分别是tcrα和β恒定结构域，并且l是本文所述的接头和scfv片段，其可以衍生自抗ccna-1tcr或抗体。
抗原呈递细胞(apc)(例如树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或其他细胞类型)进行抗原加工的原理，以及apc向t细胞呈递抗原的原理，包括主要的组织相容性复合物(mhc)在免疫相容性apc和t细胞之间的受限呈递(例如，至少共享与抗原呈递相关的mhc基因的一种等位基因形式)已经建立(参见例如murphy，janeway'simmunobiology(8thed。)2011garlandscience，ny；第6、9和16章)。例如，起源于细胞质的加工抗原肽(例如肿瘤抗原、细胞内病原体)的长度通常为约7个氨基酸至约11个氨基酸，并将与i类mhc分子缔合，而在囊泡系统中加工的肽(例如细菌，病毒)的长度将在约10个氨基酸至约25个氨基酸之间变化并且与ii类mhc分子缔合。
“细胞周期蛋白a1”或“ccna-1”是指属于细胞周期蛋白家族的蛋白，其参与雄性生殖系减数分裂细胞周期的细胞周期控制。细胞周期蛋白a1在睾丸以外的正常组织中最少表达，在许多癌症中过表达，包括急性髓细胞性白血病(aml)和许多上皮癌，包括睾丸癌，子宫内膜癌和卵巢癌。在某些实施例中，ccna1指蛋白质的同工型3，其与同工型1的区别在于氨基酸1-44缺失。在一个特定的实施例中，ccna1包含seqidno：4所示的氨基酸序列。
“ccna-1抗原”或“ccna-1肽抗原”是指ccna-1蛋白的天然或合成产生的部分，其长度为约7个氨基酸至约15个氨基酸，其可以与mhc(例如，hla)分子形成复合物并且这种复合物可以与对ccna-1肽：mhc(例如，hla)复合物具有特异性的tcr结合。ccna-1抗原肽在i类mhc的背景下呈现。在特定实施例中，ccna-1肽是fldrflscm(seqidno：1)、sliaaaafcla(seqidno：2)或yslseivpcl(seqidno：3)，其与人i类hla缔合，并且更具体地，与等位基因hla-a*02：0l缔合。
“接头”是指连接两个蛋白质、多肽、肽、结构域、区域或基序的氨基酸序列，并且可以提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔子功能，从而使得所得的多肽保留特异性结合。对靶分子的亲和力(例如，sctcr)或保留信号传导活性(例如，tcr复合物)。在某些实施例中，接头包含例如约2至约35个氨基酸、或约4至约20个氨基酸或约8至约15个氨基酸或约15至约25个氨基酸。
“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指多肽的两个相邻基序，区域或结构域之间的一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸残基，例如在结合结构域和相邻常数之间。结构域或tcr链和相邻的自我切割肽之间。连接氨基酸可以由结合蛋白的构建体设计产生(例如，在编码结合蛋白的核酸分子的构建过程中使用限制酶位点产生的氨基酸残基)。
“改变的结构域”或“改变的蛋白质”是指基序、区域、结构域、肽、多肽或蛋白质，其与野生型基序、区域、域、肽、多肽或蛋白质(例如，野生型tcrα链、tcr链、tcrα恒定域、tcrβ恒定域)至少为85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％)的同一性。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”是指例如通过聚合酶链反应(pcr)或dna产生的脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、寡核苷酸、多核苷酸、其片段中的任何一种。通过体外转录，以及通过连接、切割、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用产生的片段。在某些实施例中，本公开的核酸通过pcr产生。核酸可以由天然存在的核苷酸的单体(例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或两者的组合组成。修饰的核苷酸可以对糖部分、嘧啶或嘌呤碱基部分进行修饰或替代。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸分子可以是单链或双链的。
术语“分离的”是指将材料从其原始环境(例如，如果是天然存在的自然环境)中除去。例如，没有分离出存在于活体动物中的天然存在的核酸或多肽，而是分离了与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同核酸或多肽。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且仍然被分离，因为这样的载体或组合物不是天然环境核酸或多肽的一部分。术语“基因”是指与产生多肽链有关的dna片段；它包括编码区之前和之后的区域(“前导区和尾区”)以及各个编码段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如细菌载体、病毒载体)中或可以整合到基因组中。
“载体”是能够转运另一种核酸的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、rna载体或线性或环状dna或rna分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成或合成核酸分子。示例性载体是那些能够自主复制的载体(附加载体)或表达与其连接的核酸分子的载体(表达载体)。
“逆转录病毒”是具有rna基因组的病毒。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的属。γ逆转录病毒的例子包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮病病毒。
“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个例子包括hiv(人类免疫缺陷病毒：包括1型和2型hiv)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。
如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于hiv的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的、具有相对大的包装能力、并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在三个(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬时转染到生产细胞后产生的。像hiv一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒rna进行逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合体介导。逆转录产物是双链线性病毒dna，它是病毒整合到感染细胞dna中的底物。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(即，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。“未连锁”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密关联，并且其中一个的功能不影响另一个。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任意组合。
如本文所用，“表达载体”是指包含核酸分子的dna构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选操纵子序列，编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化为合适的宿主，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。
在将核酸分子插入细胞中的上下文中的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子掺入真核或原核细胞中，其中核酸分子可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)中、转化为自主复制子、或瞬时表达(例如，转染的mrna)。
如本文所用，“异源”核酸分子，构建体或序列是指不是宿主细胞天然的但可以与核酸分子或核酸的一部分同源的核酸分子或核酸分子的一部分。来自宿主细胞的酸性分子。异源核酸分子、构建体或序列的来源可以来自不同的属或种。在某些实施例中，通过例如缀合、转化、转染、转导、电穿孔等将异源核酸分子添加至宿主细胞或宿主基因组(即，不是内源的或天然的)，其中添加的分子可以整合入宿主基因组或作为染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其他形式的自我复制载体)，并可以多拷贝形式存在。另外，“异源”是指由导入宿主细胞的非内源性核酸分子编码的非天然酶、蛋白质或其他活性，即使宿主细胞编码同源蛋白质或活性也是如此。
术语“同源的”或“同源”是指在宿主细胞，物种或菌株中发现或衍生自宿主细胞、物种或菌株的分子或活性。例如，异源分子或编码该分子的基因可以分别与天然宿主或宿主细胞分子或编码该分子的基因同源，并且可以任选地具有改变的结构、序列、表达水平或其组合。
如本文所用，术语“内源的”或“幼稚”是指通常存在于宿主或宿主细胞中的基因、蛋白质、化合物、分子或活性。此外，与亲本基因、蛋白质或活性相比，突变、过度表达、改组、复制或以其他方式改变的基因、蛋白质或活性仍被认为是该特定宿主细胞的内源性或天然性。例如，来自第一基因的内源控制序列(例如，启动子、翻译衰减序列)可用于改变或调节第二天然基因或核酸分子的表达，其中第二天然基因的表达或调控或核酸分子不同于亲代细胞中的正常表达或调控。
如本文所用，术语“工程化的”、“重组的”、“修饰的”或“非天然的”是指已通过引入异源核酸分子而被修饰的生物、微生物、细胞、核酸分子或载体，或指通过人为干预进行了基因工程改造的细胞或微生物，即通过引入异源核酸分子进行修饰的细胞或微生物，或指经过改变使得内源核酸分子或基因是受控的、失控的或组成型的，其中这种改变或修饰可以通过基因工程引入。人类产生的遗传改变可以包括，例如，引入核酸分子的修饰(其可以包括表达控制元件，例如启动子)，所述核酸分子编码一种或多种蛋白质，结合蛋白或酶，或其他核酸分子的添加，缺失细胞遗传物质的替代，替代或其他功能破坏或增加。示例性修饰包括来自参考或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的修饰。其他示例性修饰包括例如非编码调控区中的修饰，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。
如本文所用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列变化。突变可导致几种不同类型的序列变化，包括核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失。
在本领域中，“保守取代”被认为是一个氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸取代。示例性的保守取代是本领域众所周知的(参见，例如，wo97/09433，第10页；lehninger，生物化学，第二版；worthpublishers，inc.ny，ny，第71-77页，1975；lewin，genesiv，纽约牛津大学出版社，细胞出版社，马萨诸塞州剑桥，1990年第8页)。
如本文所用，“序列同一性”是指在比对序列并引入缺口以达到最大百分比序列后，一个序列中与另一参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。同一性，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。序列同一性百分比值可以使用altschul等人定义的ncbiblast2.0软件生成，如由altschuletal.(1997),nucl.acidsres.25:3389-3402所限定的，其中参数设置为默认值。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指与正常或未患病的细胞相比过度生长或增殖。示例性的过度增殖性疾病包括肿瘤、癌症、血液系统恶性肿瘤、赘生性组织、癌、肉瘤、恶性细胞、恶性前细胞、以及非肿瘤性或非恶性过度增殖性疾病(例如、腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、血管瘤、纤维化、再狭窄以及自身免疫性疾病、例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、炎症性肠病等)。在某些实施例中，过度增殖性疾病是急性骨髓性白血病。
“过继细胞免疫疗法”或“过继免疫疗法”是指施用天然存在或基因工程的疾病抗原特异性免疫细胞(例如，t细胞)。过继细胞免疫疗法可以是自体的(免疫细胞来自受体)、同种异体的(免疫细胞来自相同物种的供体)或同基因的(免疫细胞来自与受体基因上相同的供体)。
“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“改善”是指对受试者(例如人类或非人类哺乳动物，例如灵长类、马、狗、小鼠、大鼠)的疾病、病症或病状的医学管理。通常，以足以引起治疗或预防益处的量施用包含表达本公开内容的ccna1特异性结合蛋白的宿主细胞的合适剂量或治疗方案。治疗或预防/预防益处包括改善临床预后；减轻或减轻与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；更长的无病状态；疾病程度的减少，疾病状态的稳定；疾病进展延迟；缓解；生存；延长生存期或其任意组合。
表达本公开内容的结合蛋白或细胞的“治疗有效量”或“有效量”是指足以在统计上改善所治疗疾病的一种或多种症状的化合物或细胞的量。重要的方式。当涉及单独施用的单个活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效剂量是指该成分或单独表达该成分的细胞的作用。当提及组合时，治疗有效剂量是指活性成分或辅助活性成分与表达导致治疗效果的细胞的组合的组合量，无论是连续施用还是同时施用。另一种组合可以是表达一种以上活性成分的细胞，例如两种不同的结合蛋白或其他相关治疗剂。
ccna-1特异性结合蛋白
细胞周期蛋白a1是指由ccna1基因编码的蛋白质。ccna1是细胞周期蛋白家族的成员，其表达通常限于睾丸，在睾丸中它参与调节精子发生。ccna1在白血病细胞和其他恶性肿瘤中高表达，并可能促进细胞增殖和存活。已知ccna1蛋白的几种肽是与肿瘤相关的抗原肽，它们是hlaa*02：0l限制性抗原。由于这些特性，ccna1蛋白是临床开发的诱人靶标。
在某些方面，本公开提供特异性结合ccna1肽fldrflscm(seqidno：1)、ccna1肽sliaaaafcla(seqidno：2)或ccna1肽yslseivpcl(seqidno：3)的结合蛋白(例如，免疫球蛋白超家族结合蛋白或其部分)。
一方面，本公开提供了结合蛋白(例如免疫球蛋白超家族结合蛋白或其部分)，其包含：(a)t细胞受体(tcr)α链可变(vα)域，其包含seqidno：5、7、9、11、13、15、15、17和19中任何一个所示的互补决定区3(cdr3)氨基酸序列或seqidno：5、7、9、11、13、15、17和19中任何一个所示的且具有最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失的cdr3氨基酸序列，以及tcrβ链可变(vβ)域；(b)tcrvα结构域和tcrvβ结构域，tcrvβ包含seqidno：6、8、10、12、14、16、16、18、20和189中任一项所示的cdr3氨基酸序列，或seqidno：6、8、10、12、14、16、18、20和189中任一项所述的且具有最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失cdr3氨基酸序列；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构域，其中结合蛋白能够特异性结合人细胞周期蛋白a1(ccna1)肽227-235fldrflscm(seqidno：1)：人白细胞抗原(hla)复合物。
在某些实施例中，(a)vα结构域包含seqidno：5的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：6的cdr3氨基酸序列；(b)vα结构域包含seqidno：7的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：8的cdr3氨基酸序列；(c)vα结构域包含seqidno：9的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：10的cdr3氨基酸序列；(d)vα结构域包含seqidno：11的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：12的cdr3氨基酸序列；(e)vα结构域包含seqidno：13的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：14的cdr3氨基酸序列；(f)vα结构域包含seqidno：15的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：16的cdr3氨基酸序列；(g)vα结构域包含seqidno：17的cdr3氨基酸序列，vβ结构域包含seqidno：18的cdr3氨基酸序列；(h)vα结构域包含seqidno：19的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：20的cdr3氨基酸序列；或(i)vα结构域包含seqidno：7的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：189的cdr3氨基酸序列。
一方面，本公开提供了结合蛋白(例如，免疫球蛋白超家族结合蛋白或其部分)，其包括：(a)t细胞受体(tcr)α链可变(vα)结构域以及tcrβ链可变(vβ)结构域，vα结构域包含seqidno：89、97、105、113、119、127、133和137中任一个的互补决定区3(cdr3)氨基酸序列，或seqidno：89、97、105、113、119、127、133和137中任一个所示且具有多达五个氨基酸取代、插入和/或缺失的cdr3氨基酸序列；(b)tcrvα结构域和tcrvβ结构域，vβ结构域包含seqidno：93、101、109、117、123、129、140和190中任一个所示的cdr3氨基酸序列，或seqidno：93、101、109、117、123、129、140和190中任一个所示且具有多达五个氨基酸取代、插入和/或缺失的cdr3氨基酸序列；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构域，其中结合蛋白能够特异性结合人细胞周期蛋白a1(ccna1)肽227-235fldrflscm(seqidno：1)：人白细胞抗原(hla)复合物。
在某些实施例中，(a)vα结构域包含seqidno：89的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：93的cdr3氨基酸序列；(b)vα结构域包含seqidno：97的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：101的cdr3氨基酸序列；(c)vα结构域包含seqidno：105的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：109的cdr3氨基酸序列；(d)vα结构域包含seqidno：113的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：117的cdr3氨基酸序列；(e)vα结构域包含seqidno：119的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：123的cdr3氨基酸序列；(f)vα结构域包含seqidno：127的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：129的cdr3氨基酸序列；(g)vα结构域包含seqidno：133的cdr3氨基酸序列，vβ结构域包含seqidno：129的cdr3氨基酸序列；(h)vα结构域包含seqidno：137的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：140的cdr3氨基酸序列；(i)vα结构域包含seqidno：97的cdr3氨基酸序列，而vβ结构域包含seqidno：190的cdr3氨基酸序列。
肽-mhc复合物，例如ccna1肽：mhc复合物，可被tcrvα和tcrvβ结构域识别并结合。在淋巴细胞发育过程中，vα外显子由不同的可变和连接基因区段(v-j)组装而成，vβ外显子由不同的可变的多样性和连接基因区段(v-d-j)组装而成。tcrα染色体基因座具有70-80个可变基因区段和61个连接基因区段。tcrβ染色体基因座具有52个可变基因区段，并且两个单独的簇包含单个多样性基因区段，以及六个或七个连接基因区段。功能性vα和vβ基因外显子是通过可变基因区段与vα的连接基因区段以及可变基因区段与vβ的多样性基因区段和连接基因区段的重组产生的。
vα和vβ结构域各自包含三个高变环，也称为接触肽-mhc复合物的互补决定区(cdr)。cdr1和cdr2编码在可变基因区段内，而cdr3通过跨越vα的可变和连接区段的区域编码或者通过跨院vβ的可变的多样性和连接区段的区域编码。因此，如果已知vα或vβ的可变基因区段的身份，则可以推导其相应的cdr1和cdr2的序列。与cdr1和cdr2相比，由于重组过程中核苷酸的添加和丢失，cdr3的多样性大大提高。
tcr可变结构域序列可以与编号方案(国际免疫遗传学信息系统(imgt)和aho)对齐，从而可以使用抗原受体编号和受体分类(anarci)软件工具对等效残基位置进行注释并比较不同的分子(2016，bioinformatics15：298-300)。编号方案提供了tcr可变结构域中框架区和cdr的标准化描述。
表1提供了包含cdr3的tcrvα的可变基因区段和连接基因区段的身份，该cdr3包含seqidno：5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的任一个所示的氨基酸序列，以及包含cdr3的tcrvβ的可变基因区段和连接基因区段的身份，该cdr3包含seqidno：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和189的任一个所示的氨基酸序列。因此，可以从相应的可变基因片段推导vα和vβ结构域的cdr1和cdr2序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv9*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav30*01基因编码的cdr1氨基酸序列；(b)vβ结构域包含由trbv2*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav10*01基因编码的cdr1氨基酸序列；(c)vβ结构域包含由trbv6-6*01基因编码的cdr1氨基酸序列；二vα结构域包含trav24*01基因编码的cdr1氨基酸序列；(d)vβ结构域包含由trbv5-6*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav21*01基因编码的cdr1氨基酸序列；(e)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav2l*02基因编码的cdr1氨基酸序列；(f)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含travl2-2*02基因编码的cdr1氨基酸序列；(g)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav17*01基因编码的cdr1氨基酸序列；(h)vβ结构域包含由trbv7-2*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav17*01基因编码的cdr1氨基酸序列；或者(i)vβ结构域包含由trbvi0-2*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav10*01基因编码的cdr1氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：91的cdr1氨基酸序列，并且vα结构域包含seqidno：87的cdr1氨基酸序列；(b)vβ结构域包含seqidno：99的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：95的cdr1氨基酸序列；(c)vβ结构域包含seqidno：107的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：103的cdr1氨基酸序列；(d)vβ结构域包含seqidno：115的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：111的cdr1氨基酸序列；(e)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：111的cdr1氨基酸序列；(f)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：125的cdr1氨基酸序列；(g)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：131的cdr1氨基酸序列；(h)vβ结构域包含seqidno：167的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：95的cdr1氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv9*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav30*01基因编码的cdr2氨基酸序列；(b)vβ结构域包含由trbv2*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav10*01基因编码的cdr2氨基酸序列；(c)vβ结构域包含由trbv6-6*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav24*01基因编码的cdr2氨基酸序列；(d)vβ结构域包含由trbv5-6*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav21*01基因编码的cdr2氨基酸序列；(e)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav2l*02基因编码的cdr2氨基酸序列；(f)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav12-2*02基因编码的cdr2氨基酸序列；(g)vβ结构域包含由trbv7-3*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav17*01基因编码的cdr2氨基酸序列；(h)vβ结构域包含由trbv7-2*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav17*01基因编码的cdr2氨基酸序列；或者(i)vβ结构域包含由trbv10-2*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含trav10*01基因编码的cdr2氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：92的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：88的cdr2氨基酸序列；(b)vβ结构域包含seqidno：100的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：96的cdr2氨基酸序列；(c)vβ结构域包含seqidno：108的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：104的cdr2氨基酸序列；(d)vβ结构域包含seqidno：116的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：112的cdr2氨基酸序列；(e)vβ结构域包含seqidno：122的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：112的cdr2氨基酸序列；(f)vβ结构域包含seqidno：122的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：126的cdr2氨基酸序列；(g)vβ结构域包含seqidno：122的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：132的cdr2氨基酸序列；(h)vβ结构域包含seqidno：129的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：132的cdr2氨基酸序列；或(i)vβ结构域包含seqidno：168的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：96的cdr2氨基酸序列。
