新型HPK1抑制剂及其制备方法和应用与流程

新型hpk1抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及小分子药物领域，具体地，本发明涉及一种激酶抑制剂及其制备和用途。


背景技术：

2.t细胞和b细胞和树突状细胞(dcs)是人体免疫系统用于抵抗外来入侵者如病毒和细菌以及自身感染细胞或异常细胞如癌变细胞等的强有力武器。而人体存在一套复杂且精密的调控系统用于确保免疫系统的正常运行。当人体中出现癌变细胞的时候，如果免疫系统无法将其完全杀死，这些免疫逃逸的癌细胞异常增殖就会形成肿瘤。传统肿瘤治疗主要通过手术、放疗、化疗和分子靶向药物。然而，对于许多形式多样的肿瘤或癌症，手术切除往往并不是可行的选择。而放射疗法和化疗在靶向肿瘤细胞的同时，也会损害部分健康细胞。肿瘤细胞易于发生突变，并且可能对特异靶向肿瘤细胞的药物产生耐药性，使得癌症治疗困难重重。近年来利用患者自身的免疫系统来克服肿瘤细胞所采用的免疫逃逸策略，并增强机体抗肿瘤免疫力是一种新型的癌症治疗策略。其中一种策略是通过抑制通常起维持外周耐受作用的免疫反应的负调控因子，使肿瘤抗原被识别为非自身抗原，从而克服肿瘤细胞免疫逃逸。造血祖细胞激酶1(hpk1)又称map4k1(map4k家族成员)，是一个树突状细胞(dcs)、t细胞和b细胞活化反应的负调控因子，抑制其活性可以针对性地增强机体抗肿瘤免疫力。hpk1主要由造血细胞，包括早期造血祖细胞表达。在t细胞中，hpk1被认为能够通过磷酸化下游slp76蛋白的ser376位点和gads蛋白的thr254位点并招募14-3-3蛋白来降解这些蛋白从而降低信号微团簇的持久性，起到负调控t细胞活化的作用。hpk1还可以通过响应通常由肿瘤分泌的前列腺素(pge2)而被激活，从而有助于肿瘤细胞从免疫系统逃逸。并且hpk1还能抑制ap-1，而ap-1在肿瘤形成及发展过程中在促进细胞增殖、抑制分化、促进肿瘤细胞的侵袭和转移等过程中发挥作用。针对性的破坏hpk1激酶的等位基因可以使t细胞在tcr应答中提高th1细胞因子(il-2，ifnγ等)的产生。hpk1在免疫中具有多种作用，并与自身免疫性疾病，癌症和炎症反应的发病机理有关。hpk1激酶-/-的t细胞增殖相对于单体野生型快很多，并且转染过hpk1激酶-/-t细胞的老鼠能抵抗癌肿瘤的生长，而且失去hpk1激酶的树突细胞(dcs)与野生型相比具有更好的抗原提呈能力，能更好地表现出抗肿瘤免疫应答。此外，动物实验研究表明，hpk1的抑制和pd-1/pd-l1抗体药物具有明显的协同抗肿瘤活性。因此，hpk1激酶在疾病治疗特别是癌症治疗中具有关键作用。
3.目前针对该靶点尚未有药物上市，为了满足未来临床的巨大需求，我们希望通过设计开发出具有选择性和高活性的小分子hpk1抑制剂，为免疫相关疾病特别是肿瘤治疗提供新型的口服类药物，单独用药或者联合肿瘤化疗，放疗，肿瘤靶向药，其他肿瘤免疫治疗剂(小分子化合物及抗体)以及肿瘤疫苗等。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种具有选择性和高活性的小分子hpk1抑制剂。
5.本发明的第一方面，提供了一种如下式i所示的化合物，或其药学上可接受的盐、光学异构体或水合物：
[0006][0007]
其中，
[0008]
x和y各自独立地选自下组：无、nr、s、o、-nr-c(＝o)r-、-c(＝o)nr-、-nr-c(＝o)c(＝o)nr-、-nr-c(＝o)nr-、-nr-c(＝s)nr-、-nr-c(＝o)nrch
2-、-nr-c(＝s)nrch
2-，其中，所述的r选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；
[0009]
m1、m2或m3各自独立地为ch或n；且当所述的m1或m2为ch时，所述的可以位于所述的m1或m2上(即此时m1或m2为c)；
[0010]
a环选自下组：c3-c8环烷基、5-12元的杂环基、6-10元芳环，或具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元的杂芳环，或a为h；
[0011]
m为1、2、3或4；
[0012]
n为0、1、2、3、4或5；
[0013]
p为0、1或2；
[0014]
ra选自下组：卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基、或其中，所述的环b为c3-c8环烷基、6-10元芳基、5-10元的杂芳基、具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-10元杂环基；
[0015]
各个r1、r2、r3和r4各自独立地选自下组：h、卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基、取代或未取代的c6-c10芳基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、r
7-c(＝o)-、r
7-c(＝o)具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基-、r
8-s(＝o)
2-、r9r
10
n-c(＝o)-、r9r
10
n-c(＝o)nr-、r
11
r
12
n-s(＝o)
2-、r7o-、r
8-s(o)2nr-；
[0016]
各个r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
各自独立地选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；或所述的r9和r
10
或r
11
和r
12
与其相连的氮原子共同构成取代或未取代的具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；
[0017]
除非特别说明，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个
等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基、卤代的c3-c8环烷基、甲基砜基、氧代(＝o)、-cn、羟基、-nh2、-nhs(o)2ch3、c1-c6胺基、羧基、c1-c6酰胺基(-c(＝o)-n(rc)2或-nh-c(＝o)(rc)，rc为h或c1-c5的烷基)、或取代或未取代的选自下组的基团：c1-c6烷基、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基、-(ch2)-c6-c10芳基、-(ch2)-(具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基)、-(具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元亚杂芳基)-(c1-c6烷基)、具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基(包括单环、螺环、桥环或并环)，且所述的取代基选自下组：卤素、c1-c6烷基、c1-c6亚烷基-oh、c1-c6烷氧基、氧代、-s(o)2ch3、-cn、-oh、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、-c(o)chnh2、-c(o)choh；
[0018]
且所述的式i化合物中，各个手性中心为r构型或s构型。
[0019]
在另一优选例中，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基、卤代的c3-c8环烷基、甲基砜基、氧代(＝o)、-cn、羟基、-nh2、c1-c6胺基、羧基、或取代或未取代的选自下组的基团：c1-c6烷基、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基、且所述的取代基选自下组：卤素、c1-c6烷基、c1-c6亚烷基-oh、c1-c6烷氧基、氧代、-s(o)2ch3、-cn、-oh、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、-c(o)chnh2、-c(o)choh。
