一种用于降血压的芹菜素衍生物的制备的制作方法

本发明涉及一种用于降血压的芹菜素衍生物的制备以及用于抗炎、降血压和预防动脉粥样硬，属于生物医药领域。

技术背景

芹菜素(apigenin)，又称芹黄素，是天然存在的一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜和豆类中，其中芹菜中含量最高。芹菜素或芹菜鲜汁均有明显降压、降低血脂的作用。芹菜素、芹菜苷能保护脑细胞，增强学习，提高记忆，预防动脉硬化以及可诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成等的作用(历强，马建仓译。芹菜素的药理学研究进展[j].国外医学.中医中药分册，2003,25,(3):147)。

芹菜素与其他黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。目前，芹菜素在医药、食品等行业有一定的应用。但由于芹菜素的水溶性较差、肠道吸收少，导致其口服生物利用度较低、体内活性较低，在一定程度上限制了它的应用。在芹菜素的7位上接上不同数量的糖基基团，得到芹菜素衍生物，其水溶性大大提高。芹菜素衍生物不仅在服用计量上比芹菜素少，生物利用度比芹菜素的药效提高5倍以上。

异戊二烯基在生物合成中具有重要的作用。异戊烯基侧链的存在增加了黄酮类化合物的亲脂性和生物导向性，使其在生物体内更易透过细胞膜到达作用目标，大大提高了黄酮类化合物的药用价值。

技术实现要素：

芹菜素具有上述多种药用价值，但其单体难溶于水，作为药物直接使用时，在人体内的生物利用度低，难以充分发挥药物疗效。

本发明通过在芹菜素上引入异戊二烯基基团，进行烷基化反应，增加芹菜素的功效。解决异戊二烯基在黄酮化合物中应用较少的问题，增加芹菜素黄酮在抗炎、降血压和预防动脉粥样硬化等方面的功效。之后通过生物酶给已经烷基化的芹菜素添加糖基基团，得到高纯度、高质量、高生物活性的芹菜素衍生物。芹菜素衍生物的溶解度比芹菜素提高200倍以上，可以广泛的应用在食品、医药、化妆品等领域中。

本发明的芹菜素素衍生物(ⅰ)的合成步骤为：

1)将5g芹菜素，1～2倍当量的醋酸酐，3～5倍的哌啶，于100～140℃反应8～16h，产物为ⅱa，收率为90～92％；

2)将ⅱa5g和2～4倍的苯硫酚，0.3～1倍的咪唑，以n-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应5～16h，产物为ⅱb，收率为78～80％；

3)将ⅱb5g和3～5倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，thf溶液中，-20-0℃反应8～16h得到ⅱc，收率为71～75％；

4)将ⅱc5g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸铵，甲醇中回流18～24h得到添加异戊二烯基的目标产物ⅱd，收率为80～85％。

5)用生物酶处理ⅱd制备异戊二烯基芹菜素衍生物，其结构式如式(ⅰ)。

其中：n＝1～5；r＝glu、rha；r1＝h、ch3、ch2ch3。本发明的步骤5)的反应条件：反应缓冲液质量分数为0.05～1％的磷酸氢二钾——柠檬酸钾缓冲液或质量分数为0.9％的kcl缓冲液；缓冲液的ph7～10，反应温度控制35～75℃，反应时间控制4～24小时，反应完成之后，抽滤烘干得到芹菜素衍生物。

其中：n＝1～5；r＝glu、rha；r1＝h、ch3、ch2ch3。

本发明的芹菜素衍生物的制备步骤优选为：

1)将5g芹菜素，1.5～2倍当量的醋酸酐，3～5倍的哌啶，于120～130℃反应8～12h，产物为ⅱa。

2)将ⅱa5g和3～4倍的苯硫酚，0.3～1倍的咪唑，以n-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应8～10h，产物为ⅱb。

3)将ⅱb5g和3～5倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，thf溶液中，-5～0℃反应8～16h得到ⅱc。

4)将ⅱc5g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸铵，甲醇中回流18～24h得到目标产物ⅱd。

5)用生物酶处理ⅱd制备异戊二烯基芹菜素衍生物，其结构式如式(ⅰ-1)：

其中：n＝1～3。r＝glu、rha；r1＝h。

本发明在芹菜素上添加后，在糖基转移酶作用下给异戊二烯基芹菜素增加糖基，得到了糖基化的芹菜素衍生物，增加了芹菜素衍生物的溶解性。

本发明的酶包括：葡萄糖基转移酶和鼠李糖基转移酶中的一种或组合；添加的糖基为葡萄糖，udp-葡萄糖，鼠李糖，udp-鼠李糖。

本发明的芹菜素衍生物原料由山茶苷a、山茶苷b，芹菜素-7-o葡萄糖苷，芹菜素-7-o-葡萄糖-2-o-芹糖苷等植物提取物或/和生物酶转化衍生物。

本发明的一个目的是提供一种异芹菜素衍生物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种异芹菜素衍生物在降血糖方面的应用。