因此，在某些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：6或93的cdr3氨基酸序列以及由trbv9*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：5或89的cdr3氨基酸序列和trav30*0l基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(b)vβ结构域包含seqidno：8或190的cdr3氨基酸序列和由trbv2*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：7或97的cdr3氨基酸序列和trav10*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(c)vβ结构域包含seqidno：10或109的cdr3氨基酸序列以及由trbv6-6*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：9或105的cdr3氨基酸序列以及trav24*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(d)vβ结构域包含seqidno：12或117的cdr3氨基酸序列和由trbv5-6*0l基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：11或113的cdr3氨基酸序列以及trav2l*0l基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(e)vβ结构域包含seqidno：14或123的cdr3氨基酸序列以及由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：13或119的cdr3氨基酸序列以及trav2l*02基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(f)vβ结构域包含seqidno：16或129的cdr3氨基酸序列以及由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：15或127的cdr3氨基酸序列以及trav12-2*02基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(g)vβ结构域包含seqidno：18或129的cdr3氨基酸序列以及由trbv7-3*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：17或133的cdr3氨基酸序列以及trav17*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(h)vβ结构域包含seqidno：20或140的cdr3氨基酸序列以及由trbv7-2*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：19或137的cdr3氨基酸序列和trav17*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；或者(i)vβ结构域包含seqidno：189或101的cdr3氨基酸序列和由trbv10-2*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：7或97的cdr3氨基酸序列和trav10*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列。
在某些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：91的cdr1氨基酸序列，seqidno：92的cdr2氨基酸序列和seqidno：6或93的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：87的cdr1氨基酸序列，seqidno：88的cdr2氨基酸序列和seqidno：5或89的cdr3氨基酸序列；(b)vβ结构域包含seqidno：99的cdr1氨基酸序列，seqidno：100的cdr2氨基酸序列和seqidno：189或101的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：95的cdr1氨基酸序列，seqidno：96的cdr2氨基酸序列和seqidno：7或97的cdr3氨基酸序列；(c)vβ结构域包含seqidno：107的cdr1氨基酸序列，seqidno：108的cdr2氨基酸序列和seqidno：10或109的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：103的cdr1氨基酸序列，seqidno：104的cdr2氨基酸序列和seqidno：9或105的cdr3氨基酸序列；(d)vβ结构域包含seqidno：115的cdr1氨基酸序列，seqidno：116的cdr2氨基酸序列和seqidno：12或117的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：111的cdr1氨基酸序列，seqidno：112的cdr2氨基酸序列和seqidno：11或113的cdr3氨基酸序列；(e)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，seqidno：122的cdr2氨基酸序列和seqidno：14或123的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：111的cdr1氨基酸序列，seqidno：112的cdr2氨基酸序列和seqidno：13或119的cdr3氨基酸序列；(f)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，seqidno：122的cdr2氨基酸序列和seqidno：16或129的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：125的cdr1氨基酸序列，seqidno：126的cdr2氨基酸序列和seqidno：15或127的cdr3氨基酸序列；(g)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，seqidno：122的cdr2氨基酸序列和seqidno：18或129的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：131的cdr1氨基酸序列，seqidno：132的cdr2氨基酸序列和seqidno：17或133的cdr3氨基酸序列；(h)vβ结构域包含seqidno：121的cdr1氨基酸序列，seqidno：139的cdr2氨基酸序列和seqidno：20或140的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：131的cdr1氨基酸序列，seqidno：132的cdr2氨基酸序列和seqidno：19或137的cdr3氨基酸序列；或(i)vβ结构域包含seqidno：167的cdr1氨基酸序列，seqidno：168的cdr2氨基酸序列和seqidno：8或190的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：95的cdr1氨基酸序列，seqidno：96的cdr2氨基酸序列和seqidno：7或97的cdr3氨基酸序列。
在某些实施例中，结合蛋白包含：(a)与seqidno：36、38、40、42、44、86、49、51、53、57、59、63、65、67、81和83中任何一个所含的vα氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vα结构域；(b)与seqidno：36、38、40、42、46、86、49、51、55、57、61、63、67、81和83中任何一个所含的vβ氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vβ结构域；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ；其中至少三个或四个cdr没有突变，而具有突变的cdr具有三个或更少的氨基酸取代、插入和/或缺失。此类变体vα和vβ可用于本文所述的结合蛋白中，条件是结合蛋白保留或基本上保留特异性结合ccna1肽(seqidno：1)：hla复合物的能力。
在其他实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含或由seqidno：36、38、40、42、44、44、86、49、51、53、57、59、63、65、67、81、83、162、165、170、172、174、176、178、180和186中任一个所包含的vα氨基酸序列组成；(b)vβ结构域，其包含或由seqidno：36、38、40、42、46、86、49、51、55、57、61、63、67、81、83、162、165、170、172、174、176、178、180和186中任一个的vβ氨基酸组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。
在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)与seqidno：90、98、106、114、120、128、134和138中任一个的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vα结构域；(b)与seqidno：94、102、110、118、124、130、136、141和166中任一个的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vβ结构域；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构域，其中至少三个或四个cdr没有突变，而具有突变的cdr具有三个或更少的氨基酸取代、插入和/或缺失。此类变体vα和vβ可用于本文所述的结合蛋白中，条件是结合蛋白保留或基本上保留特异性结合ccna1肽(seqidno：1)：hla复合物的能力。
在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含或由seqidno：90、98、106、114、120、128，134和138中任一个的氨基酸序列组成；或(b)vβ结构域，其包含或由seqidno：94、102、110、118、124、130、136、141和166中任一个的vβ氨基酸序列组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。
示例性的结合蛋白包括：(a)包含seqidno：36中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：36中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(b)包含seqidno：38中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：38中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(c)包含seqidno：40中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：40中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(d)包含seqidno：42中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：42中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(e)包含seqidno：44中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：46中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(f)包含seqidno：86中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：86中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(g)包含seqidno：49中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：49中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(h)包含seqidno：51中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：51中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(i)包含seqidno：53中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：55中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(j)包含seqidno：57中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：57中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(k)包含seqidno：59中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：6l中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(l)包含seqidno：63中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：63中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(m)包含seqidno：65中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：67中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(n)包含seqidno：67中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：67中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(o)包含seqidno：81的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：81的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(p)包含seqidno：83中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：83中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(q)包含seqidno：162中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：162中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(r)包含seqidno：165中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：165中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(s)包含seqidno：170中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：170中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(t)包含seqidno：172中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：172中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(u)包含seqidno：174中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：174中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(v)包含seqidno：176中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：176中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(w)包含seqidno：178中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：178中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(x)包含seqidno：180中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：180中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；或(y)包含seqidno：186中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：186中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域。
示例性结合蛋白包括：(a)包含seqidno：90的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：94的氨基酸序列的vβ结构域；(b)包含seqidno：98的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：102的氨基酸序列的vβ结构域；(c)包含seqidno：106的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：110的氨基酸序列的vβ结构域；(d)包含seqidno：114的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：118的氨基酸序列的vβ结构域；(e)包含seqidno：120的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：124的氨基酸序列的vβ结构域；(f)包含seqidno：128的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：130的氨基酸序列的vβ结构域；(g)包含seqidno：134的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：136的氨基酸序列的vβ结构域；(h)包含seqidno：138的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：141的氨基酸序列的vβ结构域；或(i)具有氨基酸序列seqidno：98的vα结构域和具有氨基酸序列seqidno：166的vβ结构域。
在另一方面，本公开提供了结合蛋白(例如，免疫球蛋白超家族结合蛋白或其部分)，其包含：(a)t细胞受体(tcr)α链可变(vα)结构域，其包含互补决定区3(cdr3)seqidno：2l或143中列出的氨基酸序列，或seqidno：2l或143中列出的cdr3氨基酸序列，具有最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失以及tcrβ链变量(vβ)域；(b)tcrvα结构域和tcrvβ结构域，其包含seqidno：22或147所示的cdr3氨基酸序列或seqidno：22或147所示的cdr3氨基酸序列，且具有最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构域，其中结合蛋白能够与人细胞周期蛋白a1(ccna1)肽341-351sliaaaafcla(seqidno：2)：人特异性结合白细胞抗原(hla)复合物。在特定实施例中，vα结构域包含seqidno：21或143的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：22或147的cdr3氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv19*01基因编码的cdr1氨基酸序列；vα结构域包含trav24*01基因编码的cdr1氨基酸序列。在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：145的cdr1氨基酸序列，并且vα结构域包含seqidno：103的cdr1氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv19*01基因编码的cdr2氨基酸序列；vα结构域包含trav24*01基因编码的cdr2氨基酸序列。在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：146的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：142的cdr2氨基酸序列。
在某些实施例中，vβ结构域包含：(a)seqidno：22或147的cdr3氨基酸序列以及由trbv19*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(b)vα结构域包含seqidno：21或143的cdr3氨基酸序列以及由trav24*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；或(a)和(b)两者。
在某些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：145的cdr1氨基酸序列，seqidno：146的cdr2氨基酸序列和seqidno：147的cdr3氨基酸序列；而vα结构域包含seqidno：103的cdr1氨基酸序列，seqidno：142的cdr2氨基酸序列和seqidno：143的cdr3氨基酸序列。
在某些实施例中，结合蛋白包含(a)与seqidno：69或包含在seqidno：73或182中的vα氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vα结构域；(b)与seqidno：71或包含在seqidno：73或182中的vβ氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的vβ结构域；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构；其中至少三个或四个cdr没有突变，而具有突变的cdr具有三个或更少的氨基酸取代、插入和/或或缺失。此类变体vα和vβ结构域可用于本文所述的结合蛋白中，条件是结合蛋白保留或基本上保留特异性结合ccna1肽(seqidno：2)：hla复合物的能力。
在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)与seqidno：144的氨基酸序列具有至少约75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vα结构域；(b)与seqidno：148的氨基酸序列具有至少约75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vβ结构域；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。
在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含seqidno：144的氨基酸序列或由其组成；(b)vβ，其包含或由seqidno：148的氨基酸序列组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。在一些方面，示例性结合蛋白包含包含seqidno：144的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：148的氨基酸序列的vβ结构域。