[0020]
在另一优选例中，所述的a环选自下组：其中，
[0021]
z选自下组：nh、o或s；
[0022]
q为0、1或2；
[0023]
re和rf各自独立地选自下组：h、cn、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、苯基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；或所述的re和rf与其相连的原子共同构成c3-c8环烷基、或取代或未取代的具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；
[0024]
且所述的还可以进一步被1或2个r2取代。
[0025]
在另一优选例中，所述的a环选自下组：c3-c8环烷基、苯环、5-6元的杂环、或具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元的杂芳环；且所述的r2选自下组：h、卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基。
[0026]
在另一优选例中，所述的x为o。
[0027]
在另一优选例中，所述的y为nh。
[0028]
在另一优选例中，所述的y为-nh-c(o)nhch
2-。
[0029]
在另一优选例中，所述的y为-nh-c(s)nhch
2-。
[0030]
在另一优选例中，所述的b环选自下组：苯环、3-12元杂环基、5-6元的杂芳环、含有苯环结构单元的8-15元二环并环、含有5-6元杂芳环结构单元的8-15元二环并环；其中，所述的r4选自下组：h、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基、r9r
10
n-c(＝o)-、r9r
10
n-c(＝o)nr-、r
11
r
12
n-s(＝o)
2-、r7o-、r
8-s(o)2nr-；其中，所述的取代优选包括一个或多个选自下组的基
团：-nh2、取代或未取代的c1-c6烷基。
[0031]
在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式ii-1或ii-2所示的结构：
[0032][0033]
其中，
[0034]
所述的ra独立地选自下组：卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基；
[0035]
在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式iii所示的结构：
[0036][0037]
其中，
[0038]
所述的r4选自下组：h、卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、r9r
10
n-c(＝o)-、r
8-s(＝o)
2-、r9r
10
n-c(＝o)-、r9r
10
n-c(＝o)nr-、r
11
r
12
n-s(＝o)
2-、r7o-、r
8-s(o)2nr-；其中，所述的r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
各自独立地选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；或所述的r9和r
10
或r
11
和r
12
与其相连的氮原子共同构成取代或未取代的具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-12元杂环基。
[0039]
在另一优选例中，所述的式i化合物选自下组：
[0040]
[0041]
[0042][0043]
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括(1)如本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体或互变异构体，或其药学上可接受的盐、水合物或
溶剂化物；(2)药学上可接受的载体。
[0044]
本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体或互变异构体，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，或如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗与hpk1激酶的活性或表达量相关的疾病的药物组合物。
[0045]
本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物与其他肿瘤免疫治疗剂的联合肿瘤化疗方案，所述的其他肿瘤免疫治疗剂选自下组：小分子化合物及抗体(包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、tim-3、tgf-β及其受体、lag3拮抗剂或tlr4、tlr7、tlr8、tlr9、sting激动剂等)、放疗方案、肿瘤靶向药、肿瘤疫苗。
[0046]
在另一优选例中，所述的其他肿瘤免疫治疗剂，可在所述药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其他已知疗法共施用。也可用作疫苗佐剂。
[0047]
本发明的第五方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物与car-t免疫疗法相结合在癌症免疫疗法中的应用。
[0048]
在另一优选例中，所述的疾病包括但不限于癌症、转移性癌症、炎症和自身免疫相关疾病。
[0049]
在另一优选例中，所述疾病包括但不限于：淋巴瘤，母细胞瘤，髓母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，滑膜细胞肉瘤，神经内分泌肿瘤，类癌肿瘤，胃泌素瘤，胰岛细胞癌，间皮瘤，神经鞘瘤，听神经瘤，脑膜瘤，腺癌，黑色素瘤，白血病或淋巴样恶性肿瘤，鳞状细胞癌，上皮鳞状细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，腺癌肺癌，肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，转移性乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肛门癌，阴茎癌，梅克尔细胞癌，食管癌，胆道肿瘤，头颈部癌，血液恶性肿瘤，鼻咽癌，多发性骨髓瘤，大场绒毛腺瘤，非霍奇金淋巴瘤，骨癌，睾丸癌，霍奇金病，精元细胞瘤，口腔癌，脑癌，皮肤癌，乳腺导管癌，肾盂癌，肾母细胞瘤，食管腺瘤，视网膜细胞瘤，神经胶质瘤，神经纤维瘤，胃肠道间质瘤，原位癌，子宫内膜癌和骨髓增生异常综合征等。
[0050]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
[0051]
本发明人经过长期而深入的研究，设计并合成了一类新型hpk1激酶抑制剂。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0052]
术语
[0053]
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0054]
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，
99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0055]
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
[0056]
定义
[0057]
如本文所用，术语“烷基”包括直链或支链的烷基。例如c
1-c8烷基表示具有1-8个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。
[0058]
如本文所用，术语“烯基”包括直链或支链的烯基。例如c
