组织生成的方法与流程

本申请要求2012年9月4日提交的美国临时专利申请号61/696,487的优先权，通过引用将其全文公开的内容合并入本文。

1.介绍

本文提供了在体内生成三维组织的方法，包括向受试者沉积和/或施用细胞和细胞外基质组分。

2.

背景技术：

生物打印(例如器官打印)属于研究和工程领域，其涉及打印设备，例如改良的喷墨打印机，其沉积生物材料。该技术涉及快速产生和释放包含细胞的液滴，并随后将其精确沉积在基材上。使用基础的细胞材料通过生物打印的方式构建的组织和器官代表着现今标准移植方法中所使用的供者来源的组织和器官的有前景的替代物。

3.概述

本发明提供了在体内形成三维组织的方法。在一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物和至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物，至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物，和至少一种其他附加组分。下述4.1.1节描述了根据本文所述方法可用的细胞。下述4.1.2节描述了根据本文所述的方法可以沉积在其上的组织和器官的细胞、ecm、和/或其他附加组分。下述4.1.3节描述了根据本文所述方法可用的ecm。在下述4.1.4节描述了根据本文所述的方法可以沉积在其上的表面细胞，ecm，和/或其他附加组分。

在一种实施方式中，本文描述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和ecm作为同一组合物的部分进行沉积。在另一种实施方式中，本文描述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和ecm作为不同的组合物的部分进行沉积。在一种具体实施方式中，本文描述的在体内形成三维组织的方法中使用的ecm包含可流动ecm。在另一种具体实施方式中，本文描述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和ecm作为不同的组合物的部分沉进行积，例如，其中ecm与细胞的沉积分开沉积，例如在细胞沉积之前沉积，和/或其中在细胞沉积之前使ecm脱水。在ecm脱水的实施方式中，它可以之后在期望的时间再水化，例如在细胞沉积到已经沉积有ecm和细胞的表面上的时间。

在一种具体实施方式中，本文所述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和/或ecm与一种或多种附加组分，例如生长因子、交联剂、可聚合单体、聚合物、水凝胶等等的沉积同时，在其之前，或在其之后沉积到受试者体内或体表的表面上。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法，将一种或多种附加组分生物打印到所述表面上。

在一种具体体表上的表面上，其中所述生物分子包含一种类型的胶原、一种类型的纤连蛋白、一种类型的层粘连蛋白、或组织粘合剂。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法，将生物分子生物打印到所述表面上。

在一种具体实施方式中，不是将本文所述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和/或ecm三维打印到受试者体内或体表的表面上，例如不是生物打印细胞和ecm，而是通过不包括生物打印的方法将其施加于所述表面上。在一种具体实施方式中，将不是被生物打印到受试者体内或体表的表面上的细胞和/或ecm施加于已经过生物打印的表面上，例如将细胞和/或可流动ecm施加到已经过生物打印到受试者体内或体表的支架，例如合成支架(如合成基质)上。在一种具体实施方式中，细胞和/或ecm仅被施加于支架(例如表面)的一部分，例如一面上。在另一种具体实施方式中，细胞和/或ecm被施加于支架的所有面上，即整个支架都具有施加于其上的细胞和/或ecm。在另一种具体实施方式中，该支架是聚己酸内酯(pcl)。

在某些实施方式中，本文所述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和/或可流动ecm(以及附加组分)被打印到所述表面上，例如细胞和ecm被生物打印(例如使用喷墨打印机)。在某些实施方式中，本文所述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和可流动ecm(以及附加组分)被喷涂到所述表面上。在某些实施方式中，本文所述的在体内形成三维组织的方法中使用的细胞和/或可流动ecm(以及附加组分)通过雾化沉积到所述表面上。

在一种具体实施方式中，可将细胞、ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面包括人造表面，即人为制造的表面。在另一种具体实施方式中，可将细胞、ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面包括受试者(例如人受试者)的组织或一种具体的实施方式中，根据本文描述的方法，可将ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面是已进行生物打印，例如已根据本文所述的方法进行生物打印的表面。在一种具体实施方式中，该表面是聚己酸内酯(pcl)。

在一种具体实施方式中，本文所述的方法用于治疗目的，例如该方法用于将对应于特定组织类型的细胞，或对应于多种组织类型的细胞沉积到所述受试者的表面(组织或器官)上，所述受试者将会从所述细胞的沉积中受益。这种方法可以另外包括将ecm(例如可流动ecm)和/或附加组分沉积到所述受试者的所述表面上。

在另一个方面，本文提供了包含细胞和ecm(例如可流动ecm)的组合物，其中所述组合物适用于本文所述的方法。本文还提供了包含所述组合物的试剂盒，其中所述组合物在一个或多个容器中，以及根据本文所述的一种或多种方法使用所述组合物的说明书。