在某些实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含seqidno：69或seqidno：73的vα氨基酸序列或由其组成；或(b)vβ结构域，其包含seqidno：71或seqidno：73的vβ氨基酸序列或由其组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。在具体的实施例中，结合蛋白包含：(a)包含seqidno：69的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：71的vβ氨基酸序列的vβ结构域；或(b)包含seqidno：73中的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：73中的vβ氨基酸序列的vβ结构域。
在另一方面，本公开提供了结合蛋白(例如，免疫球蛋白超家族结合蛋白或其部分)，其包含：(a)t细胞受体(tcr)α链可变(vα)结构域，其包含seqidno：23或151中列出的互补决定区3(cdr3)氨基酸序列或seqidno：23或151中列出的具有最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失的cdr3氨基酸序列，以及tcrβ链变量(vβ)域；(b)tcrvα结构域和tcrvβ结构域，tcrvβ结构域包含seqidno：24或153所示的cdr3氨基酸序列或seqidno：24或153所示的cdr3氨基酸序列，且最多五个氨基酸取代、插入和/或缺失；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ结构域，其中结合蛋白能够与人细胞周期蛋白a1(ccna1)肽370-379yslseivpcl(seqidno：3)：人特异性结合白细胞抗原(hla)复合物。
在某些实施例中，vα结构域包含seqidno：23或151的cdr3氨基酸序列，并且vβ结构域包含seqidno：24或153的cdr3氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv5-6*01基因编码的cdr1氨基酸序列；而vα结构域包含trav19*01基因编码的cdr1氨基酸序列。在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：115的cdr1氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：149的cdr1氨基酸序列。
在一些实施例中，(a)vβ结构域包含由trbv5-6*01基因编码的cdr2氨基酸序列；而vα结构域包括trav19*01基因编码的cdr2氨基酸序列。在一些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：116的cdr2氨基酸序列，而vα结构域包含seqidno：150的cdr2氨基酸序列。
在某些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：24或153的cdr3氨基酸序列以及由trbv5-6*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；(b)vα结构域包含seqidno：23或151的cdr3氨基酸序列以及由trav19*01基因编码的cdr1氨基酸序列和cdr2氨基酸序列；或(a)和(b)两者。
在某些实施例中，(a)vβ结构域包含seqidno：115的cdr1氨基酸序列、seqidno：116的cdr2氨基酸序列和seqidno：153的cdr3氨基酸序列；所述vα结构域包含seqidno：149的cdr1氨基酸序列、seqidno：150的cdr2氨基酸序列和seqidno：151的cdr3氨基酸序列。
在某些实施例中，结合蛋白包含：(a)与seqidno：75、79或184中包含的vα氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vα结构域；(b)与seqidno：77、79或184中包含的vβ氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vβ结构域；或(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ；其中至少三个或四个cdr没有突变，而具有突变的cdr具有三个或更少的氨基酸取代、插入和/或缺失。此类变体vα和vβ结构域可用于本文所述的结合蛋白中，条件是结合蛋白保留或基本上保留特异性结合ccna1肽(seqidno：3)：hla复合物的能力。
在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)与seqidno：152的氨基酸序列具有至少约75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vα结构域；(b)与seqidno：154的氨基酸序列具有至少约75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的vβ结构域；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。在一些实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含或由seqidno：152的氨基酸序列组成；(b)vβ结构域，其包含或由seqidno：154的氨基酸序列组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。在一些方面，示例性结合蛋白包含包含seqidno：152的氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：154的氨基酸序列的vβ结构域。
在某些实施例中，结合蛋白包含：(a)vα结构域，其包含或由seqidno：75、79或184中包含的vα氨基酸序列组成；或(b)vβ结构域，其包含或由seqidno：77、79或184中包含的vβ氨基酸序列组成；(c)(a)的vα结构域和(b)的vβ。在特定的实施例中，结合蛋白包含：(a)包含seqidno：75中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：77中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(b)包含seqidno：79中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：79中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域；(c))包含seqidno：184中包含的vα氨基酸序列的vα结构域和包含seqidno：184中包含的vβ氨基酸序列的vβ结构域。
在另一方面，本公开提供了能够特异性结合ccna1肽yslseivpcl(seqidno：3)的结合蛋白。在某些实施例中，结合蛋白能够结合ccna1肽yslseivpcl(seqidno：3)：hla复合物。
鉴定tcrvα和vβ结构域的结合对的方法是本领域已知的，并且包括，例如，pct专利公开号wo2016/161273；和pct公开号wo2016/161273.redmond等，2016，genomemed.8：80；munson等人，2016，美国国家科学院院刊.natl.学院科学113：8272-7；kimetal.，2012，plosone7：e37338(每种方法的全部内容都通过引用结合到本文中)。因此，本文所述的用于ccna1特异性vβ结构域(例如，包含如seqidno：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、93、101、109、117、123、129、140、147、153、189或190中任一个所示的cdr3的vβ结构域)的vα结构域，反之亦然(例如，包含seqidno：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、89、97、105、113、119、127、133、137、143或151中任意一个所示的cdr3的vα结构域)，可以使用本领域已知方法进行识别。
氨基酸的保守取代是众所周知的，并且可以天然发生，或者可以在重组产生结合蛋白或tcr时引入。可以使用本领域已知的诱变方法将氨基酸取代、缺失和添加引入蛋白质中(参见，例如，sambrook等，分子克隆：实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约，2001)。寡核苷酸定向的位点特异性(或片段特异性)诱变方法可用于提供改变的多核苷酸，其具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。或者，可以使用随机或饱和诱变技术，例如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链反应诱变和寡核苷酸定向诱变来制备免疫原多肽变体(参见，例如，sambrook等，同上)。
本领域技术人员已知的多种标准表明在肽或多肽的特定位置被取代的氨基酸是否是保守的(或相似的)。例如，相似氨基酸或保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸。相似的氨基酸可包括在以下类别中：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)；具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。被认为更难以分类的脯氨酸与具有脂族侧链的氨基酸(例如亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)具有相同的特性。在某些情况下，可以认为谷氨酰胺代替谷氨酸或天冬酰胺代替天冬氨酸，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域中所理解的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较该多肽的氨基酸序列和保守的氨基酸替代物与第二个多肽的序列来确定的(例如，使用geneworks，align，blast算法或其他方法)本文所述和本领域中实践的算法)。
在某些实施例中，本公开中提供的ccna1特异性结合蛋白能够以hla*02：01限制性方式特异性结合ccna1肽。
本公开的示例性结合蛋白包括tcr，tcr的抗原结合片段和嵌合抗原受体。示例性的tcr包括abtcr、gdtcr、单链tcr(sctcr)、可溶性tcr和单结构域tcr。本公开的结合蛋白可以是嵌合的、人源化的或人的。
另一示例性结合蛋白是tcr-car。tcr-car是异源二聚体融合蛋白，通常包含可溶性tcr(vαcα多肽链和vβcβ多肽链)，其中vβcβ多肽链与跨膜结构域和细胞内信号传导成分(例如，包含含itam的t细胞活化域和任选的共刺激信号传导域)(参见例如walseng等人，2017scientificreports7：10713，通过引用整体并入)。
在本文所述的任何实施例中，本发明的结合蛋白，例如tcr，可以进一步包含tcr恒定结构域，该tcr恒定结构域例如连接至vα结构域、vβ结构域或两者的c末端。tcrβ链恒定结构域可以由trbc1基因或trbc2基因编码。示例性的tcrβ链恒定结构域(cβ)是与seqidno：34的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的trbc1恒定结构域，或与seqidno：84的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的trbc2恒定域。tcrα链恒定域(cα)可以由trac基因编码。示例性的tcrα链恒定结构域是包含至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，与seqidno：33、156或157的氨基酸序列具有98％，99％或100％的同一性。
在某些实施例中，tcrcα结构域、cβ结构域或两者包含半胱氨酸取代，以在恒定结构域半胱氨酸残基之间产生天然tcr中不存在的链间二硫键。在特定实施例中，结合蛋白包含：(a)在对应于seqidno：33的位置49的位置、在对应于seqidno：156的位置48的位置处、在对应于seqidno：157(thr→cys)的位置47的位置处包含半胱氨酸取代的cα结构域，(b)在对应于seqidno：34的位置57的位置处或seqidno：84的位置56(ser→cys)的位置处包含半胱氨酸取代的cβ结构域，或(c)(a)和(b)两者。
在本文所述的任何实施例中，本发明的结合蛋白，例如tcr，可以进一步包含tcr恒定结构域，该tcr恒定结构域例如连接至vα结构域、vβ结构域或两者的c末端。示例性的tcrβ链恒定域(cq)是与seqidno：155的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的trbc1恒定域、或与seqidno：135的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的trbc2恒定域。tcrα链恒定域(cα)可以是由trac基因编码。示例性的tcrα链恒定结构域与seqidno：158、159或160的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在某些实施例中，tcrcα结构域是截短的tcrcα结构域。在特定的实施例中，截短的tcrα链恒定结构域在其c末端被截短。在一些实施例中，截短的tcrα链恒定结构域可在其c末端具有1、2、3、4或更多个氨基酸的截短，其对应于seqidno：33的氨基酸序列。在一个特定的实施例中，截短的tcrα链恒定结构域在其n末端被截短。在一些实施例中，截短的tcrα链恒定结构域可在其n端具有与seqidno：33的氨基酸序列相对应的1、2、3、4或更多个氨基酸的截短。
在某些实施例中，tcrcβ结构域是截短的tcrcβ结构域。在特定的实施例中，截短的tcrβ链恒定结构域在其c末端被截短。在一些实施例中，截短的tcrα链恒定结构域可在其c末端具有1、2、3、4或更多个氨基酸的截短，其对应于seqidno：34或84的氨基酸序列。在特定实施例中，截短的tcrβ链恒定结构域在其n末端被截短。在一些实施例中，截短的tcrβ链恒定结构域可在其n端具有1、2、3、4或更多个氨基酸的截短，其对应于seqidno：34或84的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的结合蛋白是tcr，其包含：(a)与seqidno：36、38、40、42、44、86、49、51、53、57、59、63、65、67、81、83、162、165、170、172、174、176、178、180和186中任一个所含的α链氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的α链；(b)与seqidno：36、38、40、42、46、86、49、51、55、57、61、63、67、81、83、162、165、170、172、174、176、178、180和186中任一个所含的β链氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100的同一性的β链；或(c)(a)的α链和(b)的β链，其中结合蛋白能够特异性结合人ccna1肽fldrflscm(seqidno：1)：hla复合物。
示例性的tcr包括tcr，其包括：(a)包含seqidno：36中包含的链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：36中的β链氨基酸序列的tcrβ链；(b)包含seqidno：38中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：38中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(c)包含seqidno：40中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：40中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(d)包含seqidno：42中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：42中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(e)包含氨基酸序列seqidno：44的tcrα链和包含氨基酸序列seqidno：46的tcrβ链；(f)包含seqidno：86中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：86中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(g)包含seqidno：49中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：49中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(h)包含seqidno：51中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：51中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(i)包含氨基酸序列seqidno：53的tcrα链和包含氨基酸序列seqidno：55的tcrβ链；(j)包含seqidno：57中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：57中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(k)包含氨基酸序列seqidno：59的tcrα链和包含氨基酸序列seqidno：6l的tcrβ链；(l)包含seqidno：63中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：63中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(m)包含seqidno：65中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：67中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(n)包含seqidno：67中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：67中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(o)包含seqidno：81中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：81中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(p)包含seqidno：83中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：83中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(q)包含seqidno：162中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：162中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(r)包含seqidno：165中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：165中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(s)包含seqidno：170中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：170中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(t)包含seqidno：172中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：172中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(u)包含seqidno：174中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：174中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(v)包含seqidno：176中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：176中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(w)包含seqidno：178中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：178中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；(x)包含seqidno：180中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：180中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链；或(y)包含seqidno：186中包含的α链氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：186中包含的β链氨基酸序列的tcrβ链。
在其他实施例中，本公开的结合蛋白是tcr，其包含：(a)α链，与seqidno：69的氨基酸序列或seqidno：73或182中包含的α氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；(b)α、β链，与seqidno：71的氨基酸序列或seqidno：73或182中包含的β链氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；或(c)(a)的α链和(b)的β链，其中所述结合蛋白能够特异性结合人ccna1肽sliaaaafcla(seqidno：2)：hla复合物。
示例性的tcr包括：(a)包含seqidno：69的氨基酸序列tcrα链和包含seqidno：71的氨基酸序列的tcrβ链；(b)包含seqidno：73中包含的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：73中包含的氨基酸序列的tcrβ链；(c)包含seqidno：182的氨基酸序列tcrα链和包含seqidno：182的氨基酸序列的tcrβ链。
在另外的实施例中，本公开的结合蛋白是tcr，其包含：(a)α链，与seqidno：75的氨基酸序列或seqidno：79或184中包含的α链氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；(b)α、β链，与seqidno：77的氨基酸序列或seqidno：79或184中所包含的β链氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；或(c)(a)的α链和(b)的β链，其中所述结合蛋白能够与人ccna1肽yslseivpcl(seqidno：3)：hla复合物特异性结合。
示例性的tcr包括：(a)包含seqidno：75的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：77的氨基酸序列分tcrβ链；(b)包含seqidno：79中包含的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：79中包含的氨基酸序列的tcrβ链；(c)包含seqidno：184中包含的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：184中包含的氨基酸序列的tcrβ链。
多核苷酸、载体和宿主细胞
在某些方面，提供了编码本文所述的任何一种或多种结合蛋白的核酸分子。
在另一方面，本公开提供了编码结合蛋白的多核苷酸，其包含t细胞受体(tcr)α链可变(vα)结构域和tcrβ链可变(vβ)结构域，其中编码的结合蛋白能够特异性与人细胞周期蛋白a1(ccna1)肽yslseivpcl(seqidno：3)结合，其中所述异源多核苷酸经密码子优化以在宿主细胞中表达。
在某些实施例中，编码tcrα链或其部分的多核苷酸和编码tcrβ链或其部分的多核苷酸包含在工程宿主细胞(例如，免疫细胞)所包含的单个开放阅读框中，其中单个开放阅读框进一步包含编码自切割多肽的多核苷酸，该自切割多肽位于编码α链的多核苷酸和编码β链的多核苷酸之间。在某些实施例中，自切割多肽选自内部核糖体进入位点(ires)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2a肽或其任意组合。示例性的病毒自我切割多肽包括来自猪破伤风病毒-1(p2a)、thoseaasigna病毒(t2a)、马鼻炎a病毒(e2a)、口蹄疫病毒(f2a)或其变体的病毒2a肽。在某些实施例中，示例性的t2a肽序列包含seqidno：16的氨基酸序列。其他示例性的核酸和氨基酸序列例如kim等人(plosone6：el8556，2011，其2a核酸和氨基酸序列通过引用整体并入本文)中阐述。示例性的p2a肽包含seqidno：29的氨基酸序列。示例性的t2a肽包含seqidno：30的氨基酸序列。示例性的e2a肽包含seqidno：31的氨基酸序列。示例性的f2a肽包含seqidno：32的氨基酸序列。
编码所需结合蛋白的多核苷酸可通过使用本领域已知的任何合适的分子生物学工程技术来完成，包括使用限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和dna测序，例如sambrook等人(1989年和2001年版；《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约)和ausubel等人(分子生物学的当前方案，2003)所述。或者，可以合成产生目的序列。
本公开内容的核酸可以指任何形式的单链或双链dna、cdna或rna，并且可以包括彼此互补的核酸的正链和负链，包括反义dna、cdna和rna。还包括sirna、microrna、rna-dna杂种、核酶以及其他各种天然或合成形式的dna或rna。
在某些实施例中，编码tcrα链的异源多核苷酸和编码tcrβ链的异源多核苷酸包含在工程免疫细胞中包含的单个开放阅读框中，其中该单个开放阅读框还包含编码自切割多肽的多核苷酸，自切割多肽位于编码α链的多核苷酸和编码β链的多核苷酸之间。