2-c6烯基指具有2-6个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。
[0059]
如本文所用，术语“炔基”包括直链或支链的炔基。例如c
2-c6炔基是指具有2-6个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、或类似基团。
[0060]
如本文所用，术语“c
3-c8环烷基”指具有3-8个碳原子的环烷基。其可以是单环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或类似基团。也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。
[0061]
如本文所用，术语“c
1-c8烷氧基”是指具有1-8个碳原子的直链或支链的烷氧基；例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
[0062]
如本文所用，术语“具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基”是指具有3-12个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的饱和或部分饱和的环状基团。其可以是单环，也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。具体的实例可以为氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢-2h-吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、吗啉基和吡咯烷基等。
[0063]
如本文所用，术语“c
6-c
10
芳基”是指具有6-10个碳原子的芳基，例如，苯基或萘基等类似基团。
[0064]
如本文所用，术语“具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基”指具有5-10个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的环状芳香基团。其可以是单环，也可以是稠环形式。具体的实例可以为吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基以及(1,2,4)-三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基等。
[0065]
除非特别说明，否则本发明的基团均可被选自下组的取代基所取代：卤素、腈基、硝基、羟基、氨基、c
1-c6烷基-胺基、c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、c
1-c6烷氧基、卤代c
1-c6烷基、卤代c
2-c6烯基、卤代c
2-c6炔基、卤代c
1-c6烷氧基、烯丙基、苄基、c
6-c
12
芳基、c
1-c6烷氧基-c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基-羰基、苯氧羰基、c
2-c6炔基-羰基、c
2-c6烯基-羰基、c
3-c6环烷基-羰基、c
1-c6烷基-磺酰基等。
[0066]
如本文所用，“卤素”或“卤原子”指f、cl、br、和i。更佳地，卤素或卤原子选自f、cl和br。“卤代的”是指被选自f、cl、br、和i的原子所取代。
[0067]
除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构型异构体))：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体等。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构型异构体)的混合物都属于本发明的范围。
[0068]
如本文所用，术语“互变异构体”表示具有不同能量的结构同分异构体可以超过低能垒，从而互相转化。比如，质子互变异构体(即质子移变)包括通过质子迁移进行互变，如
1h-吲唑与2h-吲唑。化合价互变异构体包括通过一些成键电子重组而进行互变。
[0069]
如本文所用，术语“溶剂合物”是指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。
[0070]
式i化合物
[0071]
本发明提供了一种如下式i所示的化合物：
[0072][0073]
其中，
[0074]
x和y各自独立地选自下组：无、nr、s、o、-nr-c(＝o)r-、-nr-c(＝o)nr-、-c(＝o)nr-、-nr-c(＝o)c(＝o)nr-、-nr-c(＝s)nr-、-nr-c(＝o)nrch
2-、-nr-c(＝s)nrch
2-，其中，所述的r选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；
[0075]
m1、m2或m3各自独立地为ch或n；且当所述的m1或m2为c时，所述的可以位于所述的m1或m2上；
[0076]
a环选自下组：c3-c8环烷基、5-12元的杂环基、6-10元芳环，或具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元的杂芳环，或a为h；
[0077]
m为1、2、3或4；
[0078]
n为0、1、2、3、4或5；
[0079]
p为0、1或2；
[0080]
ra选自下组：卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基、或其中，所述的环b为c3-c8环烷基、6-10元芳基、5-10元的杂芳基、具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-10元杂环基；
[0081]
各个r1、r2、r3和r4各自独立地选自下组：h、卤素、cn、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基、取代或未取代的c6-c10芳基、取代或未取代的具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、r
7-c(＝o)-、r
7-c(＝o)具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基-、r
8-s(＝o)
2-、r9r
10
n-c(＝o)-、r9r
10
n-c(＝o)nr-、r
11
r
12
n-s(＝o)
2-、r7o-、r
8-s(o)2nr-；
[0082]
各个r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
各自独立地选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的具有1-3个选自
下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；或所述的r9和r
10
或r
11
和r
12
与其相连的氮原子共同构成取代或未取代的具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-12元杂环基；
[0083]
除非特别说明，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基、卤代的c3-c8环烷基、甲基砜基、氧代(＝o)、-cn、羟基、-nh2、-nhs(o)2ch3、c1-c6胺基、羧基、c1-c6酰胺基(-c(＝o)-n(rc)2或-nh-c(＝o)(rc)，rc为h或c1-c5的烷基)、或取代或未取代的选自下组的基团：c1-c6烷基、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基、-(ch2)-c6-c10芳基、-(ch2)-(具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基)、-(具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元亚杂芳基)-(c1-c6烷基)、具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-12元杂环基(包括单环、螺环、桥环或并环)，且所述的取代基选自下组：卤素、c1-c6烷基、c1-c6亚烷基-oh、c1-c6烷氧基、氧代、-s(o)2ch3、-cn、-oh、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、-c(o)chnh2、-c(o)choh；
