一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1及其应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶1(lysozyme-1,lyz1)在毕赤酵母中的分泌表达方法及应用。

背景技术：

溶菌酶作为一种天然的抗菌剂，广泛存在于人及哺乳动物等的多种组织器官中，具有抗细菌、真菌及肿瘤等多种药理作用，具有生物相容性好、对组织无刺激性、无毒性的特点，已被制作为一种性质优良、杀伤病原微生物而不破坏机体的酶制剂。溶菌酶根据分子结构和来源不同分为6类：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶、c型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶)、g型(鹅型溶菌酶)和i型(无脊椎动物溶菌酶)，其中c型、g型和噬菌体溶菌酶最常见。目前为止，已经从反刍动物中鉴定出多种溶菌酶，但仍有许多种类的溶菌酶尚未被发现。而且对于已经制备的溶菌酶(例如，付世新等报道了“牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析”)，其作为饲料添加剂直接饲喂动物及作为抗生素的替代物的安全性是未知的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1，该溶菌酶lyz1的编码序列包括以下dna序列，或者所述溶菌酶lyz1的编码序列选自与以下dna序列具有95％以上同源性的来源于反刍动物基因组的序列：

优选的，所述反刍动物选自山羊，山羊的溶菌酶lyz1的氨基酸序列为：

kkfercelartlkrlgldgyrgvslanwmclarwesnyntratnynrgdkstdygifqinsrwwcndgktpravnacripcsallkdditqavacakrvvsdpqgikawvawrnkcqnkdlrsyvkgcrv。

优选的，所述溶菌酶lyz1具有体外抑制金黄色葡萄球菌的活性。

上述反刍动物溶菌酶lyz1在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：

1)构建毕赤酵母重组菌株

利用反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1的编码序列构建重组载体，将重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；

2)发酵培养

将毕赤酵母重组菌株通过发酵进行重组溶菌酶lyz1的诱导表达，得到发酵液；

3)收集发酵液上清，或将收集的发酵液上清浓缩，得到重组溶菌酶lyz1蛋白样品。

优选的，所述重组溶菌酶lyz1的氨基酸序列如seq.id.no.4所示。

上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1在制备抑制革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。

上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1在制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌药物中的应用。

上述反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1在制备饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过比较反刍动物基因组获得溶菌酶lyz1的编码序列，并建立了溶菌酶lyz1在毕赤酵母中的分泌表达方法，该溶菌酶lyz1具有抑制革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌)的作用，而且容易制备和分离纯化，可以作为安全的抗菌药物替代物，极具应用潜力。

附图说明

图1为实施例重组lyz1基因表达产物sds-page电泳图。

图2为实施例重组lyz1蛋白western-blot检测电泳图。

图3为实施例发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

(一)反刍动物特异溶菌酶lyz1在毕赤酵母中的分泌表达方法

1、构建毕赤酵母gs115重组菌株

1.1本发明利用反刍动物比较基因组结果，对反刍动物进化的新基因进行扫描，发现了一个新的反刍动物特异的溶菌酶，且在瘤胃中特异高表达。根据比较反刍动物基因组鉴定得到的溶菌酶lyz1氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，得到去除信号肽的重组山羊(caprahircus)溶菌酶lyz1基因序列(由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列设计完成时间为2018年12月)，如seq.id.no.1所示。山羊溶菌酶lyz1重组蛋白的氨基酸序列如下所示(以下第一个氨基酸k为序列氨基端)：

kkfercelartlkrlgldgyrgvslanwmclarwesnyntratnynrgdkstdygifqinsrwwcndgktpravnacripcsallkdditqavacakrvvsdpqgikawvawrnkcqnkdlrsyvkgcrvhhhhhh(参见seq.id.no.4)。

1.2利用设计的引物lyz1-f、lyz1-r(如seq.id.no.2、seq.id.no.3所示)，通过gibson连接方法(gibson,d.g.etal.，2009)，将重组山羊溶菌酶lyz1基因序列构建于ppic9k表达载体(购自invitrogen公司)，获得重组载体ppic9k-lyz1。

lyz1-f：

5'-tacgtagaattcaagagaaaaaagttcgaaagatgtgaattggct-3'

lyz1-r：

5'-atggtgatgatgattcgcggccgcttagtggtggtggtggtggtgaactcta-3'

gibson连接体系配制

(1)准备5×isobuffer，5×isobuffer组分配比如下表所示：

(2)配制mastermixture，mastermixture组分配比如下表所示：

(3)gibson组装体系配制及反应条件，gibson组装体系如下表所示：

其中，载体片段和插入片段的总量不能超过200ng。整体体积不能超过20μl，如果片段体积和原mix溶液体积已经达到20μl，可以不加超纯水。

gibson组装方案：将片段加入gibsonmix中后，补水至20μl，混匀，放入50℃环境内，反应1h后经过dmt消化，纯化，然后转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞内。也可不经过dmt消化，直接纯化后转化入大肠杆菌dmt感受态细胞内。ppic9k-lyz1质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。