3.1附图简述

图1显示包含聚己酸内酯(pcl)的支架，所述pcl以不同的角度并以产生不同孔径的支架的方式被生物打印。

图2显示生物打印支架的多个视图，其中细胞外基质(ecm)被施加于支架的两面上并随后被脱水。

图3显示细胞增殖检测的结果。在包含生物打印的pcl和脱水的ecm的混合支架上培养的胎盘干细胞在8天的培养期中增殖。

图4显示细胞活力检测的结果。在包含生物打印的pcl和脱水的ecm的混合支架上培养的胎盘干细胞在8天的培养期中增殖并保持存活。

图5显示包含pcl、ecm和胎盘干细胞的完整的三维混合支架，其中每一个被生物打印成层(pcl层和ecm/细胞层)。

图6证明在7天的培养期中胎盘干细胞遍布在整个三维生物打印支架上。

图7显示细胞活力检测的结果。与ecm和pcl一起生物打印以形成三维混合支架的胎盘干细胞在7天的培养期中增殖并保持存活。

图8证明与ecm和pcl一起生物打印以形成三维混合支架的胎盘干细胞在7天的培养期中遍布在混合支架的ecm上。

图9显示细胞增殖检测的结果。在通过生物打印pcl、ecm和胎盘干细胞生成的三维混合支架上培养的胎盘干细胞在7天的培养期中增殖。

图10显示包含pcl、胎盘ecm和胰岛素产生细胞(β-tc-6细胞)的生物打印支架。

图11显示细胞增殖检测的结果，在包含pcl、胎盘ecm和胰岛素产生细胞的生物打印支架中的胰岛素产生细胞(β-tc-6细胞)的数量在14天的培养期中保持稳定。

图12显示由包含pcl、胎盘ecm和胰岛素产生细胞(β-tc-6细胞)的生物打印支架产生的胰岛素水平。

图13显示在暴露于葡萄糖负荷之后(a)或在对照条件下，由包含pcl、胎盘ecm和胰岛素产生细胞(β-tc-6细胞)的生物打印支架产生的胰岛素水平。

4.具体实施方式

本文提供了在体内形成三维组织的方法。在一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者内部(体内，in)或其上(体表，on)的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物和至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物、至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物、和至少一种其他附加组分。下述4.1.1节描述了根据本文所述的方法可用的细胞。下述4.1.2节描述了根据本文所述的方法细胞、ecm、和/或其他附加组分可以沉积在其上的组织和器官。下述4.1.3节描述了根据本文所述的方法可用的ecm。在下述4.1.4节描述了根据本文所述的方法细胞、ecm，、和/或其他附加组分可以沉积在其上的表面。

在一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物。在一种具体实施方式中，使用生物打印机来沉积所述细胞。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含单一类型的细胞。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含多于一种类型的细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物和至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物，其中所述ecm包含可流动ecm。在一种具体实施方式中，使用生物打印机来沉积所述细胞和所述ecm。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含单一类型的细胞。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含多于一种类型的细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积包含细胞和细胞外基质(ecm)的组合物，其中所述ecm包含可流动ecm。在一种具体实施方式中，使用生物打印机来沉积所述细胞和所述ecm。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含单一类型的细胞。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含多于一种类型的细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了在体内形成三维组织的方法，包括在受试者体内或体表的表面上沉积至少一种包含细胞的组合物，至少一种包含细胞外基质(ecm)的组合物，和至少一种其他附加组分。在一种具体实施方式中，使用生物打印机来沉积所述细胞、所述ecm和所述一种或多种附加组分。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含单一类型的细胞。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含多于一种类型的细胞。在另一种具体实施方式中，将所述细胞、所述ecm和所述一种或多种附加组分配制成同一组合物的部分。在另一种具体实施方式中，将所述细胞、所述ecm和所述一种或多种附加组分配制成单独的组合物的部分。在另一种具体实施方式中，所述一种或多种附加组分是生长因子、可聚合单体、交联剂、聚合物和水凝胶。

在某些实施方式中，根据本文公开的方法，可将细胞、ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面包含人造表面，即人为制造的表面(例如假体)。在另一种具体实施方式中，根据本文公开的方法，将细胞、ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面包含受试者(例如人受试者)的组织或器官(或其部分)。在一种具体实施方式中，受试者中的所述组织或器官的表面可以被脱细胞，例如进行处理以从组织或器官的全部或部分表面除去细胞。在一种具体实施方式中，根据本文描述的方法，可将ecm、和/或附加组分沉积于其上的表面是已进行生物打印，例如已根据本文所述的方法进行生物打印的表面。在一种具体实施方式中，该表面包含合成材料，例如合成聚合物。在另一种实施方式中，合成聚合物是pcl。