[0084]
且所述的式i化合物中，各个手性中心为r构型或s构型。
[0085]
在另一优选例中，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基、卤代的c3-c8环烷基、甲基砜基、氧代(＝o)、-cn、羟基、-nh2、c1-c6胺基、羧基、或取代或未取代的选自下组的基团：c1-c6烷基、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基、且所述的取代基选自下组：卤素、c1-c6烷基、c1-c6亚烷基-oh、c1-c6烷氧基、氧代、-s(o)2ch3、-cn、-oh、c6-c10芳基、具有1-3个选自n、s和o的杂原子的3-10元杂芳基、-c(o)chnh2、-c(o)choh。
[0086]
优选地，所述的x、y、a、b、m1、m2、m3、m、n、p、q、ra、re、rf、r1、r2、r3、r4、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
各自独立地为各个实施例中具体化合物中的对应基团。
[0087]
本发明的化合物可以作为hpk1激酶抑制剂，在优选的实施例中，为hpk1激酶选择性抑制剂。
[0088]
式i化合物的制备
[0089]
本发明的式i化合物可以通过以下示例性的方法制备：
[0090]
方法1:
[0091][0092]
用五元并六元化合物进行取代、偶联反应，经取代基修饰后得到式i化合物。
[0093]
其中，一类a为不饱和环的化合物可以通过方法2制备：
[0094]
[0095]
用ia化合物进行环合反应，得到式i'化合物。
[0096]
药物组合物和施用方法
[0097]
由于本发明化合物具有优异的hpk1激酶的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于预防和/或治疗与hpk1激酶活性或表达量相关的疾病(例如，癌症)。
[0098]
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0099]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0100]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0101]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0102]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0103]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0104]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0105]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0106]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0107]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0108]
联合给药时，所述药物组合物还包括与一种或多种其他药学上可接受的化合物。该其他药学上可接受的化合物中的一种或多种可与本发明的化合物同时、分开或顺序地给药。
[0109]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0110]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0111]
中间体a1合成：
[0112][0113]
5-碘-4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶
[0114][0115]
在室温下，向4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(10克，65.12毫摩尔)的n,n-二甲基甲酰胺(400毫升)溶液中分批加入n-碘代琥珀酰亚胺(15.7克，69.77毫摩尔)。将反应液于室温搅拌过夜，反应经lcms检测。反应液浓缩至干，残留物悬浮在250毫升10％的亚硫酸钠水溶液中，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到白色固体5-碘-4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(12.6克，纯度：90％，收率：69.3％)。ms(esi):m/z＝280.0，282.0[m+h]
+
.
[0116]
4-氯-5-碘-7-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶
[0117][0118]
在冰水浴下，将60％的氢化钠(2.53克，6.22毫摩尔)分批加到5-碘-4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(12.6克，45.16毫摩尔)的n,n-二甲基甲酰胺(120毫升)中，该反应混合物于0度下继续搅拌30分钟。然后将2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(9.77克，58.71毫摩尔)的n,n-二甲基甲酰胺(10毫升)滴加至反应液中，加完后，反应混合物在室温下搅拌1.5小时，反应经lcms检测。将反应液倒入500毫升水中，用500毫升乙醚提取，有机相用无水硫酸钠干
燥，抽滤，滤液浓缩，残留物通过正相硅胶层析柱，用溶剂(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)洗脱,得到的白色固体中间体4-氯-5-碘-7-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(14.0克，纯度：90％，收率：75.7％)。ms(esi):m/z＝410.1,412.1[m+h]
+
.
[0119]
叔丁基(4-((5-碘-7-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二氟苯基)氨基甲酸酯
[0120][0121]
向4-氯-5-碘-7-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.00克，4.88毫摩尔)和叔丁基(3,5-二氟-4-羟基苯基)氨基甲酸酯(中间体b1，1.26克，5.13毫摩尔)的二甲基亚砜(20毫升)溶液中加入碳酸钾(1.35克，9.76毫摩尔)。然后将该混合物加热至110度搅拌2小时。反应经lcms检测，待反应结束后将反应冷却至室温。将反应液倒入60毫升水中，该混合物经乙酸乙酯(20毫升
×
3)萃取。合并的有机相依次经水(20毫升
×
3)，饱和食盐水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。该粗品经快速硅胶分离(石油醚:乙酸乙酯＝5:1),得到的白色固体叔丁基(4-((5-碘-7-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二氟苯基)氨基甲酸酯(2.43克，收率：80.5％)。ms(esi):m/z＝619.0[m+h]
+
.