本发明的另一个目的是提供一种异芹菜素衍生物在抗炎方面的应用。

本发明的另一个目的是提供一种异芹菜素衍生物在预防动脉粥样硬化方面的应用。

本发明提供了一种药物组合物，本发明的药物组合包括上述的化合物及药学上可接受的盐、载体、赋形剂、稀释剂、媒介物或它们的组合。

有益效果：

本发明的芹菜素衍生物，既解决了芹菜素，芹菜素-7-o葡萄糖苷和芹菜素-7-o-葡萄糖-2-o-芹糖苷等溶解度差的问题，同时增强了芹菜素等的功效和生物利用度。

通过对比实验，异芹菜素衍生物在溶解度、生物利用度以及在抗炎、降血压和预防动脉粥样硬化方面效果优于芹菜素。

说明书附图

图1hplc法测定芹菜素衍生物在水中的溶解度。

图2芹菜素衍生物和芹菜素的溶解度对比图

图3芹菜素衍生物对血糖的影响。

图4芹菜素衍生物对血胰岛素的影响。

图5芹菜素衍生物的hplc图。

结合具体实施例子来具体说明本发明内容，但本发明要求保护的范围并不局限于下面的实施例子。

实施例1芹菜素衍生物的制备

1)将5g芹菜素，2倍当量的醋酸酐，3～5倍的哌啶，于100～140℃反应8～16h，产物为ⅱa，收率为90.3％；

2)将ⅱa5g和2～4倍的苯硫酚，0.8倍的咪唑，以n-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应10h，产物为ⅱb，收率为78.3％；

3)将ⅱb5g和3～5倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，thf溶液中，0℃反应8h得到ⅱc，收率为73.6％；

4)将ⅱc5g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸铵，甲醇中回流18～24h得到添加异戊二烯基的目标产物取代芹菜素衍生物(ⅱd)，收率为83.1％。

实施例2芹菜素衍生物的糖基化

以(ⅱd)为原料，反应缓冲液为质量分数为0.05％的磷酸氢二钾——柠檬酸钾缓冲液，缓冲液的ph8.5，反应温度65℃，反应时间控制18～24h。在反应体系中加入葡萄糖基转移酶，酶的质量分数为投入(ⅱd)的25～30％，得到芹菜素衍生物。在该反应体系中，得到芹菜素衍生物的摩尔收率84.2％，反应完成之后，抽滤烘干得到芹菜素衍生物。芹菜素衍生物hplc见图5。

实施例3芹菜素衍生物的溶解度测定

化合物溶解能力的大小直接影响到药物在溶液体系和细胞体系的应用。因为芹菜素衍生物在水溶液中稳定，所以我们利用紫外分光光度法对饱和状态的芹菜素衍生物的水溶液进行溶解度值的测定。本实验中，分别精密量取10mg、50mg、100mg、500mg、1000mg的根皮素，置于100ml容量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，得到一系列的浓度分别为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，5mg/ml，10mg/ml的根皮素标准溶液，用hplc分析，对283nm区间的特征峰进行积分，记录峰面积。以根皮素的浓度为纵坐标，峰面积为横坐标作图，并进行线性回归。标准曲线图如图1。

标准曲线方程1：y＝0.00231a+0.00966,r²＝0.9955为根皮素拟合曲线。

然后将过量的芹菜素衍生物加入到2ml水相中，置于25±1℃恒温振荡器上连续振荡72h，取出后转移到离心管中，8000r/min离心15min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，并用甲醇稀释至线性范围之内，采用hplc法测定芹菜素衍生物在水中的溶解度。结果如图2。

实施例4芹菜素衍生物药物的毒理学实验

在28±1℃的温度，70±5％的湿度条件下，选取7～8周龄，健康的清洁级nih小鼠20只雌雄各半，体重在20～22g。将饲料和水消毒，试验前和试验的观察期内，均按正常饲料条件饲养。

将芹菜素衍生物溶解在0.5％tween80中，浓度为500mg/ml，将该液体经口给药小鼠，给药剂量为0.4ml/20g小鼠体重。给药后观察1、4、8、12h，以后每12h观察一次。观察死亡情况，每天记录小鼠体重变化以及其他的症状。第10天，全部小鼠存活，断颈处死小鼠，取各器官进行病理检查。2.0g/kg剂量的芹菜素衍生物未见毒性反应。小鼠各器官病理检查正常，没有发现病变，10天内小鼠体重未见减轻。因此，说明本发明的芹菜素衍生物在口服给药动物时未见毒性。