1.3制备毕赤酵母gs115感受态细胞

在ypd固体平板上挑取p.pastorisgs115(西北工业大学实验室保存)单克隆，接种到5ml新鲜的ypd液体培养基中，30℃摇床培养。待菌体生长至od600～1.0，转接至100mlypd摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至od600～1.0，在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入100ml冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入50ml冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4ml冰山梨醇(1m)，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2ml冰山梨醇(1m)，重悬，收集备用。

1.4将待转化的ppic9k-lyz1质粒利用saci限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母gs115感受态细胞；取转化菌液均匀涂于md平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，即毕赤酵母gs115重组菌株，置于甘油管中冻干保存。

2、发酵培养

2.1将表达菌株(毕赤酵母gs115重组菌株)在md固体平板上进行划线活化，待菌落长出，挑取单克隆至5mlmd液体培养基中，30℃、200rpm摇床培养。

2.2菌体生长至od600～1.0，吸取500μl菌液转接至50ml的bmg培养基(添加100μl生物素)中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育2天。

2.33000g离心5min，收集菌体，转接至150mlbmm培养基(添加300μl生物素和750μl甲醇)中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育6天，每隔一天加入750μl甲醇作为诱导物。

2.4结束诱导后，8000g离心10min，收集发酵液上清。

以上步骤中涉及的培养基配方(相应的固体培养基均加入20g/l琼脂粉)：

1)ypd培养基(1l)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g、葡萄糖20g。

2)md培养基(1l)：硫酸铵10g、ynb3.4g、葡萄糖20g。

3)bmm培养基(1l)：ynb13.4g、0.1mol/lph6.0磷酸缓冲液100ml、硫酸铵10g、121℃灭菌15min后加入生物素2ml。

4)bmg培养基(1l)：在bmm基础上加入甘油10ml。

其中，以100ml计，500×生物素含0.02g生物素，过滤除菌，避光保存；以1l计，10×磷酸盐缓冲液(ph6.0)含磷酸二氢钾118g、磷酸氢二钾23g。

3、对发酵液中的重组蛋白进行鉴定，具体步骤如下：

3.1收集蛋白样品

发酵液上清或其浓缩液即可为蛋白样品，利用tricine-sds-page蛋白电泳和westernblot对发酵液上清或其浓缩液中的山羊溶菌酶lyz1重组蛋白进行鉴定。

3.2tricine-sds-page电泳

3.2.1试剂组分

尿素，甘油，四甲基乙二胺(temed)，β-巯基乙醇，过硫酸铵(aps)，甲醇，乙酸，乙酸铵，丙烯酰胺(ac)，双丙烯酰胺(bis)，十二烷基磺酸钠(sds)；

染色液(仅考染或银染)：50％甲醇，10％乙酸，100mm醋酸铵；

固定液：10％乙酸，0.025％考马斯亮蓝g-250；

显色液：0.03％甲醛，2％na2co3；

电泳液如下表所示：

3.2.2配制分离胶和浓缩胶

凝胶时间约2h。根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶：

注意：aps和temed需最后添加。

分离胶凝固后，在其上加入4％浓缩胶。

3.2.3蛋白制样

适量调整蛋白浓度以便蛋白可以加载在胶上，银染理想的蛋白浓度为0.1mg/ml，将蛋白样品与样品缓冲液混合，根据样品浓度加缓冲液。

3.2.4电泳条件

安装凝胶到电泳槽上，并添加阳极和阴极电泳液。

上样：在0.7×5mm上样孔里，添加10μl样品-缓冲液混合物。

设置跑胶电压：开始以30v电压跑胶，当蛋白样品跑分离胶后可将电压调至90v，胶会因为电压原因升温，但必须控制在35～40℃，快结束时，可以适当提高电压来缩短电泳时间，一般常规时间跑的胶比过夜跑胶的结果好，尤其是使用10％分离胶。

3.2.5银染

将胶放入染色液里孵育，孵育时间取决于胶的浓度：0.7mm10％的分离胶孵育15min；0.7mm16％的分离胶孵育30min；1.6mm16％的分离胶孵育60min。孵育后，用清水清洗两遍，水洗时间和孵育时间一样。用0.005％的na2s2o3将胶进行曝光，曝光时间与定影液里孵育时间一样。将胶放入0.1％硝酸银溶液中孵育，孵育时间与定影液里孵育时间一样。水洗两遍。将胶放入显色液里显色，时间为1～2min。用50mm的edta终止显色，时间15～60min。

3.2.6观察

在凝胶成像仪或者化学发光仪中观察条带情况。结果表明：出现目标分子量大小的明显蛋白条带(浓度较高)，大小约为16kd，同时，几乎没有其他杂质条带，具体见图1。

3.3转膜

3.3.1试剂

tbst配方：nacl8.8g、tris-hcl(ph8.0)20ml、吐温-200.5ml，加水至1l。

转膜液配方：tris3g、glycine14.4g、甲醇200ml，加水至1l。

封闭液配方：5％脱脂奶粉溶液(1g奶粉溶于20ml的tbst中)。

pvdf膜(固相支持物)处理：甲醇激活1min。

海绵滤纸须在转膜液中浸泡15min。

3.3.2转膜条件

100v，90min(需加冰，提前冷冻冰袋)