[0122]
3,5-二氟-4-((5-碘-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺
[0123][0124]
将(4-((5-碘-7-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二氟苯基)氨基甲酸酯(2.27克，3.67毫摩尔)的1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇溶液(30毫升)加入到150ml的密封管中。将该反应液加热至110度，搅拌1小时。反应经lcms检测，待反应结束后，待反应液冷却至室温。减压浓缩得粗品，该粗品经快速硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)分离得浅黄色3,5-二氟-4-((5-碘-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(1.6克，收率：84.1％)。ms(esi):m/z＝618.9[m+h]
+
.
[0125]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.42(s,1h),7.40(s,1h),6.36
–
6.28(m,2h),5.60(s,2h),3.85(s,2h),3.59
–
3.50(m,2h),1.26(t,j＝7.1hz,1h),0.97
–
0.88(m,2h),-0.04(s,9h).
[0126]
中间体a2合成：
[0127][0128]
4-氯-5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶
[0129][0130]
在氮气保护下，向4-氯-5-碘-7-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.10克，2.68毫摩尔)，甲基2,2-二氟-2-(氟磺酰)乙酸酯的无水n,n-二甲基甲酰胺(10毫升)溶液中加入碘化亚铜(1.02克，5.37毫摩尔)固体。将该反应液加热至100度，搅拌2小时。反应经lcms检测，待反应结束后，将反应液冷却室温。将反应液倒入30毫升水中，该混合物经乙酸乙酯(15毫升
×
3)萃取。合并的有机相依次经水(20毫升
×
3)，饱和食盐水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。该粗品经快速硅胶分离(石油醚:乙酸乙酯＝6:1),得到的白色固体4-氯-5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(670毫克，纯度：86％，收率：61％)。ms(esi):m/z＝352.0[m+h]
+
.
[0131]
叔丁基(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯
[0132][0133]
向4-氯-5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(450毫克，1.28毫摩尔)和叔丁基(3,5-二氟-4-羟基苯基)氨基甲酸酯(中间体b1，345毫克，1.41毫摩尔)的二甲基亚砜(5.0毫升)溶液中加入无水碳酸钾(353毫克，2.56毫摩尔)。然后将该混合物加热至110度搅拌2小时。反应经lcms检测，待反应结束后将反应冷却至室温。将反应液倒入20毫升水中，该混合物经乙酸乙酯(10毫升
×
3)萃取。合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。该粗品经快速硅胶分离(石油醚:乙酸乙酯＝3:1),得到的白色固体叔丁基(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯(430毫克，收率：60％)。ms(esi):m/z＝561.1[m+h]
+
.
[0134]
3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺
[0135][0136]
将((3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-7h吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯(330毫克，0.59毫摩尔)的1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇溶液(8毫升)加入到20毫升的微波中。将该反应液加热至110度，搅拌1小时。反应经lcms检测，待反应结束后，待反应液冷却至室温。减压浓缩得粗品，该粗品经快速硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯＝3:2)分离得浅黄色固体3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(252毫克，收率：92.9％)。ms(esi):m/z＝461.0.[m+h]
+
.
[0137]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.52(s,1h),7.67(s,1h),6.33(d,j＝9.1hz,2h),5.66(s,2h),3.64
–
3.56(m,2h),0.99
–
0.90(m,2h),-0.01
–-
0.04(m,9h).
[0138]
中间体b1合成：
[0139][0140]
2,6-二氟-4-硝基苯酚
[0141][0142]
将2,6-二氟苯酚(1.7克，13毫摩尔)溶于醋酸中(20毫升)，滴加入浓硝酸(1.9克，20毫摩尔)。反应液在70度下反应2小时。tlc检测反应完成。将反应液倒入冰水中(100毫升)，用乙酸乙酯萃取(100毫升
×
2)。合并的有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。该粗品经硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)分离纯化，得到黄色固体2,6-二氟-4-硝基苯酚(1.57克，收率：69％)。
[0143]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.95(dd,j＝6.9,2.2hz,2h).
[0144]
叔丁基(3,5-二氟-4-羟基苯基)氨基甲酸酯
[0145][0146]
在氩气保护下，向2,6-二氟-4-硝基苯酚(1.57克，9毫摩尔)和二-叔-丁基二碳酸酯(2.9克，13mmol)甲醇溶液(30毫升)中加入pd/c(500毫克)。将该反应液用氢气置换三次后，于室温条件下在氢气(15psi)气氛中搅拌反应16小时。tlc检测反应完成。反应液经过滤，滤液经减压浓缩得粗。该粗品经硅胶柱(油醚:乙酸乙酯＝4:1)分离纯化，得到灰色固体(1.3克，收率：59％)。
[0147]1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.64(s,1h),9.40(s,1h),7.12(d,j＝9.6hz,2h),1.46(s,9h).
