荧光发生核酸分子以及荧光标记靶RNA的方法与流程

文档序号:26003698发布日期:2021-07-23 21:21阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种荧光发生核酸分子,其特征在于,包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列,

所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。

2.如权利要求1所述的荧光发生核酸分子,其中,所述接头序列的长度为20个碱基以上。

3.如权利要求1或2所述的荧光发生核酸分子,其中,所述接头序列未形成特定的立体结构。

4.如权利要求1至3中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合区在所述支架序列中插入有2个以上的所述荧光分子结合适体序列。

5.如权利要求4所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合区通过形成含有2个以上的环结构的茎环结构的单链核酸分子中的至少2个所述环结构被取代为所述荧光分子结合适体序列的结构来构成。

6.如权利要求1至5中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合适体序列含有:形成以g-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列;

所述茎环结构通过4~6个碱基的茎结构和4个碱基的环结构来构成。

7.如权利要求1至6中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合适体序列是broccoli、broccoli3或dbroccoli。

8.如权利要求1至5中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合区通过序列号16或17所示的碱基序列来构成。

9.如权利要求1至8中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述接头序列通过序列号18~20中任意之一所示的碱基序列来构成。

10.如权利要求1至9中任一项所述的荧光发生核酸分子,其含有4个以上的所述荧光分子结合适体序列。

11.如权利要求1至10中任一项所述的荧光发生核酸分子,其中,所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子是dfhbi家族的荧光分子。

12.一种荧光标记靶rna的方法,其是对靶rna进行荧光标记的方法;其中,使靶rna直接或间接地连接权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子之后,使其与所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子接触。

13.如权利要求12所述的荧光标记靶rna的方法,其中,所述靶rna是靶基因的转录产物,

向在所述靶基因的3’非翻译区内整合有编码所述荧光发生核酸分子的碱基序列的细胞内,导入所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子,并使所述靶基因的转录产物与所述荧光分子结合。

14.一种荧光标记靶rna的方法,其是对靶rna进行荧光标记的方法;其中,向含有靶rna的试样中混合:

使与所述靶rna的一部分杂交的探针直接或间接地连接于权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子而成的核酸分子,以及

所述核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子。

15.一种载体,其具有:

控制外源基因的表达的启动子;

位于所述启动子的下游并且用于插入所述外源基因的编码区的限制性酶切位点;以及

位于所述限制性酶切位点的下游的3’非翻译区,

所述3’非翻译区包含编码权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子的碱基序列。

16.一种接头序列的设计方法,其用以设计荧光发生核酸分子中的接头序列,所述荧光发生核酸分子包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列,所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列;其中,

将在1个所述荧光分子结合区的上游及下游连接有候选接头序列而成的rna序列作为评价用rna序列,

通过下述方式来设计所述接头序列:所述评价用rna序列中的所述荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由所述荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同,并且预测所述候选接头序列部分不取得立体结构。

17.如权利要求16所述的接头序列的设计方法,其中,所述候选接头序列是限制性酶切位点上添加有随机rna序列而成的序列。

18.如权利要求16或17所述的接头序列的设计方法,其中,所述候选接头序列的长度为20个碱基以上且80个碱基以下。

19.一种与荧光发生核酸分子结合的荧光分子所发出的荧光信号的检测方法,使权利要求11所述的荧光发生核酸分子结合dfhbi家族的荧光分子之后,连续照射所述dfhbi家族的荧光分子的激发光一定时间,检测从照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的亮度值,并将其作为与所述荧光发生核酸分子结合的所述dfhbi家族的荧光分子所发出的荧光信号。

20.如权利要求19所述的与荧光发生核酸分子结合的荧光分子所发出的荧光信号的检测方法,其中,按照向与所述dfhbi家族的荧光分子结合的所述荧光发生核酸分子连续照射所述激发光一定时间之后中断照射一定时间的照射循环来反复照射多次,

检测每个所述照射循环中连续照射时的照射开始时间点的荧光信号和照射结束时间点的荧光信号,

将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射开始时间点的荧光信号的亮度值平均化,

将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射结束时间点的荧光信号的亮度值平均化,

检测从平均化后的照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去平均化后的照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的值,并将其作为与所述荧光发生核酸分子结合的所述dfhbi家族的荧光分子的荧光信号。

21.一种筛选方法,其是针对权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子与和所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列结合的荧光分子之间的结合进行抑制的物质的筛选方法,

在存在所述荧光发生核酸分子和所述荧光分子的反应体系中,使抑制物质的候选物质共存,并测定所述荧光分子所发出的荧光信号,当得到的亮度值小于在所述候选物质不存在的情况下与所述荧光发生核酸分子结合的所述荧光分子所发出的荧光信号的亮度值时,选出所述候选物质作为所述抑制物质。

22.如权利要求21所述的筛选方法,其中,所述荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列是形成以g-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列;

所述荧光分子是dfhbi家族的荧光分子,

所述抑制物质具有开解g-quadruplex结构的活性。

23.如权利要求22所述的筛选方法,其中,向共表达所述荧光发生核酸分子和所述候选蛋白质的细胞中导入所述荧光分子并测定荧光信号,当得到的亮度值小于向仅表达所述荧光发生核酸分子的细胞中导入所述荧光分子而得到的荧光信号时,选出所述候选蛋白质作为具有开解g-quadruplex结构的活性的物质。


技术总结
本发明提供一种能够在细胞内特别是哺乳类的活细胞内使mRNA可视化的荧光发生RNA以及利用该荧光发生RNA的荧光标记靶RNA的方法。本发明提供一种荧光发生核酸分子,其特征在于,包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列,所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。

技术研发人员:冈田康志;有吉哲郎
受保护的技术使用者:国立研究开发法人科学技术振兴机构
技术研发日:2019.12.03
技术公布日:2021.07.23
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