在本文所述的任何实施例中，可以对本公开内容的多核苷酸进行密码子优化以在包含多核苷酸的宿主细胞(例如免疫细胞)中有效表达(参见例如scholten等，clin.immunol.779：135-145(2006))。如本文所用，“密码子优化的”多核苷酸包括异源多核苷酸，所述异源多核苷酸具有经沉默突变修饰的密码子，所述沉默突变对应于目的宿主细胞中trna水平的丰度。
根据本文公开的任何实施例，单个多核苷酸分子可以编码一个、两个或多个结合蛋白。编码多于一个转录物的多核苷酸可包含位于每个转录物之间的用于多顺反子表达的序列(例如，病毒2a肽)。
在某些实施例中，本公开的结合蛋白可以可操作地连接至载体的某些元件。例如，可以操作地连接实现多核苷酸序列所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列可包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能的增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与目的基因和表达控制序列邻接，则它们可被有效连接，所述表达控制序列以反式或远距离作用来控制目的基因。
某些实施例包括载体中包含的本公开的多核苷酸。本领域技术人员可以容易地确定适用于本文公开的某些实施例的载体。示例性载体可包含能够转运与其连接的另一核酸分子或能够在宿主生物中复制的核酸分子。载体的一些实例包括质粒、病毒载体、粘粒和其他。一些载体可能能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)，而其他载体可能整合到多核苷酸的宿主细胞的基因组中或促进其整合，多核苷酸在引入宿主细胞时插入并且从而与宿主基因组(例如慢病毒载体)一起复制。另外，一些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达(这些载体可以称为“表达载体”)。根据相关实施例，还应理解，如果将一种或多种试剂(例如，如本文所述的编码结合蛋白的多核苷酸)共同施用给受试者，则每种试剂可存在于分开的或相同的载体中，并且多种载体(各自包含不同的试剂或相同的试剂)可以包含在细胞或细胞群中或施用于受试者。
载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、rna载体或线性或环状dna或rna分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成或合成的核酸分子。示例性载体是那些能够自主复制的载体(附加载体)或能够表达与其连接的核酸分子的载体(表达载体)。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链rna病毒(例如正粘液病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台)、正链rna病毒(例如小瘤病毒和alpha病毒)以及双链dna病毒、包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、eb病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如痘苗、鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、巴波病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病肉瘤、哺乳动物c型、b型病毒、d型病毒、htlv-blv组、慢病毒、泡沫病毒(coffin，j.m.，逆转录病毒：病毒及其复制，《基础病毒学》第三版，bnfields等编辑，lippincott-ravenpublishers，费城，1996)。
在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(mlv)衍生的载体。在其他实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。hiv-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括源自hiv-2、fiv、马传染性贫血病毒、siv和maedi-visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒载体和包装细胞以用含有转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已在例如美国专利8,119,772；walchli等人，plosone6：327930，2011；zhao等，j.immunol.174：4415，2005；恩格斯等，hum.genether.14：1155，2003；frecha等人，mol.ther.18：1748，2010；和verhoeyen等人，methodsmol.biol.506：91，2009中描述。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括dna病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺伴随病毒(aav)的载体；源自单纯疱疹病毒(hsv)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型hsv和减毒的hsv(krisky等，genether.5：1517，1998)。
最近开发的用于基因治疗用途的其他载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。这样的载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的那些(jolly，dj.1999.friedmannt.ed.emergingviralvectorspp209-40，developmentofhumangenetherapy。纽约：冷泉港实验室)，或质粒载体(例如睡美人或其他转座子载体)。
用于基因工程和产生目的结合蛋白的表达载体的构建可以通过使用本领域已知的任何合适的分子生物学工程技术来完成。为了获得有效的转录和翻译，每个重组表达构建体中的多核苷酸包括至少一个合适的表达控制序列(也称为调节序列)，例如与编码结合蛋白的核苷酸序列可操作(即可操作地)连接的前导序列，特别是启动子。
有时使用标记以鉴定或监测异源多核苷酸的转导宿主细胞表达，或检测表达目的结合蛋白的细胞。在某些实施例中，多核苷酸还包含编码标记的多核苷酸。标记可以是赋予抗药性的选择标记，也可以是可通过诸如流式细胞术之类的方法检测的可检测标记，例如荧光标记或细胞表面蛋白。在某些实施例中，编码标记的多核苷酸位于编码结合蛋白的多核苷酸的3'。在其他实施例中，编码标记的多核苷酸位于编码结合蛋白的多核苷酸的5'。示例性标记包括绿色荧光蛋白(gfp)、人cd2的胞外域、截短的人egfr(huegfrt；参见wang等，blood118：1255(2011))、截短的人cd19(hucd19t)，截短的人cd34(hucd34t)或截短的人ngfr(hungfrt)。在某些实施例中，编码的标记物包括egfrt、cd19t、cd34t或ngfrt。示例性的截短的人egfr序列包含seqidno：85的氨基酸序列。
在某些实施例中，载体可以进一步包含自杀基因，其中自杀基因的表达导致包含载体的宿主细胞死亡。例如，在某些情况下，本发明结合蛋白的延长表达是不希望的。载体中包含自杀基因允许对受试者中结合蛋白表达的更好控制。在某些实施例中，自杀基因的表达是可诱导的，例如通过使用调节自杀基因表达的诱导型启动子。在一个具体的实施例中，自杀基因是诱导型胱天蛋白酶9基因(参见美国专利公开号2013/0071414，通过引用整体并入)。
当病毒载体基因组在单个转基因内包含多个多核苷酸以作为分离的蛋白质在宿主细胞中表达时，病毒载体还可在两个(或更多个)多核苷酸之间包含允许双顺反子或多顺反子表达的其他序列。病毒载体中使用的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(ires)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2a肽或其任意组合。
在本文描述的任何实施例中，多核苷酸可进一步包含编码自切割多肽的多核苷酸，其中编码自切割多肽的多核苷酸位于编码结合蛋白的多核苷酸和编码标记的多核苷酸之间。
在某些实施例中，自切割多肽包含来自猪破伤风病毒-1(p2a)、thoseaasigna病毒(t2a)、马鼻炎a病毒(e2a)、口蹄疫病毒(f2a)或其变体。在某些实施例中，示例性的t2a肽序列包含seqidno：16的氨基酸序列。2a肽的进一步的示例性核酸和氨基酸序列在例如kim等人(plosone6：el8556，2011，其2a核酸和氨基酸序列通过引用整体并入本文)中描述。示例性的p2a肽包含seqidno：29的氨基酸序列。示例性的t2a肽包含seqidno：30的氨基酸序列。示例性的e2a肽包含seqidno：31的氨基酸序列。示例性的f2a肽包含seqidno：32的氨基酸序列。
在某些方面，本发明的结合蛋白可以在宿主细胞的表面上表达或由宿主细胞分泌或从宿主细胞分离。宿主细胞可以包括可以接受载体或掺入核酸或表达蛋白质的任何单个细胞或细胞培养物。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传上还是在表型上相同或不同。合适的宿主细胞可以取决于载体，并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、通过磷酸钙沉淀的转化、deae-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其他方法诱导这些细胞掺入载体或其他材料。参见，例如，sambrook等人，molecularcloning第2版.(冷泉港实验室，1989年)。
除载体外，某些实施例还涉及经修饰(即，基因改造)以包含目前公开的编码结合蛋白(例如，tcr)的异源多核苷酸的宿主细胞或包括编码结合蛋白(例如，tcr)的异源多核苷酸的载体。包含编码至少一种结合蛋白的异源多核苷酸的修饰的或基因工程的宿主细胞在其细胞表面上表达本发明的至少一种结合蛋白。修饰的宿主细胞可表达本公开的单一类型的结合蛋白或两种或更多种不同类型的结合蛋白。宿主细胞可以离体或体内修饰。宿主细胞可以包括可以接受载体或核酸或蛋白质掺入的任何单个细胞或细胞培养物以及任何子代细胞。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传上还是在表型上相同或不同。合适的宿主细胞可以取决于载体，并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、通过磷酸钙沉淀的转化、deae-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其他方法诱导这些细胞掺入载体或其他材料。参见例如，sambrook等，molecularcloning第2版.(冷泉港实验室，1989年)。在任何上述实施例中，包含编码本公开内容的结合蛋白的多核苷酸的宿主细胞由与例如在过继免疫疗法程序中接受修饰的宿主细胞的受试者自体、异源或同基因的细胞组成。
在某些实施例中，转导以表达本公开内容的结合蛋白的宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。如本文所用，“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如免疫系统细胞)的细胞。示例性的造血祖细胞包括具有cd24lolin-cd117+表型的那些或在胸腺中发现的那些(称为祖细胞)。
在某些实施例中，宿主细胞是免疫系统细胞，包括b细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4-cd8-双阴性t细胞、gdt细胞、调节性t细胞、天然杀伤细胞(例如，nk细胞或nk-t细胞)和树突状细胞。
在某些实施例中，宿主细胞是t细胞。t细胞可以是幼稚t细胞、记忆t细胞(tm)、辅助t细胞(th)、效应t细胞(te)、γδt细胞、调节性t细胞(treg)、自然杀伤性t细胞(nkt)或其任意组合。tm可以进一步分为中央记忆t细胞(与幼稚t细胞相比，tcm、cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95的表达增加，而cd54ra的表达减少)和效应记忆t细胞(tem，与幼稚t细胞或tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra的表达降低，而cd127的表达增加)。
可以使用已知技术收集t细胞，并且可以通过已知技术，例如通过与抗体的亲和结合、流式细胞术或免疫磁选择来富集或消除各种亚群或其组合。
用所需核酸转染/转导t细胞的方法已经描述(例如，在美国专利申请公开号us2004/0087025；美国专利号6,410,319；pct公开号wo2014/031687；brentjens等人，2007，clin.cancerres.13：5426中)为使用具有期望靶特异性的t细胞的过继转移程序(例如，schmitt等，hum.gen.20：1240，2009；dosse.tt等，mol.ther.17：742，2009；till等人，blood112：2261，2008；wang等人，hum.genether.18：712，2007；kuball等人，blood109：2331，2007；us2011/0243972；leen等人，ann.rev.immunol.25：243，2007；kalos等人，scitransl.med.3：95ra73，2011；porter等人，201l，n.engl.j.med.365：725-33，2011)，从而基于本文的教导，包括针对本发明结合蛋白的那些，构想了将这些方法应用于当前公开的实施例。
当包含根据本发明的多核苷酸、载体或蛋白质时，作为本发明的一个方面考虑的真核宿主细胞除人类免疫细胞(例如人类患者自身的免疫细胞)外，还包括vero细胞、希拉细胞、中国人仓鼠卵巢(cho)细胞系(包括能够修饰表达的多价结合分子的糖基化模式的修饰cho细胞，请参见美国专利申请公开号2003/0115614)、cos细胞(例如cos-7)、w138、bek、hepg2、3t3、rin、mdck、a549、pc12、k562、hek293细胞、hepg2细胞、n细胞、3t3细胞、草地贪夜蛾细胞(例如sf9细胞)、酿酒酵母细胞和本领域已知的任何其他真核细胞可用于表达和任选地分离根据本公开的蛋白质或肽。还考虑了原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、链霉菌或本领域已知适合表达和任选分离根据本公开的蛋白质或肽的任何原核细胞。特别地，在从原核细胞中分离蛋白质或肽时，可以考虑使用本领域已知的从包涵体提取蛋白质的技术。考虑了糖基化本公开的结合蛋白的宿主细胞。
根据常规方法，在含有营养物质和所选宿主细胞生长所需的其他成分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。多种合适的介质，包括确定的介质和复合介质，在本领域中是已知的，并且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基还可以包含诸如生长因子或血清的成分。生长培养基通常将通过例如药物选择或必需营养素的缺乏来选择含有异源多核苷酸的细胞，所述必需营养素由表达载体上携带的或共同转染到宿主细胞中的选择标记来补充。
在某些实施例中，本公开的结合蛋白在宿主细胞的表面上表达，使得与靶抗原的结合引起来自宿主细胞的活性或应答。可以根据许多本领域公认的用于测定宿主细胞(例如t细胞)活性的方法来对这类表达的蛋白质进行功能表征，所述方法包括确定t细胞结合、激活或诱导，还包括确定抗原特异性的t细胞反应。实例包括确定t细胞增殖、t细胞细胞因子释放、抗原特异性t细胞刺激、mhc限制性t细胞刺激、ctl活性(例如，通过检测从预载靶细胞的51cr或europium释放)、t细胞表型变化标记表达和其他t细胞功能指标。例如，可以在lefkovits(immunologymethodsmanual：technicalsourcebookoftechniques，1998)中找到进行这些和类似测定的程序。还参见，currentprotocolsinimmunology；weir，handbookofexperimentalimmunology,blackwellscientific,boston,ma(1986)；mishellandshigii(ed.)selectedmethodsncellularimmunology，freemanpublishing，sanfrancisco,ca(1979)；greenandreed，science281：1309(1998)及其中引用的参考文献。
可以根据本文所述和本领域中实践的方法确定细胞因子的水平，包括例如elisa、elispot、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。可以通过分离淋巴细胞，例如外周血细胞样本中的循环淋巴细胞或淋巴结细胞中的循环淋巴细胞，用抗原刺激细胞并测量抗原，来确定由抗原特异性引发或刺激免疫应答引起的免疫细胞增殖和克隆扩增。细胞因子的产生、细胞增殖和/或细胞活力，例如通过掺入氚化的胸腺嘧啶核苷或非放射性测定，例如mtt测定等。可以例如通过确定th1细胞因子(例如ifn-γ、il-12、il-2和tnf-β)和2型细胞因子(例如il-4、il-5、il-9、il-10和il-13)的水平来检查本文所述的免疫原对th1免疫应答和th2免疫应答之间的平衡的作用。
在其他方面，提供了试剂盒，其包含(a)如本文所述的载体或表达构建体和用于将载体或表达构建体转导至宿主细胞中的任选试剂，和(b)(i)本文公开的结合蛋白、分离的多核苷酸、载体或表达载体，和(ii)用于将多核苷酸或表达载体转导到宿主细胞中的任选试剂，和(c)本公开的宿主细胞。
使用方法
在某些方面，本公开中提供的组合物可以用于治疗以过度表达ccna-1为特征的过度增殖性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合蛋白、包含编码结合蛋白的多核苷酸的载体、表达结合蛋白的修饰宿主细胞或其药物组合物。在某些实施例中，该疾病是癌症。
如本文所用，术语“癌症”包括实体瘤和血液系统恶性肿瘤(例如，白血病)。可以治疗的示例性癌症包括胆道癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、桥粒状肿瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌癌症、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞肿瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤和子宫癌。
典型的血液系统恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性粒细胞性白血病(cml)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(cel)、骨髓增生异常综合症(mds)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)(滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病)、骨髓瘤和多发性骨髓瘤(mm)。
在某些实施例中，受试者是人类或非人类动物，例如非人类灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、猫、狗、山羊、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。在一个实施例中，受试者是人，例如成人、青少年、儿童或婴儿。
在某些实施例中，给予受试者的修饰的宿主细胞是自体的、同种异体的或同基因的。
ctl免疫应答的水平可以通过本文所述和本领域常规实践的多种免疫学方法中的任何一种来确定。可以在施用由例如t细胞表达的本文描述的任何ccna1特异性结合蛋白之前和之后确定ctl免疫应答的水平。可以使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任何一种来进行用于确定ctl活性的细胞毒性测定(参见例如henkart等人，“cytotoxict-lymphocytes”infundamentalimmunology，paul(ed.)(2003lippincott，williams&wilkins，philadelphia,pa)，第1127-50页，以及其中引用的参考文献)。
抗原特异性t细胞可以通过根据本文所述的任何t细胞功能参数(例如，增殖、细胞因子释放、ctl活性、改变的细胞表面标志物表型等)通过比较观察到的t细胞反应来确定。在适当情况下暴露于同源抗原的t细胞(例如，当由免疫相容性抗原呈递细胞呈递时用于引发或激活t细胞的抗原)与来自相同来源群体的t细胞之间的接触结构上不同或无关的对照抗原。具有统计学显著性的对同源抗原的应答大于对对照抗原的应答表示抗原特异性。
可以从受试者获得生物学样品，用于确定对疾病抗原肽的免疫应答的存在和水平。如本文所用，“生物样品”可以是血液样品(可以从中制备血清或血浆)、活检样品、体液(例如，肺灌洗、腹水、粘膜洗涤液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或受试者或生物学来源的任何其他组织或细胞制剂。也可以在接受任何免疫原性组合物之前从受试者获得生物样品，该生物样品可用作建立基线(即免疫前治疗)数据的对照。
本文所述的结合蛋白、多核苷酸、载体或修饰的宿主细胞可以在药学或生理学上可接受或合适的赋形剂或载体中施用于受试者。药学上可接受的赋形剂是生物相容性载体，例如生理盐水，其在本文中更详细地描述，其适合于施用于人类或其他非人类哺乳动物受试者。在过继细胞疗法的上下文中，治疗有效剂量是在治疗的人类或非人类哺乳动物中能够以统计学上显著的方式产生临床上期望的结果(例如，细胞毒性t细胞应答)的过继转移中使用的宿主细胞(表达根据本发明的结合蛋白)的量。如医学领域所公知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体重、体表面积、年龄、所要施用的特定疗法、性别、施用时间和途径、总体健康状况以及同时在服用的其他药物。剂量会变化，但是施用包含本文所述的重组表达载体的宿主细胞的优选剂量为约107细胞/m2、约5×107细胞/m2、约108细胞/m2、约5×108细胞/m2、大约109细胞/m2、大约5x109细胞/m2、大约1010细胞/m2、大约5x1010细胞/m2或大约1011细胞/m2。
如医学领域技术人员所确定的，可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或状况的方式施用药物组合物。组合物的合适剂量以及合适的持续时间和施用频率将由诸如患者的健康状况、患者的大小(即重量、体重或体表面积)、患者疾病的类型和严重程度、活性成分的特定形式以及给药方法等因素来确定。通常，合适的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供组合物(例如本文所述，包括改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解、或更长无疾病和/或总体生存率、或症状严重程度的减轻)。为了预防使用，剂量应足以预防、延迟与疾病或病症相关的疾病的发作或减轻其严重性。可以通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究，并分析通过适当的统计学、生物学和临床方法及技术从中获得的数据，来确定根据本文所述方法施用的免疫治疗组合物的预防益处，所有这些都可以由本领域技术人员容易地实践。
本文描述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶中。这样的容器可以冷冻以保持制剂的稳定性直到使用。在某些实施例中，单位剂量包含本文所述的重组宿主细胞，其剂量为约107细胞/m2至约1011细胞/m2。本领域技术人员可以确定在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案(包括例如肠胃外或静脉内给药或制剂)的开发。
如果本发明的组合物肠胃外给药，则该组合物还可包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液可进一步包含一种或多种缓冲剂，例如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料应该是药学上纯的，并且在使用量上基本上是无毒的。另外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和制剂中。如本文所用，剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合于作为待治疗对象的单位剂量。每个单元可以包含预定量的重组细胞或活性化合物，所述重组细胞或活性化合物经计算可与合适的药物载体结合产生期望的治疗效果。
通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗或预防益处的量提供活性分子或细胞。与未治疗的受试者相比，可以通过在治疗的受试者中建立改善的临床结局(例如，更频繁的缓解、完全或部分或更长的无病生存期)来监测这种反应。预先存在的针对肿瘤蛋白的免疫反应的增加通常与改善的临床结果相关。通常可以使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法来评估这种免疫应答，其可以使用在治疗之前和之后从受试者获得的样品来进行。
在某些实施例中，治疗疾病的方法包括与一种或多种其他试剂组合施用修饰的免疫细胞。
在某些实施例中，将本公开的修饰的免疫细胞与免疫抑制组分的抑制剂一起施用于受试者。
如本文所用，术语“免疫抑制成分”或“免疫抑制组分”是指提供抑制信号以帮助控制或抑制免疫应答的一种或多种细胞、蛋白质、分子、化合物或复合物。例如，免疫抑制成分包括部分或全部阻断免疫刺激；减少、预防或延迟免疫激活；或增加、激活或上调免疫抑制的分子。示例性免疫抑制组分靶标在本文中进一步详细描述，并且包括免疫检查点分子，例如pd-1、pd-l1、pd-l2、cd80、cd86、b7-h3、b7-h4、hvem、腺苷、gal9、vista、ceacam-1、pvrl2、ctla-4、btla、kir、lag3、tim3、a2ar、cd244/2b4、cd160、tigit、lair-1、pvrig/cd112r；代谢酶，例如精氨酸酶、吲哚胺2、3-二加氧酶(ido)；免疫抑制细胞因子，例如il-10、il-4、il-1ra、il-35；treg细胞，或其任意组合。