[0148]
实施例1：(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0149]
3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺
[0150][0151]
在氩气保护下，向3,5-二氟-4-((5-碘-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(a1，400毫克，0.945毫摩尔)，(2-氟-4-甲氧苯基)硼酸(178毫克，1.04毫摩尔)，磷酸钾(401毫克，1.89毫摩尔)和1,4-二氧六环(6.0毫升)/水(2.0毫升)的混合物中加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(76毫克,0.094毫摩尔)。将该反应液加热至100℃搅拌2小时。反应经lcms检测。待反应液冷却至室温后，加乙酸乙酯(10毫升
×
2)萃取。合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩溶剂得粗品，该粗品经快速硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)分离得3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(439毫克，收率：83.9％)。ms(esi):m/z＝517.1[m+h]
+
.
[0152]
1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-甲基噁丁环-3-基)甲基)脲
[0153][0154]
向配有磁力搅拌器的50毫升圆底烧瓶中加入3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(102毫克，0.197毫摩尔)和三乙胺(80毫克，0.79毫摩尔)的无水二氯甲烷(3.0毫升)溶液，
氩气置换三次，然后将反应液置于冰浴中冷却。然后向反应液中加入三光气(41毫克，0.138毫摩尔)，该反应液于0度搅拌20分钟。然后向反应液中加入(3-甲基噁丁环-3-基)甲胺(120毫克，1.18毫摩尔)，撤掉冰浴，将反应液在于室温搅拌30分钟。lcms检测反应。减压浓缩后油状物。该油状物经反向c-18硅胶柱(hcooh)分离得白色固体1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-甲基噁丁环-3-基)甲基)脲(78毫克，收率61.4％)。ms(esi):m/z＝644.2[m+h]
+
.
[0155]
(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0156][0157]
在0度下，向1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-甲基噁丁环-3-基)甲基)脲(78毫克，0.12毫摩尔)的无水二氯甲烷(3.0毫升)中加入三氟乙酸(1.0毫升)。撤去冰浴，该反应液于室温搅拌4小时。减压浓缩溶液的油状残留物，加入无水甲醇(4.0毫升)，用冰浴冷却至0度后，向反应液中加入无水碳酸钾调节ph＝10-11。开动搅拌器，搅拌30分钟后，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。该粗品经反向c-18硅胶柱(nh4hco3)分离得白色固体(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(51毫克，收率：82％)。ms(esi):m/z＝514.0.[m+h]
+
.
[0158]1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.25(s,1h),7.57(t,j＝8.8hz,1h),7.45(d,j＝1.6hz,1h),6.93(s,2h),6.80
–
6.74(m,2h),4.16(dd,j＝10.6,1.6hz,1h),3.94(d,j＝10.6hz,1h),3.81(s,3h),3.52(d,j＝11.2hz,1h),3.43(d,j＝11.2hz,1h),3.25(d,j＝13.6hz,1h),3.04(d,j＝13.6hz,1h),1.01(s,3h).
[0159]
实施例2:2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0160][0161]
1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲
[0162]
[0163]
向配有磁力搅拌器的50毫升圆底烧瓶中加入3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(100毫克，0.193毫摩尔)和三乙胺(79毫克，0.77毫摩尔)的无水二氯甲烷(3.0毫升)溶液，氩气置换三次，然后将反应液置于冰浴中冷却。然后向反应液中加入三光气(40毫克，0.135毫摩尔)，该反应液于0度搅拌20分钟。然后向反应液中加入(3-氟噁丁环-3-基)甲胺(102毫克，0.969毫摩尔)，撤掉冰浴，将反应液在于室温搅拌30分钟。lcms检测反应。减压浓缩后油状物。该油状物经反向c-18硅胶柱(hcooh)分离得白色固体1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲(80毫克，收率：63.8％)。ms(esi):m/z＝648.1[m+h]
+
.
[0165]
(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0166][0167]
以1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲(80毫克，0.123毫摩尔)为原料参考(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(实施例enn0885)的合成方法合成(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(54毫克，收率：84.5％)。ms(esi):m/z＝518.2[m+h]
+
.
[0168]1h nmr(400mhz,cd3od)δ:8.26(d,j＝5.0hz,1h),7.56(dd,j＝11.1,6.6hz,1h),7.44(d,j＝1.4hz,1h),7.14(s,2h),6.79
–
6.72(m,2h),4.34
–
4.21(m,2h),3.79(d,j＝5.7hz,3h),3.76
–
3.44(m,5h).
[0169]
实施例3:n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺
[0170][0171]
1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲
[0172][0173]
在室温下，向配有磁力搅拌器的10毫升圆底烧瓶中加入3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(150毫克，0.29毫摩尔)的无水二氯甲烷(3.0毫升)溶液中加入1,1'-硫羰基双(吡啶-2(1h)-酮)(74毫克，0.32毫摩尔)，氩气置换三次，然后将反应液置于40度油浴中搅拌1小时。待原料转化完全后，将反应液冷却至室温，然后加入(1-(氨基甲基)环丙基)甲醇(59毫克，0.58毫摩尔)。该反应于室温搅拌3小时。反应经lcms检测。减压浓缩溶剂得油状粗品，经反向c-18硅胶柱(hcooh)分离得白色固体1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲(180毫克，收率：94％)。ms(esi):m/z＝660.1[m+h]
+
.