在某些实施方式中，细胞和ecm(例如可流动ecm)不同时沉积，但沉积成层。在一种具体实施方式中，在受试者体内或体表的表面上沉积一层细胞，然后在受试者体内或体表上的表面上沉积一层ecm，然后在受试者体内或体表的表面上沉积一层细胞。在某些实施方式中，可以在受试者体内或体表的表面上沉积多层ecm，然后在受试者体内或体表的表面上沉积多层细胞，反之亦然。同样地，根据本文所述的方法，与细胞和/或ecm沉积同时，或在其之前或之后沉积的附加组分可以在细胞和ecm之间成层。

在某些实施方式中，沉积细胞和ecm(例如可流动ecm)以使得受试者体内或体表的沉积表面完全被细胞和ecm覆盖。在其他实施方式中，沉积细胞和ecm(例如可流动ecm)以使得受试者体内或体表的沉积表面部分被细胞和ecm覆盖。

在某些实施方式中，沉积细胞和ecm(例如可流动ecm)以使得受试者体内或体表的沉积表面在特定的、所期望的区域上被细胞覆盖；并且在特定的、所期望的区域上被ecm覆盖，其中这些特定的区域可以重叠或可以不重叠。

在某些实施方式中，可以以三维的方式将细胞和ecm(例如可流动ecm)沉积/打印到表面上。本文所使用的“三维打印”或“三维沉积”指这样的打印/沉积过程，例如生物打印机的打印头在三维表面(例如受试者中的器官或骨头)下方、上方、或围绕它移动，例如机械控制打印头以使其沿着特定的路径旋转。本文所使用的三维打印和三维沉积与本领域已知的生物打印的标准方法相反，在所述标准方法中通过在扁平/平面/二维表面上开始构建组织进行打印。

4.1生物打印

本文使用的“生物打印”通常指使用标准或改良的打印技术，例如喷墨打印技术将活细胞以及其他组分(例如可流动ecm；合成基质)沉积到表面上。将细胞沉积到表面上，以及生物打印细胞，包括与水凝胶的组合的细胞的基本方法在warren等的us6,986,739、boland等的us7,051,654、yoo等的us2009/0208466和xu等的us2009/0208577中描述，通过合并将其全文公开的内容合并入本文。另外，适用于本文所述方法的生物打印机是可商购的，例如envisiontecgmbh(gladbeck，德国)的3d-bioplotter^tm；和organovo(sandiego，ca)的novogenmmxbioprinter^tm。

本文所述方法中使用的生物打印机可以通过改变例如打印机驱动软件和/或打印机的物理组成，从而包括能够控制温度、湿度、剪切力、打印速度、和/或喷墨频率(firingfrequency)的机构和/或软件。在某些实施方式中，优选可以构建和/或设定生物打印机软件和/或硬件，以在打印过程中保持细胞温度为大约37℃。

在某些实施方式中，喷墨打印装置可以包括二维或三维打印机。在某些实施方式中，在打印，例如与喷墨阀连接之前，生物打印机包括直流电磁喷墨阀，包含一种或多种类型的细胞，例如可流动组合物中的细胞的一个或多个容器，和/或ecm(例如可流动ecm)。生物打印机可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个容器，例如每一种细胞类型或每一种ecm使用一个容器，用于构建本文所述的组织和器官。可以通过气压、机械压力、或通过其他方式将细胞从容器递送至喷墨阀。典型地，生物打印机(例如生物打印机中的打印头)是计算机控制的，以使得一种或多种细胞类型，和所述ecm以预定的模式进行沉积。所述预定的模式可以是这样的模式，其在作为细胞来源的或用于获得细胞的器官或组织中再造或重演所述一种或多种类型的细胞的天然排列，或者是这样的模式，其不同于所述一种或多种类型的细胞的天然排列。

在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的生物打印机可以是热泡喷墨打印机，参见，例如niklasen等的us6,537,567，或者压电晶体振动打印头，例如，使用高达30khz的频率和12-100瓦特的动力源。生物打印机打印头喷嘴，在一些实施方式中，各自独立地直径在0.05-200微米之间，或者直径在0.5-100微米之间，或者直径在10-70微米之间，或者直径在20-60微米之间。在进一步的实施方式中，喷嘴各自独立地直径为大约40-50微米。可以使用具有相同或不同直径的多个喷嘴。在一些实施方式中，喷嘴具有圆形开口；在其他实施方式中，可以使用其他适当的形状，例如椭圆形、正方形、长方形等等，而不背离本发明的精神。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的生物打印机包括多个打印头和/或多个打印喷嘴，其中所述多个打印头或打印喷嘴可以，在某些实施方式中，被单独控制。在某些实施方式中，每一个所述的打印头或打印喷嘴与其余的所述打印头或打印喷嘴独立操作。在某些实施方式中，至少一个所述的多个打印头或多个打印喷嘴可以打印包含细胞的组合物，并且至少一个所述的多个打印头或多个打印喷嘴可以打印包含ecm的组合物。在某些实施方式中，至少一个所述的多个打印头或多个打印喷嘴可以打印包含细胞的组合物，至少一个所述的多个打印头或多个打印喷嘴可以打印包含ecm的组合物，并且至少一个所述的多个打印头或多个打印喷嘴可以打印包含附加组分的组合物。