免疫抑制成分的抑制剂可以是化合物、抗体、抗体片段或融合多肽(例如fc融合物，例如ctla4-fc或lag3-fc)、反义分子、核酶或rnai分子、或低分子量有机分子。在本文公开的任何实施例中，方法可以包括将修饰的免疫细胞与以下免疫抑制组分中的任一种的一种或多种抑制剂单独或以任意组合给予。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与pd-1抑制剂(例如pd-1特异性抗体或其结合片段)组合使用，所述抗体例如是pidilizumab、nivolumab(keytruda，以前称为mdx-1106)、pembrolizumab(opdivo，以前称为mk-3475)、medi0680(以前称为amp-514)、amp-224、bms-936558或其任意组合。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与pd-l1特异性抗体或其结合片段组合使用，例如bms-936559、德瓦鲁单抗(medi4736)、阿特朱单抗(rg7446)、avelumab(msb0010718c)、mpdl3280a或其任意组合。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与lag3抑制剂例如lag525、imp321、imp701、9h12、bms-986016或其任意组合组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与ctla4的抑制剂组合使用。在特定的实施例中，修饰的免疫细胞与ctla4特异性抗体或其结合片段结合使用，所述抗体或其结合片段例如易普利姆玛、tremelimumab、ctla4-ig融合蛋白(例如ababatcept、贝拉西普)或其任意组合。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与b7-h3特异性抗体或其结合片段，例如依诺妥珠单抗(mga271)、376.96或两者结合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与b7-h4特异性抗体或其结合片段，例如scfv或其融合蛋白结合使用，如在例如dangaj等，cancerres.73：4820,2013，以及美国专利第9,574,000号和pct专利公开号wo2016/40724和wo2013/025779中所述。
在一些实施例中，修饰的免疫细胞与cd244的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与blta、hvem、cd160或其任意组合的抑制剂组合使用。抗cd-160抗体在例如pct公开号wo2010/084158中描述。
在更多的实施例中，修饰的免疫细胞与tim3的抑制剂组合使用。
在更多实施例中，修饰的免疫细胞与gal9的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与腺苷信号传导抑制剂如诱饵腺苷受体组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与a2ar抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与kir抑制剂，例如lirilumab(bms-986015)组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与抑制性细胞因子(通常是除tgfβ以外的细胞因子)或treg发育或活性的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与ido抑制剂例如左旋-1-甲基色氨酸、依帕克司他(incb024360；liu等人，blood115：3520-30，2010)、ebselen(terentis等人，biochem.49：591-600，2010)、吲哚莫德、nlg919(mautino等人，美国癌症研究协会第104届年会2013；2013年4月6-10日)、1-甲基色氨酸(1-mt)-tira-pazamine或其任意组合组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与精氨酸酶抑制剂组合使用，所述精氨酸酶抑制剂例如n(ω)-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name)、n-ω-羟基-nor-1-精氨酸(nor-noha)、l-noha、2(s)-氨基-6-硼代己酸(abh)、s-(2-硼代乙基)-l-半胱氨酸(bec)或其任意组合。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与vista的抑制剂例如ca-170(curis，lexington，ma)组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与lair1抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5或其任意组合的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，修饰的免疫细胞与增加刺激性免疫检查点分子的活性的试剂(即，激动剂)组合使用。例如，修饰的免疫细胞可以与cd137(4-1bb)激动剂(例如urelumab)、cd134(ox-40)激动剂(例如medi6469、medi6383、或medi0562)、来那度胺、泊马利度胺、cd27激动剂(例如cdx-1127)、cd28激动剂(例如tgn1412、cd80或cd86)、cd40激动剂(例如，cp-870,893、rhucd40l或sgn-40)、cd122激动剂(例如il-2)、gitr激动剂(例如pct专利公开no.wo2016/054638)、icos(cd278)的激动剂(例如gsk3359609、mab88.2、jtx-2011、icos145-1或icos314-8)或其任意组合。在本文公开的任何实施例中，一种方法可以包括将修饰的免疫细胞与一种或多种刺激性免疫检查点分子(包括上述任何一种)的激动剂单独或任意组合施用。
在其他实施例中，本公开的方法进一步包括给予包括以下中的一种或多种的次级疗法：对由所靶向的癌细胞表达的癌症抗原具有特异性的抗体或抗原结合片段；化学治疗剂；手术；放射治疗；细胞因子；rna干扰疗法，或其任意组合。
可用于癌症治疗的示例性单克隆抗体包括例如在galluzzi等人，oncotarget5(24)：12472-12508，2014中描述的单克隆抗体，这些抗体通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，联合治疗方法包括向受试者施用修饰的免疫细胞并进一步进行放射治疗或手术。放射疗法包括x射线疗法(例如γ射线)和放射性药物疗法。适用于治疗给定的癌症或非发炎的实体瘤的手术和外科技术可以与本公开的修饰的免疫细胞组合用于受试者。
在某些实施例中，组合疗法方法包括将修饰的免疫细胞和化学治疗剂给予受试者。化学治疗剂包括但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、dna损伤剂、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰的类似物)、dna合成抑制剂、dna交互作用剂(例如嵌入剂)和dna修复抑制剂。示例性化学治疗剂包括但不限于以下组：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂包括长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰物、如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和萘韦尔滨、表鬼臼毒素(鬼臼乙叉甙、依托泊苷、氨苄青霉素、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、六甲基三聚氰胺草酸铂、异磷酰胺、美育素、三聚氰胺、三聚氰胺、三聚氰胺、四氢呋喃、四氢呋喃替莫唑胺、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(vp16))；抗生素、如放线菌素(放线菌素d)、柔红霉素、阿霉素(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(线霉素)和丝裂霉素；酶(l-天冬酰胺酶可全身性代谢l-天冬酰胺、并剥夺没有能力合成其自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂、例如氮芥子碱(甲氯乙胺、环磷酰胺及其类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替帕)、烷基磺酸盐-白硫丹、亚硝基脲(卡莫司汀(bcnu)和类似物、链脲佐星—(dtic)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物、例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴嗪、羟基脲、米托坦、氨基谷氨酰胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗转移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(fk-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(tnp470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(vegf)抑制剂、成纤维细胞生长因子(fgf)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗、利妥昔单抗)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mtor抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素(阿霉素)、氨水扁桃碱、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达柔比星、伊立替康(cpt-11)和米托蒽醌、氢可酮、甾体酮、可替康可、依地替康、依地替康甲基pednisolone、泼尼松和泼尼松)；生长因子信号转导激酶抑制剂线粒体功能障碍诱导剂、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素等毒素、以及胱天蛋白酶激活剂；和染色质破坏剂。
细胞因子可用于操纵宿主针对抗癌活性的免疫反应。参见例如floros和tarhini，semin.oncol.42,539，2015。可用于促进抗癌或抗肿瘤反应的细胞因子包括，例如ifn-α、il-2、il-3、il-4、il-10、il-12、il-13、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il-24和gm-csf可以单独使用或组合使用。
另一种癌症治疗方法涉及减少癌基因以及癌细胞生长、维持、增殖和免疫逃避所需的其他基因的表达。rna干扰，尤其是microrna(mirna)小型抑制性rna(sirna)的使用提供了一种降低癌症基因表达的方法。参见例如，larsson等，cancertreat.rev.16：128，2017。
在本文公开的任何实施例中，任何治疗剂(例如，修饰的免疫细胞、免疫抑制成分的抑制剂、刺激性免疫检查点分子的激动剂、化学治疗剂、放射疗法、外科手术、细胞因子或抑制性rna)可以在治疗过程中一次或多次施用于受试者，并且可以以任何顺序(例如，同时、并发或以任何顺序)组合施用于受试者或任意组合。组合物的合适剂量、合适的持续时间和施用频率将由诸如患者的状况；肿瘤或癌症的大小、类型、扩散、生长和严重性；活性成分的特定形式；和施用方法等因素来确定。
在某些实施例中，向受试者施用多种剂量的本文所述的修饰的免疫细胞，其可以在约两周至约四周的施用之间的间隔内施用。在进一步的实施例中，依序给予细胞因子(例如il-2、il-15、il-21)，条件是在给予细胞因子之前至少向受试者给予重组宿主细胞至少三或四次。在某些实施例中，细胞因子与宿主细胞同时施用。在某些实施例中，皮下施用细胞因子。
在另外的实施例中，被治疗的受试者进一步接受免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任意组合。在另外的实施例中，被治疗的受试者已经接受了非清髓性或造血性造血细胞移植，其中可以在所述非清髓性的造血细胞移植后至少两至至少三个月施用所述治疗。
如本文所述，治疗或药物组合物的有效量是指在所需剂量和所需时间段内足以达到所需临床结果或有益治疗的量。有效量可以一次或多次给药方式递送。如果对已知或已确认患有某种疾病或疾病状态的受试者给药，则术语“治疗量”可以用于治疗，而“预防有效量”可以用于描述对作为预防性过程易感或有患疾病或疾病状态(例如复发)的风险的受试者的给予的有效量。
示例
示例1：
细胞周期蛋白altcr
选择最保守的细胞周期蛋白a1同工型的人细胞周期蛋白a1同工型3的蛋白质序列(seqidno：4)，以最大化癌症表达目标表位的机会。通过用跨越整个ccna1蛋白序列的重叠肽库刺激供体cd8+t细胞来发现细胞周期蛋白a1特异性tcr，所述重叠肽库被设计为覆盖所有可能的mhc-1表位。当在大约3轮肽刺激后观察到针对完整肽库的反应性t细胞时，通过用表达单个目标hla等位基因的单个肽和细胞系进行筛选来确定最小的肽表位和呈递的hla等位基因(参见图1)。
在对几种不同的hla-a2+供体细胞进行3轮刺激后，检测到细胞周期蛋白a1(227-235)特异性t细胞反应。通过用hla-a2/细胞周期蛋白a1(227-235)荧光标记的多聚体标记来检测抗原特异性应答(图2第一行)。通过将t细胞与转导表达细胞周期蛋白a1的721.221白血病细胞系以及作为阴性对照的hla-a1(图2的第二行)或hla-a2(图2的第三行)一起培养(incubate)来确认hla限制和效应子功能)。将游离肽作为阳性对照添加至t细胞(图2的第4行)。在高尔基抑制剂存在下共同培养4小时后，固定t细胞并使其通透，然后用抗ifnγ抗体标记并通过流式细胞仪进行分析。几种t细胞系不仅表现出抗原特异性(通过四聚体结合)，而且对表达肿瘤抗原和hla等位基因正确组合的细胞系所呈现的游离肽和天然加工的肽都具有效应子功能。
hla-a2/细胞周期蛋白a1(227-235)特异性t细胞系按其四聚体结合亲和力排名，以选择最高亲和力的tcr进行进一步分析。在一系列单独的实验中，从12个不同的供体中产生了大约150个不同的t细胞系或克隆。这些的子集如图3a-3b示出。仔细计数t细胞，并用递减浓度的hla-a2/细胞周期蛋白a1(227-235)荧光标记的多聚体标记来自每个t细胞系的相等数目的t细胞。将每条线的多聚体染色的平均荧光强度相对于四聚体浓度作图(图3a)。从该图进行线性回归分析以确定最大结合系数，将其应用于原始数据以生成每条线的相对解离常数(kd)，即提供50％最大结合的四聚体浓度。这些值与tcr亲和力成反比，其中最低的kd对应于最高的预测亲和力(图3b)。在不同的供体和测试的t细胞系之间，mhc-肽多聚体具有一系列不同的亲和力。选择了10种最佳候选基因用于racepcr、tcr测序和慢病毒tcr基因转移载体的产生。
图4示出了如何从供体cd8+t细胞中分离、鉴定和表达预测具有高亲和力tcr的高亲和力抗原特异性t细胞系的tcr，并在功能上进行比较。在测试的10个hla-a2/细胞周期蛋白a1(227-235)特异性tcr中，有5个成功克隆到慢病毒载体中，在cd8+t细胞中表达，并与mhc-ccna1肽多聚体结合。包括一个先前生成的hla-a2/细胞周期蛋白al(227-235)特异性tcr#4进行比较，以及hla-a2/细胞周期蛋白al(341-35l)，tcr#7和hla-a2/细胞周期蛋白a1(370-379)，tcr#8另外两个特有的tcr也被克隆、表达和测试。将成功转导的cd8+t细胞与相关的mhc-肽多聚体进行分选，并在进行功能分析之前进行扩增。表1提供了cdr3序列以及t细胞受体α和β基因的使用。
表1.细胞周期蛋白a1特异性tcr
tcr#5、9、6、1、2、3、10、11和4对与hla*02：0l复合的细胞周期蛋白a1(227-235)fldrflscm肽(seqidno：1)具有特异性。tcr#7特异于与hla*02：0l复合的细胞周期蛋白a1(341-351)sliaaaafcla(seqidno：2)。tcr#8特异于与hla*02：0l复合的细胞周期蛋白a1(370-379)。
在高尔基抑制剂存在下，将第一t细胞与不同浓度的特定肽配体培养4小时，然后固定t细胞并使其通透并用抗ifnγ抗体标记，以进行流式细胞术分析(图5a)。然后，通过将t细胞与hla-a2+细胞周期蛋白a1+kcl22白血病细胞靶标以不同比例共培养，来测试tcr转导的t细胞的细胞毒性功能。用荧光染料标记靶标，并与抗原阴性对照细胞等比例混合(图5b)。在6小时的培养结束时，通过流式细胞术确定剩余的标记靶的频率(相对于对照细胞)，并从该数据计算抗原特异性杀伤的百分比。使用几种开放获取在线算法预测了不同肽表位与hla-a2的结合强度以及这些表位将由全长蛋白的蛋白质体加工产生的可能性(图5c)。如图5b所示，进行了第二次细胞毒性试验，但是这次比较了最有希望的细胞周期蛋白a1(227-235)特异性tcr(#3)杀死肽负载的t2靶细胞hla-a2+细胞周期蛋白a1+aml细胞系(ml1)和hla-a2+细胞周期蛋白a1+原发性aml样品的能力(图5d)。将未转导的t细胞与相同靶标在单独的孔中培养，以控制杀伤的特异性。
图5a显示当用低剂量的游离肽刺激时，识别肽341和370的tcr优于227特异性tcr。在图5b中，使用内源性表达细胞周期蛋白a1蛋白的靶细胞进行的杀伤测定通过227特定的tcr中的至少一个表现出优异的杀伤力，该细胞周期蛋白a1蛋白经蛋白质组加工，装载到mhc分子上并转运到细胞表面以被t细胞识别。这表明，与其他表位相比，肿瘤细胞系可能更有效地处理227肽，而当作为游离配体引入时，341和370可能在溶液中更稳定或与mhc结合更牢固，从而导致卓越的t细胞功能。图5c显示，有一些生物信息学数据表明，肽370确实比肽227更牢固地结合hla-a2，但该227是预测的三种ccna1肽中预计将被细胞的一般蛋白体加工机制切割的仅有的一种。该信息支持肽227是癌症治疗的良好靶标。图5d显示表现最佳的227tcr候选物能够杀死载有肽的靶细胞，表达细胞周期蛋白a1的aml细胞系和主要aml样品，尽管肿瘤细胞表面的肽浓度可能比载肽的情况低得多。
由于细胞周期蛋白a1蛋白序列在人和小鼠中高度保守，并且小鼠和人在肺和大脑中均显示低水平的ccna1mrna表达(通过qpcr)，因此小鼠是测试细胞周期蛋白a1特异性安全性的良好模型体内tcr。为了使人类hla*a02：01限制性tcrs在小鼠中识别其同源抗原，已进行基因工程改造以表达hla*a0：012分子的转基因小鼠用于体内测试。因此，人tcr可变结构域维持其识别肽和呈递的mhc分子的能力。为了在小鼠t细胞表面上有效表达人tcr，已设计了鼠类tcr恒定域来代替人tcr的人tcr恒定域，从而使小鼠tcr发挥正常功能(请参见图6)。
可以将上述各种实施例组合以提供其他实施例。本说明书中提及和/或在应用数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容通过引用合并于此，包括2018年2月12日提交的美国临时专利申请号62/629,648，2018年2月13日提交的美国临时专利申请号62/630,198和2018年5月4日提交的美国临时专利申请号62/667,207。如果需要采用各种专利、申请和出版物的理念以提供进一步的实施例，则可以修改实施例的各方面。
可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施例，而是应解释为包括所有可能的实施例以及权利要求等同物的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110>弗雷德哈钦森癌症研究中心
r·佩雷特
p·d·格林伯格
<120>细胞周期蛋白a1特异性t细胞受体及其用途
<130>360056.460wo
<140>pct
<141>2019-02-12
<150>us62/667,207
<151>2018-05-04
<150>us62/630,198
<151>2018-02-13
<150>us62/629,648
<151>2018-02-12
<160>190
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>9
<212>prt
<213>智人
<220>
<223>ccna1227-235肽
<400>1
pheleuaspargpheleusercysmet
15
<210>2
<211>11
<212>prt
<213>智人
<220>
<223>ccna1341-351肽
<400>2
serleuilealaalaalaalaphecysleuala
1510
<210>3
<211>10
<212>prt
<213>智人
<220>
<223>ccna1370-379肽
<400>3
tyrserleusergluilevalprocysleu
1510
<210>4
<211>421
<212>prt
<213>智人
<220>
<223>ccna1蛋白同工型3
<400>4
methiscysserasnprolysserglyvalvalleualathrvalala
151015
argglyproaspalacysglnileleuthrargalaproleuglygln
202530
aspproproglnargthrvalleuglyleuleuthralaasnglygln
354045
tyrargargthrcysglyglnglyilethrargileargcystyrser
505560
glysergluasnalapheproproalaglylyslysalaleuproasp
65707580
cysglyvalglngluproprolysglnglypheaspiletyrmetasp
859095
gluleugluglnglyaspargaspsercysservalarggluglymet
100105110
alaphegluaspvaltyrgluvalaspthrglythrleulysserasp
115120125
leuhispheleuleuasppheasnthrvalserprometleuvalasp
130135140
serserleuleuserglnsergluaspileserserleuglythrasp
145150155160
valileasnvalthrglutyralaglugluiletyrglntyrleuarg
165170175
glualagluilearghisargprolysalahistyrmetlyslysgln
180185190
proaspilethrgluglymetargthrileleuvalasptrpleuval
195200205
gluvalglygluglutyrlysleuargalagluthrleutyrleuala
210215220
valasnpheleuaspargpheleusercysmetservalleuarggly
225230235240
lysleuglnleuvalglythralaalametleuleualaserlystyr
245250255
glugluiletyrproprogluvalaspgluphevaltyrilethrasp
260265270
aspthrtyrthrlysargglnleuleulysmetgluhisleuleuleu
275280285
lysvalleualapheaspleuthrvalprothrthrasnglnpheleu
290295300
leuglntyrleuargargglnglyvalcysvalargthrgluasnleu
305310315320
alalystyrvalalagluleuserleuleuglualaasppropheleu
325330335
lystyrleuproserleuilealaalaalaalaphecysleualaasn
340345350
tyrthrvalasnlyshisphetrpprogluthrleualaalaphethr
355360365
glytyrserleusergluilevalprocysleusergluleuhislys
370375380
alatyrleuaspileprohisargproglnglnalaileargglulys
385390395400
tyrlysalaserlystyrleucysvalserleumetgluproproala
405410415
valleuleuleugln
420
<210>5
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vαcdr3
<400>5
cysglythrgluglualaasnasptyrlysleuserphe
1510
<210>6
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vβcdr3
<400>6
cysalaserservalglyglnglysersertyrgluglntyrphe
151015
<210>7
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号和tcr11号vαcdr3
<400>7
cysvalvaltrpglyglyaspthrasplysleuilephe
1510
<210>8
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号vβcdr3
<400>8
cysalaileleuaspglygluglyserproleuhisphe
1510
<210>9
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vαcdr3
<400>9
cysalaleuglyprotyrasnasptyrlysleuserphe
1510
<210>10
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vβcdr3
<400>10
cysalaserseraspargserasnthrglygluleuphephe
1510
<210>11
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vαcdr3
<400>11
cysalavalgluglyaspsersertyrlysleuilephe
1510
<210>12
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vβcdr3
<400>12
cysalaserserphepheserglngluthrglntyrphe
1510
<210>13
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vαcdr3
<400>13
cysalavalileglygluglnasnphevalphe
1510
<210>14
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vβcdr3
<400>14
cysalaserserleuserglyleuglyserglyalaasnvalleuthr
151015
phe
<210>15
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vαcdr3
<400>15
cysalavalaspserglyglytyrglnlysvalthrphe
1510
<210>16
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vβcdr3
<400>16
cysalaserserleuasnmetasnthrglualaphephe
1510
<210>17
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号vαcdr3