[0174]
n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺
[0175][0176]
向配有磁力搅拌器的10毫升烧瓶中依次加入1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲(80毫克，0.12毫摩尔)和三乙胺(37毫克，0.36毫摩尔)和无水二氯甲烷(1.5毫升)，氩气置换三次后，将反应液置于冰-水浴中冷却10分钟后，然后向反应液中加入3-(((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-n,n-二甲基丙烷-1-胺盐酸(47毫克，0.24毫摩尔)。撤去冰浴，该反应于室温搅拌24小时。lcms检测反应。减压浓缩溶剂得油状粗品，经反向c-18硅胶柱(hcooh)分离得白色固体n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺(24毫克，收率：32％)。ms(esi):m/z＝626.1[m+h]
+
.
[0177]
n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺
[0178][0179]
以n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲
基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺(24毫克，0.038毫摩尔)为原料参考(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(实施例enn0885)的合成方法合成n-(3,5-二氟-4-((3-(2-氟-4-甲氧苯基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺(3.6毫克，收率：19％)。ms(esi):m/z＝496.1[m+h]
+
.
[0180]1h nmr(400mhz,cd3od)δ:8.25(s,1h),7.57(t,j＝8.8hz,1h),7.45(d,j＝1.4hz,1h),6.96(d,j＝10.4hz,2h),6.80
–
6.73(m,2h),4.08(s,2h),3.81(s,3h),3.22(s,2h),0.74
–
0.64(m,4h).
[0181]
实施例4:1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲
[0182][0183]
以1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲(20毫克，0.030毫摩尔)为原料参考(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(实施例enn0885)的合成方法合成1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((1-(羟甲基)环丙基)甲基)硫代脲(2.5毫克，收率：15.6％)。ms(esi):m/z＝530.0[m+h]
+
.
[0184]1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.27(s,1h),7.57(t,j＝8.8hz,1h),7.47(s,1h),7.32(d,j＝9.5hz,2h),6.82
–
6.73(m,2h),3.81(s,3h),3.65(s,2h),3.45(s,2h),0.59(t,j＝5.1hz,2h),0.51(t,j＝5.0hz,2h).
[0185]
实施例5:(2-((3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0186][0187]
1-(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲
[0188][0189]
以3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯胺(77毫克，0.167毫摩尔)和(3-氟噁丁环-3-基)甲胺(88毫克，0.836毫摩尔)为原料参考化合物1-(3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲(化合物2-1)的方法合成1-(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲(65毫克，收率：65.7％)ms(esi):m/z＝592.1[m+h]
+
.
[0190]
(2-((3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇
[0191][0192]
以1-(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-3-((3-氟噁丁环-3-基)甲基)脲(65毫克，0.11毫摩尔)为原料参考(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(实施例enn0885)的合成方法合成(2-((3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-氟-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(29毫克，收率：57.2％)。ms(esi):m/z＝462.0[m+h]
+
.
[0193]1h nmr(400mhz,cd3od)δ:8.35(s,1h),7.87(d,j＝1.2hz,1h),7.25
–
7.10(m,2h),4.29(d,j＝29.6hz,2h),3.74
–
3.48(m,4h).
[0194]
实施例6：n-(3,5-二氟-4-((5-(三氟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺
[0195]
吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺(150毫克，0.263毫摩尔)为原料参考(2-((3,5-二氟-4-((5-(2-氟-4-甲氧苯基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧代)苯基)氨基)-5-甲基-5,6-二氢-4h-1,3-噁嗪-5-基)甲醇(实施例enn0885)的合成方法合成n-(3,5-二氟-4-((3-(三氟甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧代)苯基)-5-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-6-烯-6-胺(45毫克，收率：38.9％)。ms(esi):m/z＝440.0[m+h]
+
.
[0205]1h nmr(400mhz,cd3od)δ:8.29(s,1h),7.86(d,j＝1.2hz,1h),7.16(d,j＝8.3hz,2h),4.43(s,2h),3.31(s,2h),0.82(d,j＝14.8hz,4h).