实施例5芹菜素衍生物的抗炎效果

1、实验材料

实验动物来自广东省实验动物中心的spf级的5-6周雌性小鼠40只。芹菜素衍生物；tpa-99.99％，布洛芬，丙酮，二氯甲烷，dmso。

2、实验方法：

1)、将40只balb/c小鼠随机分成4组，分别是tpa对照组，丙酮空白组，布洛芬组，空白组和芹菜素衍生物组，每组10只小鼠，重复3次。

2)、芹菜素衍生物，布洛芬组，丙酮空白组，空白组和tpa对照组分别用15μl自配的溶液(二氯甲烷：丙酮＝80：20)均匀涂于小鼠两只耳朵。

3)、6min后，丙酮空白组用丙酮均匀涂于小鼠两只耳朵：而tpa对照组、布洛芬组，芹菜素衍生物则分别用15μltpa均匀涂于小鼠两只耳朵致炎处。

4)、6h后，将小鼠处死，随后及时剪下小鼠双耳，并用直径6mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片。

5)、称重，以丙酮空白组为阴性，将实验组耳片重量与空白组耳片重量的差异作为肿胀度。

6)、抑制率＝(1-给药组肿胀度/对照组的肿胀度)×100％。

3实验结果，芹菜素衍生物对tpa诱导的小鼠耳廓肿胀的抑制作用

为了研究芹菜素衍生物对tpa诱导的小鼠耳廓肿胀的抑制作用，选定芹菜素衍生物的工作浓度为0.75μm。通过对芹菜素衍生物对小鼠耳廓肿胀的抑制实验研究发现，单纯涂抹tpa诱导小鼠耳廓肿胀导致小鼠耳廓的平均重量由6.1mg增重至12.1mg，而且芹菜素衍生物对小鼠耳廓肿胀都显示不同程度的抑制作用，芹菜素衍生物的抑制率范围为69.3～81.4％。

实施例6芹菜素衍生物对营养性肥胖c57bl/6j小鼠糖脂代谢的影响

1.1实验材料

1.1.1实验动物及饲养环境

c57bl/6j小鼠，雄性，spf级，4周龄，由中山大学实验动物中心提供。许可证号：scxk(粤)2009～0004。饲养条件：温度20～25℃,湿度55±1％,12h/12h光照黑暗循环，24h自由饮食饮水。

1.2实验方法

1.2.l动物模型的制备、分组与给药

c57bl/6j雄性小鼠，随机选取10只为正常对照组，喂以普通标准饲料(饲料配方：粗蛋白18.5％，粗脂肪4.5％，碳水化合物61％。能量比：粗蛋白21％，粗脂肪11％，碳水化合物68％，总能最3.5kcal/g)，其余小鼠给予高糖高脂饲料(饲料配方：粗蛋白20％,粗脂肪38％，碳水化合物37％；能量比：蛋白17％，脂肪64％，碳水化合物19％，总能量6.7kcal/g)。喂养12周后，参考体重大于正常组的平均体重±1.78倍标准差和大于正常体重的20％的标准，选取合格的肥胖小鼠，按照体质量均一的原则分为模型组，阳性药辛伐他汀组.，芹菜素衍生物剂量组，每组10只，组间及组内动物分别作标记。正常对照组给予普通饲料，其余各组仍继续给予高糖高脂饲料喂养。芹菜素衍生物的给药剂量：芹菜素衍生物组共200mg/kg，用蒸馏水配制成所需浓度，现用现配，每天给药1次，连续给药14周。

辛伐他汀药物剂量3mg/kg体重，用研钵研细，蒸馏水配制成所需浓度，现用现配，每天给药1次，连续给药14周。

模型对照组与正常对照组每天灌服等体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药14周。

小鼠口服葡萄糖耐量实验(ogtt)和胰岛素糖耐量实验(itt)

小鼠口服葡萄糖耐量实验(ogtt)：小鼠禁食12h(不禁水)后，按各药物组相应剂量灌胃给药，正常组和模型组给予溶剂，每组6只。1h后，各组以2.5g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别于0、30、60、90、120、150、180、210min后取尾静脉血用血糖仪测定血糖值，绘制血糖曲线，如图3所示。

小鼠胰岛素耐量实验(itt)：于给药结束前1天，在禁食不禁水的情况下，腹腔注射给予各组小鼠0.75units/kg人胰岛素，于给药前(0min)以及给药后0、30、60、90、120、150、180、210min尾静脉取血，用血糖仪测定血糖值，绘制血糖曲线，如图4所示。

1.2.2血糖血脂的测定

给药14周后，动物禁食12h，尾静脉取血一滴，用血糖仪测定空腹血糖；然后眼眶静脉丛取血，室温静置30min以上，以3000rpm离心15min，分离血清，采用试剂盒测定血清总胆固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白、游离脂肪酸水平。

1.3实验结果各组小鼠给药期间体重变化

表1给药期间各组小鼠体重变化

上述结果表明：与正常组比较，模型组小鼠体重显著增加(p<0.01)。从给药第9周开始，辛伐他汀、芹菜素衍生物小鼠体重均开始下降，给药结束后辛伐他汀、芹菜素衍生物组小鼠体重，与模型组比较均有显著性降低(p<0.01)。给药后，芹菜素衍生物血中的血清总胆固醇、甘油三酯，高、低密度脂蛋白、游离脂肪酸水平明显的降低，在降血糖和预防粥样动脉硬化有比较好的效果。