<400>17
cysalathraspgluserserasntyrlysleuthrphe
1510
<210>18
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号vβcdr3
<400>18
cysalaserserleuasnmetasnthrglualaphephe
1510
<210>19
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vαcdr3
<400>19
cysalathraspalatrpgluserasnpheglyasnglulysleuthr
151015
phe
<210>20
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vβcdr3
<400>20
cysalaserserleuvalvalglysertyrgluglntyrphe
1510
<210>21
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vαcdr3
<400>21
cysalatyrleuglyalaglyasnglnphetyrphe
1510
<210>22
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vβcdr3
<400>22
cysalaserserleuasnargglyargtyrglytyrthrphe
1510
<210>23
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vαcdr3
<400>23
cysalaleusergluleualaserglyglysertyrileprothrphe
151015
<210>24
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vβcdr3
<400>24
cysalaserserpheargleualaglyglyproserthraspthrgln
151015
tyrphe
<210>25
<211>66
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>p2a肽编码核酸
<400>25
ggttccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaacccc60
ggtccc66
<210>26
<211>63
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>t2a肽编码核酸
<400>26
ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctgga60
cct63
<210>27
<211>69
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>e2a肽编码核酸
<400>27
ggaagcggacagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaac60
cctggacct69
<210>28
<211>75
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>f2a肽编码核酸
<400>28
ggaagcggagtgaaacagactttgaattttgaccttctcaagttggcgggagacgtggag60
tccaaccctggacct75
<210>29
<211>22
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>p2a肽
<400>29
glyserglyalathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspval
151015
glugluasnproglypro
20
<210>30
<211>21
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>t2a肽
<400>30
glyserglygluglyargglyserleuleuthrcysglyaspvalglu
151015
gluasnproglypro
20
<210>31
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>e2a肽
<400>31
glyserglyglncysthrasntyralaleuleulysleualaglyasp
151015
valgluserasnproglypro
20
<210>32
<211>25
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>f2a肽
<400>32
glyserglyvallysglnthrleuasnpheaspleuleulysleuala
151015
glyaspvalgluserasnproglypro
2025
<210>33
<211>142
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域多肽
<400>33
proasnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspser
151015
lysserserasplysservalcysleuphethrasppheaspsergln
202530
thrasnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplys
354045
thrvalleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralaval
505560
alatrpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasn
65707580
serileileprogluaspthrphepheproserproglusersercys
859095
aspvallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasn
100105110
pheglnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysval
115120125
alaglypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>34
<211>177
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrβ1恒定结构域多肽
<400>34
gluaspleuasnlysvalpheproprogluvalalavalpheglupro
151015
serglualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleu
202530
alathrglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasn
354045
glylysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulys
505560
gluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleu
65707580
argvalseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcys
859095
glnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasp
100105110
argalalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyarg
115120125
alaaspcysglyphethrservalsertyrglnglnglyvalleuser
130135140
alathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyrala
145150155160
valleuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysasp
165170175
phe
<210>35
<211>1821
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号构建体;β链-p2a-α链
<400>35
atgggcttcaggctcctctgctgtgtggccttttgtctcctgggagcaggcccagtggat60
tctggagtcacacaaaccccaaagcacctgatcacagcaactggacagcgagtgacgctg120
agatgctcccctaggtctggagacctctctgtgtactggtaccaacagagcctggaccag180
ggcctccagttcctcattcagtattataatggagaagagagagcaaaaggaaacattctt240
gaacgattctccgcacaacagttccctgacttgcactctgaactaaacctgagctctctg300
gagctgggggactcagctttgtatttctgtgccagcagcgtagggcaggggtcctcctac360
gagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttc420
ccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggcc480
acactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtg540
aatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagccc600
gccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctgg660
cagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgac720
gagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggt780
agagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatc840
ctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtg900
ctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggcggttccggagccacgaacttctct960
ctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatggagactctcctgaaa1020
gtgctttcaggcaccttgttgtggcagttgacctgggtgagaagccaacaaccagtgcag1080
agtcctcaagccgtgatcctccgagaaggggaagatgctgtcatcaactgcagttcctcc1140
aaggctttatattctgtacactggtacaggcagaagcatggtgaagcacccgtcttcctg1200
atgatattactgaagggtggagaacagaagggtcatgaaaaaatatctgcttcatttaat1260
gaaaaaaagcagcaaagctccctgtaccttacggcctcccagctcagttactcaggaacc1320
tacttctgcggcacagaggaagctaacgactacaagctcagctttggagccggaaccaca1380
gtaactgtaagagcaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactct1440
aaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtca1500
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gccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgt1680
gatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctg1740
tcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacg1800
ctgcggctgtggtccagctga1821
<210>36
<211>606
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号构建体;β链-p2a-α链
<400>36
metglypheargleuleucyscysvalalaphecysleuleuglyala
151015
glyprovalaspserglyvalthrglnthrprolyshisleuilethr
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180185190
cysargasnvalserargglyargglucysvalasplyscysasnleu
195200205
leugluglygluproarggluphevalgluasnserglucysilegln
210215220
cyshisproglucysleuproglnalametasnilethrcysthrgly
225230235240
argglyproaspasncysileglncysalahistyrileaspglypro
245250255
hiscysvallysthrcysproalaglyvalmetglygluasnasnthr
260265270
leuvaltrplystyralaaspalaglyhisvalcyshisleucyshis
275280285
proasncysthrtyrglycysthrglyproglyleugluglycyspro
290295300
thrasnglyprolysileproserilealathrglymetvalglyala
305310315320
leuleuleuleuleuvalvalalaleuglyileglyleuphemet
325330335
<210>86
<211>497
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的tcr6号构建体;在β和α链恒定结构域(部分序列)中有半胱氨酸取代的β链-p2a-α链
<400>86
lysserproglnproleuthrargargalathrmetserileserleu
151015
leucyscysalaalapheproleuleutrpalaglyprovalasnala
202530
glyvalthrglnthrprolyspheargileleulysileglyglnser
354045
metthrleuglncysthrglnaspmetasnhisasntyrmettyrtrp
505560
tyrargglnaspproglymetglyleulysleuiletyrtyrserval
65707580
glyalaglyilethrasplysglygluvalproasnglytyrasnval
859095
serargserthrthrgluasppheproleuargleugluleualaala
100105110
proserglnthrservaltyrphecysalaserseraspargserasn
115120125
thrglygluleuphepheglygluglyserargleuthrvalleuglu
130135140
aspleulysasnvalpheproprogluvalalavalphegluproser
145150155160
glualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleuala
165170175
thrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly
180185190
lysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulysglu
195200205
glnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleuarg
210215220
valseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcysgln
225230235240
valglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasparg
245250255
alalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyargala
260265270
aspcysglyphethrserglusertyrglnglnglyvalleuserala
275280285
thrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralaval
290295300
leuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysaspser
305310315320
argglyglyserglyalathrasnpheserleuleulysglnalagly
325330335
aspvalglugluasnproglyprometglulysasnproleualaala
340345350
proleuleuileleutrpphehisleuaspcysvalserserileleu
355360365
asnvalgluglnserproglnserleuhisvalglngluglyaspser
370375380
thrasnphethrcysserpheproserserasnphetyralaleuhis
385390395400
trptyrargtrpgluthralalysserproglualaleuphevalmet
405410415
thrleuasnglyaspglulyslyslysglyargileseralathrleu
420425430
asnthrlysgluglytyrsertyrleutyrilelysglyserglnpro
435440445
gluaspseralathrtyrleucysalaleuglyprotyrasnasptyr
450455460
lysleuserpheglyalaglythrthrvalthrvalargalaasnile
465470475480
glnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysserser
485490495
asp
<210>87
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vαcdr1
<400>87
lysalaleutyrser
15
<210>88
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vαcdr2
<400>88
leuleulysglyglyglugln
15
<210>89
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vαcdr3
<400>89
glythrgluglualaasnasptyrlysleuser
1510
<210>90
<211>109
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vα可变区
<400>90
glnglnprovalglnserproglnalavalileleuarggluglyglu
151015
aspalavalileasncysserserserlysalaleutyrservalhis
202530
trptyrargglnlyshisglyglualaprovalpheleumetileleu
354045
leulysglyglygluglnlysglyhisglulysileseralaserphe
505560
asnglulyslysglnglnserserleutyrleuthralaserglnleu
65707580
sertyrserglythrtyrphecysglythrgluglualaasnasptyr
859095
lysleuserpheglyalaglythrthrvalthrvalarg
100105
<210>91
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vβcdr1
<400>91
serglyaspleuser
15
<210>92
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vβcdr2
<400>92
tyrtyrasnglygluglu
15
<210>93
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vβcdr3
<400>93
alaserservalglyglnglysersertyr
1510
<210>94
<211>114
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr5号vβ可变区
<400>94
aspserglyvalthrglnthrprolyshisleuilethralathrgly
151015
glnargvalthrleuargcysserproargserglyaspleuserval
202530
tyrtrptyrglnglnserleuaspglnglyleuglnpheleuilegln
354045
tyrtyrasnglyglugluargalalysglyasnileleugluargphe
505560
seralaglnglnpheproaspleuhissergluleuasnleuserser
65707580
leugluleuglyaspseralaleutyrphecysalaserservalgly
859095
glnglysersertyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthr
100105110
valthr
<210>95
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号和tcr11号vαcdr1
<400>95
valserpropheserasn
15
<210>96
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号和tcr11号vαcdr2
<400>96
thrphesergluasnthr
15
<210>97
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号和tcr11号vαcdr3
<400>97
valvaltrpglyglyaspthrasplysleuile
1510
<210>98
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号和tcr11号vα可变
区
<400>98
lysasnglnvalgluglnserproglnserleuileileleuglugly
151015
lysasncysthrleuglncysasntyrthrvalserpropheserasn
202530
leuargtrptyrlysglnaspthrglyargglyprovalserleuthr
354045
ilemetthrphesergluasnthrlysserasnglyargtyrthrala
505560
thrleuaspalaaspthrlysglnserserleuhisilethralaser
65707580
glnleuseraspseralasertyrilecysvalvaltrpglyglyasp
859095
thrasplysleuilepheglythrglythrargleuglnvalphe
100105110
<210>99
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr11号vβcdr1
<400>99
trpserhissertyr
15
<210>100
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr11号vβcdr2
<400>100
seralaalaalaaspile
15
<210>101
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr11号vβcdr3
<400>101
alaserseraspglyglyglyglntyr
15
<210>102
<211>109
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr11号vβ可变区
<400>102
aspalaglyilethrglnserproargtyrlysilethrgluthrgly
151015
argglnvalthrleumetcyshisglnthrtrpserhissertyrmet
202530
phetrptyrargglnaspleuglyhisglyleuargleuiletyrtyr
354045
seralaalaalaaspilethrasplysglygluvalproaspglytyr
505560
valvalserargserlysthrgluasnpheproleuthrleugluser
65707580
alathrargserglnthrservaltyrphecysalaserseraspgly
859095
glyglyglntyrpheproglythrargleuthrvalthr
100105
<210>103
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号和tcr7号vαcdr1
<400>103
serserasnphetyrala
15
<210>104
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vαcdr2
<400>104
metthrleuasnglyaspglu
15
<210>105
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vαcdr3
<400>105