[0206]
以下化合物采用与实施例1类似的方法，替换相应原料获得。
[0207][0208][0209]
生物测试例1hpk1 adp-glo酶学活性测试
[0210]
制备酶活测试缓冲液包含40mm tris，ph7.5；20mm mgcl2；0.1mg/ml bsa；50μm dtt。化合物溶于100％dmso，母液浓度为10mm。化合物的dmso溶液从100um起，连续做三倍梯度稀释，共十一个浓度，将稀释后的化合物用酶活测试缓冲液以1:20稀释好后，取1ul加入工作孔，每个浓度两复孔。阴性对照孔和阳性对照孔加入1:20稀释的dmso溶液1ul。制备2.5
×
底物/atp工作液为包含0.25ug/ul mbp蛋白和45um atp的酶活测试缓冲液，每个工作孔中加入2ul 2.5
×
底物/atp工作液。制备2.5
×
酶反应工作液为包含0.5ng/ul hpk1重组蛋白(signalchem，货号m23-11g-10)的酶活测试缓冲液，每个工作孔中加入2ul 2.5
×
酶反应工作液，阴性对照孔仅加入2ul酶活测试缓冲液。贴好封板膜简单离心后置于室温反应30分钟，反应结束后每孔加入5ul adp-glo试剂(promega，货号v1901)室温反应40分钟，随后加入10ul激酶检测试剂(promega，货号v1901)，室温反应20分钟后测定最终发光信号。
[0211]
分别计算阳性孔和阴性孔的平均值，作为阳性对照值(signal
pos
)和阴性对照值(signal
neg
)。将工作孔信号值(signal
test
)按公式inhibition rate＝(signal
pos-signal
test
)/(signal
pos
–
signal
neg
)
×
100％计算抑制率。求得的抑制率在graphpad prism软件中按非线性拟合绘制浓度-抑制率曲线，计算ic
50
。
[0212]
生物测试例2glk adp-glo酶学活性测试
[0213]
制备酶活测试缓冲液包含40mm tris，ph7.5；20mm mgcl2；0.1mg/ml bsa；50μm dtt。化合物溶于100％dmso，母液浓度为10mm。化合物的dmso溶液从1mm起，连续做三倍梯度稀释，共十一个浓度，将稀释后的化合物用酶活测试缓冲液以1:20稀释好后，取1ul加入工作孔，每个浓度两复孔。阴性对照孔和阳性对照孔加入1:20稀释的dmso溶液1ul。制备2.5
×
底物/atp工作液为包含0.5ug/ul pka底物多肽和105um atp的酶活测试缓冲液，每个工作孔中加入2ul 2.5
×
底物/atp工作液。制备2.5
×
酶反应工作液为包含2.5ng/ul glk重组蛋白(signalchem，货号m25-11g-10)的酶活测试缓冲液，每个工作孔中加入2ul 2.5
×
酶反应工作液，阴性对照孔仅加入2ul酶活测试缓冲液。贴好封板膜简单离心后置于室温反应1小时，反应结束后每孔加入5ul adp-glo试剂(promega，货号v1901)室温反应40分钟，随后加入10ul激酶检测试剂(promega，货号v1901)，室温反应20分钟后测定最终发光信号。
[0214]
分别计算阳性孔和阴性孔的平均值，作为阳性对照值(signal
pos
)和阴性对照值(signal
neg
)。将工作孔信号值(signal
test
)按公式inhibition rate＝(signal
pos-signal
test
)/(signal
pos
–
signal
neg
)
×
100％计算抑制率。求得的抑制率在graphpad prism软件中按非线性拟合绘制浓度-抑制率曲线，计算ic
50
。实验结果见下表：
[0215]
表1 hpk1、glk酶活实验结果
[0216][0217]
其中，a表示ic
50
值≤50nm；b表示50nm＜ic
50
值≤500nm；c表示500nm＜ic
50
值≤10um。
[0218]
生物测试例3slp76磷酸化细胞学测试
[0219]
抑制hpk1可以抑制其下游slp76的磷酸化。slp76蛋白的磷酸化使用jurkat(atcc,clone e6-1tib-152
tm
)细胞进行测试，实验的第一天将细胞用培养基(rpmi 1640+0.5％fbs)稀释到106/ml，按每孔100ul，105细胞的量铺在96孔细胞培养板中，饥饿过夜培养。化合物溶于100％dmso，母液浓度为10mm。化合物的dmso溶液从10mm起，连续做四倍梯度稀释，共八个浓度，将10ul稀释后的化合物稀释到40ulrpmi 1640中并混匀，取10ul加入240ul 37度预热的rpmi 1640并混匀。取50ul最终稀释后的化合物加入细胞中，37度孵育20分钟，加入50ul稀释后的人cd3/cd28 t细胞激活剂(stemcell，货号：10971)，使激活剂的终浓度体积为总体系的1/40，37度孵育30分钟。反应结束后将细胞置于4度离心机1200rpm离心5分钟，吸走培养基，加入120ul细胞裂解液(elisa kit中提供，cell signaling，货号25424)在冰上放置30分钟使细胞充分裂解，裂解后的细胞吹打均匀后置于4度离心机以4000rpm离心10分钟，随后取50ul上清加入fastscan
tm phospho-slp-76(ser376)elisa kit(cell signaling，货号25424)测试细胞slp76的磷酸化水平。另外去25ul上清加入pierce bca protein assay kit(pierce，货号：23227)测试总蛋白浓度代替总slp-76蛋白水平。将磷酸化slp-76的读值除以总蛋白浓度读值得到磷酸化slp-76与总蛋白浓度比值ratio
test
，并计算阳性对照ratio
max
(不含检测化合物只加细胞激活剂)与阴性对照ratio
min
(不含检测化合物也未加细胞激活剂)的均值，通过下列公式将读数转化成inhibition rate(％)＝(ratio
max-ratio
test
)/(ratio
max-ratio
min
)
×
100％。求得的抑制率在graphpad prism软件中按非线性拟合绘制浓度-抑制率曲线，计算ic
50
。实验结果见下表：
[0220]
表2 slp76磷酸化抑制实验结果
[0221]
实施例编号ic50(nm)1a2a3a
4b5b6b7a8a9b11b
[0222]
其中，a表示ic
50
值≤1000nm；b表示1000nm＜ic
50
值≤20000nm
[0223]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。