3.3.3bctp/nbt显色液配制(试剂盒，按顺序加入)：

40μl25×nbt

1ml1×ap

40μl25×bctp

3.3.4转膜操作

按照以下顺序夹紧转膜板：

海绵滤纸-胶-pvdf膜-海绵滤纸-胶-膜-海绵滤纸(若只有一块胶需要用海绵补足厚度)；

把转膜液倒入槽中，加入适量的冰，100v，90min；

转膜液回收，放置于4℃冰箱。用镊子夹住膜，放入培养皿中用tbst溶液洗3次，每次5min。

3.4封闭

用5％的脱脂奶粉溶液封膜1h，常温(培养皿中摇动，80rpm左右)；奶粉回收，用tbst溶液洗3次，每次5min。

3.5孵育

3.5.1加入一抗(具体是鼠源his-tag抗体，购买自索莱宝)，比例1:5000～1:50000均可(例如，100mltsbt中加入5μl抗体，比例为1:20000)；

3.5.2一抗回收，用tbst冲洗三次，每次5min；

3.5.3加入二抗(具体是山羊抗小鼠igg，购买自索莱宝)，比例1:1000～1:3000均可(例如，20mltsbt中加入10μl抗体，比例为1:2000)；

3.5.4二抗回收，用tbst冲洗三次，每次5min

3.6显色

使用显色试剂盒，工作液平铺在膜上，37℃温育，20～30min。将膜浸入去离子水中，预染25min。在化学发光仪或者凝胶成像仪中观察结果。结果表明：毕赤酵母gs115重组菌株经诱导后有单一条带的目的蛋白，表明lyz1基因在毕赤酵母gs115重组菌株中得到了表达，具体见图2。

(二)反刍动物特异溶菌酶lyz1抑菌活性

利用lb琼脂糖培养基以及金黄色葡萄球菌(atcc29213)和大肠杆菌(atcc25922)进行抑菌测试。将lb琼脂培养基灭菌后分别混入金黄色葡萄球菌或大肠杆菌，倒平板，待培养基冷却凝固后，先在每个平板上打两个直径1cm的孔，分别在每个孔中加入100μl发酵上清液和含空载体的酵母培养液(阴性对照)，置于37℃培养箱中，24h后观察抑菌圈的生长情况，并拍照。

其中，所述lb琼脂培养基配方(g/l)：氯化钠10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、琼脂粉15，ph7.2±0.2，121℃高压灭菌30min。

由图3可知，本发明构建的毕赤酵母gs115重组菌株，其分泌表达产物(经鉴定确认为上述山羊溶菌酶lyz1的重组蛋白)对金黄色葡萄球菌具有较高的抑菌活性，而对大肠杆菌不具备抑制作用(大肠杆菌中未出现抑菌圈)。

(三)反刍动物特异溶菌酶lyz1优点

本发明利用ppic9k载体与溶菌酶lyz1基因序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株，通过优化甲醇诱导、表达的条件，高效表达了具有生物活性的以山羊溶菌酶lyz1为代表的重组蛋白。本发明的溶菌酶lyz1蛋白序列(或对应dna序列)与现有报道的反刍动物的其他溶菌酶序列相似度在80％～92％，在反刍动物瘤胃组织中特异高表达，由于来源于瘤胃，因此在作为饲料添加剂或抗生素替代物的安全性上具有相应的保障。

<110>西北农林科技大学

<120>一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1及其应用

<160>4

<210>1

<211>411

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaaaagttcgaaagatgtgaattggctagaaccttgaagagattgggtttagatggttac60

agaggtgtttctttggctaactggatgtgtttggctagatgggaatctaactataacact120

agagctaccaactacaacagaggtgataagtctactgattacggtatcttccagatcaat180

tctagatggtggtgtaacgatggtaaaactccaagagctgttaacgcttgtagaattcca240

tgttctgctttgttgaaggatgatattactcaagctgttgcttgcgctaagagagttgtt300

tctgatccacaaggtattaaggcttgggttgcttggagaaacaaatgccaaaacaaggac360

ttgagatcctacgttaagggttgtagagttcaccaccaccaccaccactaa411

<210>2

<211>45

<212>dna

<213>lyz1-f

<400>2

tacgtagaattcaagagaaaaaagttcgaaagatgtgaattggct45

<210>3

<211>52

<212>dna

<213>lyz1-r

<400>3

atggtgatgatgattcgcggccgcttagtggtggtggtggtggtgaactcta52

<210>4

<211>136

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

lyslysphegluargcysgluleualaargthrleulysargleugly

151015

leuaspglytyrargglyvalserleualaasntrpmetcysleuala

202530

argtrpgluserasntyrasnthrargalathrasntyrasnarggly

354045

asplysserthrasptyrglyilepheglnileasnserargtrptrp

505560

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65707580

cysseralaleuleulysaspaspilethrglnalavalalacysala

859095

lysargvalvalseraspproglnglyilelysalatrpvalalatrp

100105110

argasnlyscysglnasnlysaspleuargsertyrvallysglycys

115120125

argvalhishishishishishis

130135