cysalaleuglyprotyrasnasptyrlysleuserphe
1510
<210>106
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vα可变区
<400>106
ileleuasnvalgluglnserproglnserleuhisvalglnglugly
151015
aspserthrasnphethrcysserpheproserserasnphetyrala
202530
leuhistrptyrargtrpgluthralalysserproglualaleuphe
354045
valmetthrleuasnglyaspglulyslyslysglyargileserala
505560
thrleuasnthrlysgluglytyrsertyrleutyrilelysglyser
65707580
glnprogluaspseralathrtyrleucysalaleuglyprotyrasn
859095
asptyrlysleuserpheglyalaglythrthrvalthrvalargala
100105110
<210>107
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vβcdr1
<400>107
metasnhisasntyr
15
<210>108
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vβcdr2
<400>108
servalglyalaglyile
15
<210>109
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vβcdr3
<400>109
alaserseraspargserasnthrglygluleuphe
1510
<210>110
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr6号vβ可变区
<400>110
asnalaglyvalthrglnthrprolyspheargileleulysilegly
151015
glnsermetthrleuglncysthrglnaspmetasnhisasntyrmet
202530
tyrtrptyrargglnaspproglymetglyleulysleuiletyrtyr
354045
servalglyalaglyilethrasplysglygluvalproasnglytyr
505560
asnvalserargserthrthrgluasppheproleuargleugluleu
65707580
alaalaproserglnthrservaltyrphecysalaserserasparg
859095
serasnthrglygluleuphepheglygluglyserargleuthrval
100105110
leu
<210>111
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号和tcr2号vαcdr1
<400>111
aspseralailetyrasn
15
<210>112
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号和tcr2号vαcdr2
<400>112
ileglnserserglnargglu
15
<210>113
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vαcdr3
<400>113
alavalgluglyaspsersertyrlysleuile
1510
<210>114
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vα可变区
<400>114
lysglngluvalthrglnileproalaalaleuservalproglugly
151015
gluasnleuvalleuasncysserphethraspseralailetyrasn
202530
leuglntrppheargglnaspproglylysglyleuthrserleuleu
354045
leuileglnserserglnarggluglnthrserglyargleuasnala
505560
serleuasplysserserglyargserthrleutyrilealaalaser
65707580
glnproglyaspseralathrtyrleucysalavalgluglyaspser
859095
sertyrlysleuilepheglyserglythrargleuleuvalargpro
100105110
<210>115
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号和tcr8号vβcdr1
<400>115
serglyhisaspthr
15
<210>116
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号和tcr8号vβcdr2
<400>116
tyrtyrgluglugluglu
15
<210>117
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vβcdr3
<400>117
alaserserphepheserglngluthrglntyr
1510
<210>118
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr1号vβ可变区
<400>118
aspalaglyvalthrglnserprothrhisleuilelysthrarggly
151015
glnglnvalthrleuargcysserprolysserglyhisaspthrval
202530
sertrptyrglnglnalaleuglyglnglyproglnpheilephegln
354045
tyrtyrglugluglugluargglnargglyasnpheproaspargphe
505560
serglyhisglnpheproasntyrsersergluleuasnvalasnala
65707580
leuleuleuglyaspseralaleutyrleucysalaserserphephe
859095
serglngluthrglntyrpheglyproglythrargleuleuvalleu
100105110
<210>119
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vαcdr3
<400>119
alavalileglygluglnasnpheval
15
<210>120
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vα可变区
<400>120
lysglngluvalthrglnileproalaalaleuservalproglugly
151015
gluasnleuvalleuasncysserphethraspseralailetyrasn
202530
leuglntrppheargglnaspproglylysglyleuthrserleuleu
354045
leuileglnserserglnarggluglnthrserglyargleuasnala
505560
serleuasplysserserglyargserthrleutyrilealaalaser
65707580
glnproglyaspseralathrtyrleucysalavalileglyglugln
859095
asnphevalpheglyproglythrargleuservalleupro
100105110
<210>121
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号,tcr3号,和tcr10号
vβcdr1
<400>121
serglyhisthrala
15
<210>122
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号,tcr3号,和tcr10号
vβcdr2
<400>122
pheglnglythrglyala
15
<210>123
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vβcdr3
<400>123
alaserserleuserglyleuglyserglyalaasnvalleuthr
151015
<210>124
<211>117
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr2号vβ可变区
<400>124
glyalaglyvalserglnthrproserasnlysvalthrglulysgly
151015
lystyrvalgluleuargcysaspproileserglyhisthralaleu
202530
tyrtrptyrargglnserleuglyglnglyproglupheleuiletyr
354045
pheglnglythrglyalaalaaspaspserglyleuproasnasparg
505560
phephealavalargprogluglyservalserthrleulysilegln
65707580
argthrgluargglyaspseralavaltyrleucysalaserserleu
859095
serglyleuglyserglyalaasnvalleuthrpheglyalaglyser
100105110
argleuthrvalleu
115
<210>125
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vαcdr1
<400>125
aspargglyserglnser
15
<210>126
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vαcdr2
<400>126
iletyrserasnglyasp
15
<210>127
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vαcdr3
<400>127
alavalaspserglyglytyrglnlysvalthr
1510
<210>128
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vα可变区
<400>128
glnlysgluvalgluglnasnserglyproleuservalproglugly
151015
alailealaserleuasncysthrtyrseraspargglyserglnser
202530
phephetrptyrargglntyrserglylysserprogluleuilemet
354045
seriletyrserasnglyasplysgluaspglyargphethralagln
505560
leuasnlysalaserglntyrvalserleuleuileargaspsergln
65707580
proseraspseralathrtyrleucysalavalaspserglyglytyr
859095
glnlysvalthrpheglythrglythrlysleuglnvalile
100105110
<210>129
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vβcdr3
<400>129
alaserserleuasnmetasnthrglualaphe
1510
<210>130
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr3号vβ可变区
<400>130
glyalaglyvalserglnthrproserasnlysvalthrglulysgly
151015
lystyrvalgluleuargcysaspproileserglyhisthralaleu
202530
tyrtrptyrargglnserleuglyglnglyproglupheleuiletyr
354045
pheglnglythrglyalaalaaspaspserglyleuproasnasparg
505560
phephealavalargprogluglyservalserthrleulysilegln
65707580
argthrgluargglyaspseralavaltyrleucysalaserserleu
859095
asnmetasnthrglualaphepheglyglnglythrargleuthrval
100105110
val
<210>131
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号和tcr4号vαcdr1
<400>131
thrserileasnasn
15
<210>132
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号和tcr4号vαcdr2
<400>132
ileargserasngluargglu
15
<210>133
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号vαcdr3
<400>133
alathraspgluserserasntyrlysleuthr
1510
<210>134
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号vα可变区
<400>134
serglnglnglyglugluaspproglnalaleuserileglnglugly
151015
gluasnalathrmetasncyssertyrlysthrserileasnasnleu
202530
glntrptyrargglnasnserglyargglyleuvalhisleuileleu
354045
ileargserasngluargglulyshisserglyargleuargvalthr
505560
leuaspthrserlyslysserserserleuleuilethralaserarg
65707580
alaalaaspthralasertyrphecysalathraspgluserserasn
859095
tyrlysleuthrpheglylysglythrleuleuthrvalasn
100105110
<210>135
<211>178
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrβ2恒定结构域,半胱氨酸修饰的
<400>135
aspleulysasnvalpheproprogluvalalavalphegluproser
151015
glualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleuala
202530
thrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly
354045
lysgluvalhisserglyvalcysthraspproglnproleulysglu
505560
glnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleuarg
65707580
valseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcysgln
859095
valglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasparg
100105110
alalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyargala
115120125
aspcysglyphethrserglusertyrglnglnglyvalleuserala
130135140
thrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralaval
145150155160
leuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysaspser
165170175
arggly
<210>136
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr10号vβ可变区
<400>136
glyalaglyvalserglnthrproserasnlysvalthrglulysgly
151015
lystyrvalgluleuargcysaspproileserglyhisthralaleu
202530
tyrtrptyrargglnserleuglyglnglyproglupheleuiletyr
354045
pheglnglythrglyalaalaaspaspserglyleuproasnasparg
505560
phephealavalargprogluglyservalserthrleulysilegln
65707580
argthrgluargglyaspseralavaltyrleucysalaserserleu
859095
asnmetasnthrglualaphepheglyglnglythrargleuthrval
100105110
val
<210>137
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vαcdr3
<400>137
alathraspalatrpgluserasnpheglyasnglulysleuthr
151015
<210>138
<211>114
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vα可变区
<400>138
serglnglnglyglugluaspproglnalaleuserileglnglugly
151015
gluasnalathrmetasncyssertyrlysthrserileasnasnleu
202530
glntrptyrargglnasnserglyargglyleuvalhisleuileleu
354045
ileargserasngluargglulyshisserglyargleuargvalthr
505560
leuaspthrserlyslysserserserleuleuilethralaserarg
65707580
alaalaaspthralasertyrphecysalathraspalatrpgluser
859095
asnpheglyasnglulysleuthrpheglythrglythrargleuthr
100105110
ileile
<210>139
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vβcdr2
<400>139
pheglnglyasnserala
15
<210>140
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vβcdr3
<400>140
alaserserleuvalvalglysertyrgluglntyr
1510
<210>141
<211>114
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr4号vβ可变区
<400>141
glyalaglyvalserglnserproserasnlysvalthrglulysgly
151015
lysaspvalgluleuargcysaspproileserglyhisthralaleu
202530
tyrtrptyrargglnserleuglyglnglyleuglupheleuiletyr
354045
pheglnglyasnseralaproasplysserglyleuproserasparg
505560
pheseralagluargthrglyglyservalserthrleuthrilegln
65707580
argthrglnglngluaspseralavaltyrleucysalaserserleu
859095
valvalglysertyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthr
100105110
valthr
<210>142
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vαcdr2
<400>142
metthrleuasnglyaspglu
15
<210>143
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vαcdr3
<400>143
alatyrleuglyalaglyasnglnphetyr
1510
<210>144
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vα可变区
<400>144
ileleuasnvalgluglnserproglnserleuhisvalglnglugly
151015
aspserthrasnphethrcysserpheproserserasnphetyrala
202530
leuhistrptyrargtrpgluthralalysserproglualaleuphe
354045
valmetthrleuasnglyaspglulyslyslysglyargileserala
505560
thrleuasnthrlysgluglytyrsertyrleutyrilelysglyser
65707580
glnprogluaspseralathrtyrleucysalatyrleuglyalagly
859095
asnglnphetyrpheglythrglythrserleuthrvalile
100105110
<210>145
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vβcdr1
<400>145
leuasnhisaspala
15
<210>146
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vβcdr2
<400>146
serglnilevalasnasp
15
<210>147
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vβcdr3
<400>147
alaserserleuasnargglyargtyrglytyrthr
1510
<210>148
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr7号vβ可变区
<400>148
aspglyglyilethrglnserprolystyrleuphearglysglugly
151015
glnasnvalthrleusercysgluglnasnleuasnhisaspalamet
202530
tyrtrptyrargglnaspproglyglnglyleuargleuiletyrtyr
354045
serglnilevalasnasppheglnlysglyaspilealagluglytyr
505560
servalserargglulyslysgluserpheproleuthrvalthrser
65707580
alaglnlysasnprothralaphetyrleucysalaserserleuasn
859095
argglyargtyrglytyrthrpheglyserglythrargleuthrval
100105110
val
<210>149
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vαcdr1
<400>149
thrargaspthrthrtyrtyr
15
<210>150
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vαcdr2
<400>150
argasnserpheaspgluglnasn
15
<210>151
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vαcdr3
<400>151
alaleusergluleualaserglyglysertyrileprothr
1510
<210>152
<211>117
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vα可变区
<400>152
alaglnlysvalthrglnalaglnthrgluileservalvalglulys
151015
gluaspvalthrleuaspcysvaltyrgluthrargaspthrthrtyr
202530
tyrleuphetrptyrlysglnproproserglygluleuvalpheleu
354045
ileargargasnserpheaspgluglnasngluileserglyargtyr
505560
sertrpasnpheglnlysserthrserserpheasnphethrilethr
65707580
alaserglnvalvalaspseralavaltyrphecysalaleuserglu
859095
leualaserglyglysertyrileprothrpheglyargglythrser
100105110
leuilevalhispro
115
<210>153
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vβcdr1
<400>153
alaserserpheargleualaglyglyproserthraspthrglntyr
151015
<210>154
<211>117
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcr8号vβ可变区
<400>154
aspalaglyvalthrglnserprothrhisleuilelysthrarggly
151015
glnglnvalthrleuargcysserprolysserglyhisaspthrval
202530
sertrptyrglnglnalaleuglyglnglyproglnpheilephegln
354045
tyrtyrglugluglugluargglnargglyasnpheproaspargphe
505560
serglyhisglnpheproasntyrsersergluleuasnvalasnala
65707580
leuleuleuglyaspseralaleutyrleucysalaserserphearg
859095
leualaglyglyproserthraspthrglntyrpheglyproglythr
100105110
argleuthrvalleu
115
<210>155
<211>177
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrβ1恒定结构域,半胱氨酸修饰的
<400>155
gluaspleuasnlysvalpheproprogluvalalavalpheglupro
151015
serglualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleu
202530
alathrglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasn
354045
glylysgluvalhisserglyvalcysthraspproglnproleulys
505560
gluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleu
65707580
argvalseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcys
859095
glnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasp
100105110
argalalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyarg
115120125
alaaspcysglyphethrservalsertyrglnglnglyvalleuser
130135140
alathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyrala
145150155160
valleuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysasp
165170175
phe
<210>156
<211>141
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域
<400>156
asnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlys
151015
serserasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthr
202530
asnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthr
354045
valleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalala
505560
trpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnser
65707580
ileileprogluaspthrphepheproserproglusersercysasp
859095
vallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphe
100105110
glnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalala
115120125
glypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>157
<211>140
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域
<400>157
ileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysser
151015
serasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthrasn
202530
valserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthrval
354045
leuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalalatrp
505560
serasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnserile
65707580
ileprogluaspthrphepheproserproglusersercysaspval
859095
lysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphegln
100105110
asnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalalagly
115120125
pheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>158
<211>142
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域,半胱氨酸修饰的
<400>158
proasnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspser
151015
lysserserasplysservalcysleuphethrasppheaspsergln
202530
thrasnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplys
354045
cysvalleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralaval
505560
alatrpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasn
65707580
serileileprogluaspthrphepheproserproglusersercys
859095
aspvallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasn
100105110
pheglnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysval
115120125
alaglypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>159
<211>141
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域,半胱氨酸修饰的
<400>159
asnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlys
151015
serserasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthr
202530
asnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplyscys
354045
valleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalala
505560
trpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnser
65707580
ileileprogluaspthrphepheproserproglusersercysasp
859095
vallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphe
100105110
glnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalala
115120125
glypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>160
<211>140
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>tcrα恒定结构域,半胱氨酸修饰的
<400>160
ileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysser
151015
serasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthrasn
202530
valserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplyscysval
354045
leuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalalatrp
505560
serasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnserile
65707580
ileprogluaspthrphepheproserproglusersercysaspval
859095
lysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphegln
100105110
asnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalalagly
115120125
pheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>161
<211>1821
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的tcr5号构建体;在β和α链恒定结构域中有半胱氨酸取代的β链-p2a-α链
<400>161
atgggcttcagactgttgtgttgcgtggccttttgccttcttggagctggacctgtggat60
tctggagttacacagacccctaagcacctgattacagccacaggacagagagtgaccctg120
agatgtagccctagaagcggagatctgagcgtgtattggtaccagcagagcctggatcaa180
ggactccagtttctgatccagtactacaacggcgaggagagagccaagggcaatattctg240
gagaggttttctgcccagcagttccctgatctgcactctgaactgaacctgtctagcctg300
gaactgggagattctgccctgtacttttgtgcctctagcgttggacagggcagctcttat360
gagcagtactttggacctggcaccagactgacagtgacagaagacctgaagaacgtgttc420
cccccagaggtggccgtgttcgagcctagcgaggccgagatcagccacacccagaaagcc480
accctcgtgtgcctggccaccggcttttaccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtc540
aacggcaaagaggtgcacagcggcgtctgcaccgacccccagcccctgaaagagcagccc600
gccctgaacgacagccggtactgtctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctgg660
cagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgac720
gagtggacccaggaccgggccaagcccgtgacccagatcgtgtctgctgaggcctggggc780
agagccgattgcggcttcaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatc840
ctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtccgccctggtg900
ctgatggccatggtcaagcggaaggacagccggggcggttccggagccacgaacttctct960
ctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatggaaaccctgctgaaa1020
gtgctgagcggaacactgttatggcagcttacatgggtgaggtctcagcaacctgtgcaa1080
tctccacaggccgttatcctgagagaaggagaagatgccgtgatcaactgctctagctct1140
aaagccctgtacagcgtgcactggtacagacagaaacacggagaagctcccgtgttcctg1200
atgattctgctgaaaggaggcgagcagaagggacacgagaagatttctgccagcttcaac1260
gagaagaagcagcagtctagcctgtacctgacagcttctcagctgagctatagcggcacc1320
tacttttgtggcacagaggaagccaacgactacaaactgagctttggagccggcacaaca1380
gtgacagttagagccaatatccagaaccccgatcctgctgtgtaccagctgcgggacagc1440
aagagcagcgacaagagcgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcc1500
cagagcaaggacagcgacgtgtacatcaccgataagtgcgtgctggacatgcggagcatg1560
gacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaac1620
gccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgc1680
gacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctc1740
agcgtgatcggcttccggatcctgctgctgaaggtggccggcttcaacctgctgatgacc1800
ctgcggctgtggtccagctga1821
<210>162
<211>606
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的tcr5号构建体;在β和α链恒定结构域中有半胱氨酸取代的β链-p2a-α链
<400>162
metglypheargleuleucyscysvalalaphecysleuleuglyala
151015
glyprovalaspserglyvalthrglnthrprolyshisleuilethr
202530
alathrglyglnargvalthrleuargcysserproargserglyasp
354045
leuservaltyrtrptyrglnglnserleuaspglnglyleuglnphe
505560
leuileglntyrtyrasnglyglugluargalalysglyasnileleu
65707580
gluargpheseralaglnglnpheproaspleuhissergluleuasn
859095
leuserserleugluleuglyaspseralaleutyrphecysalaser
100105110
servalglyglnglysersertyrgluglntyrpheglyproglythr
115120125
argleuthrvalthrgluaspleulysasnvalpheproprogluval
130135140
alavalphegluproserglualagluileserhisthrglnlysala
145150155160
thrleuvalcysleualathrglyphetyrproasphisvalgluleu
165170175
sertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalcysthrasp
180185190
proglnproleulysgluglnproalaleuasnaspserargtyrcys
195200205
leuserserargleuargvalseralathrphetrpglnasnproarg
210215220
asnhispheargcysglnvalglnphetyrglyleusergluasnasp
225230235240
glutrpthrglnaspargalalysprovalthrglnilevalserala
245250255
glualatrpglyargalaaspcysglyphethrserglusertyrgln
260265270
glnglyvalleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylys
275280285
alathrleutyralavalleuvalseralaleuvalleumetalamet
290295300
vallysarglysaspserargglyglyserglyalathrasnpheser
305310315320
leuleulysglnalaglyaspvalglugluasnproglyprometglu
325330335
thrleuleulysvalleuserglythrleuleutrpglnleuthrtrp
340345350
valargserglnglnprovalglnserproglnalavalileleuarg
355360365
gluglygluaspalavalileasncysserserserlysalaleutyr
370375380
servalhistrptyrargglnlyshisglyglualaprovalpheleu
385390395400
metileleuleulysglyglygluglnlysglyhisglulysileser
405410415
alaserpheasnglulyslysglnglnserserleutyrleuthrala
420425430
serglnleusertyrserglythrtyrphecysglythrglugluala
435440445
asnasptyrlysleuserpheglyalaglythrthrvalthrvalarg
450455460
alaasnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspser
465470475480
lysserserasplysservalcysleuphethrasppheaspsergln
485490495
thrasnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplys
500505510
cysvalleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralaval
515520525
alatrpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasn
530535540
serileileprogluaspthrphepheproserproglusersercys
545550555560
aspvallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasn
565570575
pheglnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysval
580585590
alaglypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
595600605
<210>163
<211>1818
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>tcr9号构建体;β链-p2a-α链
<400>163
atggatacctggctcgtatgctgggcaatttttagtctcttgaaagcaggactcacagaa60
cctgaagtcacccagactcccagccatcaggtcacacagatgggacaggaagtgatcttg120
cgctgtgtccccatctctaatcacttatacttctattggtacagacaaatcttggggcag180
aaagtcgagtttctggtttccttttataataatgaaatctcagagaagtctgaaatattc240
gatgatcaattctcagttgaaaggcctgatggatcaaatttcactctgaagatccggtcc300
acaaagctggaggactcagccatgtacttctgtgccatcctggatggagaaggttcaccc360
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cacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggac720
cgggccaagcccgtgacccagatcgtgtctgctgaggcctggggcagagccgattgcggc780
ttcaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctg840
ctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtccgccctggtgctgatggccatggtc900
aagcggaaggacagccggggcggttccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagca960
ggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgaagaagcacctgaccacgttcctggtgatt1020
ctttggctgtacttctaccggggcaacggcaaaaatcaggtggaacaaagcccccagagc1080
ctgattattctggagggcaagaactgcaccctccagtgtaattacaccgtgagccctttc1140
agcaacctgagatggtacaagcaggataccggaagaggacctgtgtctctgaccatcatg1200
acctttagcgagaacaccaagagcaacggcaggtatacagccacactggatgccgatacc1260
aagcagtcttctctgcacattaccgcctctcagctgtctgattctgccagctacatctgt1320
gtggtgtggggaggagataccgataagctgatctttggcacaggcaccagactgcaagtg1380
ttccctaacatccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggacagcaagagcagc1440
gacaagagcgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaag1500
gacagcgacgtgtacatcaccgataagtgcgtgctggacatgcggagcatggacttcaag1560
agcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaac1620
aacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgcgacgtgaag1680
ctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctcagcgtgatc1740
ggcttccggatcctgctgctgaaggtggccggcttcaacctgctgatgaccctgcggctg1800
tggtccagctga1812
<210>188
<211>603
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的tcr11号构建体;在β和α链恒定结构域中有半胱氨酸取代的β链-p2a-α链
<400>188
metglythrargleuphephetyrvalalaleucysleuleutrpala
151015
glyhisargaspalaglyilethrglnserproargtyrlysilethr
202530
gluthrglyargglnvalthrleumetcyshisglnthrtrpserhis
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sertyrmetphetrptyrargglnaspleuglyhisglyleuargleu
505560
iletyrtyrseralaalaalaaspilethrasplysglygluvalpro
65707580
aspglytyrvalvalserargserlysthrgluasnpheproleuthr
859095
leugluseralathrargserglnthrservaltyrphecysalaser
100105110
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115120125
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130135140
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145150155160
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180185190
gluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleu
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argvalseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcys
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glyaspvalglugluasnproglyprometlyslyshisleuthrthr
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pheleuvalileleutrpleutyrphetyrargglyasnglylysasn
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1510
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