在某些实施方式中，可以改变根据本文所述的方法使用的生物打印机的一个或多个打印头或打印喷嘴以使得它适合于在特定的表面上打印。例如可以通过将其与特定的手术器械，例如腹腔镜连接来改变打印头或打印喷嘴。根据这样的实施方式，可以为手术器械提供一个或多个有助于打印程序的其他部件，例如照相机。

在某些实施方式中，可以使用软件，例如计算机辅助设计(cad)软件程序来构建要打印的组织或器官的解剖图像。根据这样的实施方式，可以生成允许在代表要打印的组织或器官的结构的三维表面上进行三维打印的程序。例如，如果希望在骨上打印，可以构建骨的解剖图像并生成指导生物打印机的打印头在打印过程中围绕受试者表面内部的三维骨旋转的程序。

在某些实施方式中，在所述受试者的体内或体表扫描要打印的组织或器官的表面以形成表面地图(surfacemap)，并且用所述表面地图指导要打印的细胞、ecm、和/或任何附加组分的沉积。这种扫描可以包括，但不限于使用激光、电子束、磁共振成像、微波、或计算机断层扫描。所述表面的扫描可以包含至少1000、10、10、1、或0.1微米的分辨率。

在某些实施方式中，本文提供的生物打印方法包括将细胞(例如包含单一细胞的组合物或包含多种细胞的组合物)和可流动细胞外基质(ecm)的单个液滴递送/沉积到受试者体内或体表的表面上。

在某些实施方式中，本文提供的生物打印方法包括将单一细胞类型和可流动ecm沉积在受试者体内或体表。根据这种方法可以使用的示例性细胞类型在下述4.1.1节中提供。ecm，包括可流动ecm在下述4.1.3节中描述。

在其他实施方式中，本文提供的生物打印方法包括将多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)细胞类型和可流动ecm沉积在受试者体内或体表。在某些实施方式中，多种细胞类型作为同一个组合物的部分进行沉积，即细胞来源是包含多种细胞类型的单一组合物。在另一种具体实施方式中，多种细胞类型作为不同的组合物的部分进行沉积，即细胞来源是包含多种细胞类型的不同组合物。在另一种具体实施方式中，多种细胞类型的一部分作为一个组合物的部分进行沉积(例如两个或更多种细胞类型在单一组合物中)，并且多种细胞类型的另一部分作为不同的组合物进行沉积(例如一种或多种细胞类型在单一组合物中)。根据这种方法可使用的示例性细胞类型在下述4.1.2节中提供。

在某些实施方式中，要沉积的细胞和可流动ecm在受试者体内或体表的表面上作为同一个组合物的部分一起(即同时)沉积。在另一种具体实施方式中，要沉积的细胞和可流动ecm在受试者体内或体表的表面上作为不同的组合物的部分一起沉积。在另一种具体实施方式中，要沉积的细胞和可流动ecm在受试者体内或体表的表面上分别(即在不同时间)沉积。

在某些实施方式中，将细胞和可流动ecm与一种或多种附加组分沉积在受试者体内或体表的表面上。在一种实施方式中，将一种或多种附加组分与细胞配制在同一个组合物中。在另一种实施方式中，将一种或多种附加组分与ecm配制在同一个组合物中。在另一种实施方式中，将一种或多种附加组分与细胞和ecm配制在同一个组合物中(即一个组合物包含细胞、可流动ecm、和一种或多种附加组分)。在另一种实施方式中，将一种或多种附加组分配制在与包含细胞和/或ecm的组合物不同的组合物中，并且在受试者体内或体表的表面上与细胞和/或ecm同时、在其之前、或在其之后沉积。在某些实施方式中，一种或多种附加组分促进细胞的生存、分化、增殖等。在另一种具体实施方式中，一种或多种附加组分包含细胞交联剂(参见4.1.3.2节)。在另一种具体实施方式中，一种或多种附加组分包含水凝胶。在另一种具体实施方式中，一种或多种附加组分包含合成聚合物。

本领域技术人员将会认识到，根据本文所述的方法中使用的细胞和可流动ecm，以及任何附加组分可以从打印机的不同喷嘴中打印，或者可以以共同的组合物通过打印机的同一个喷嘴打印，这取决于要形成的特定组织或器官。本领域技术人员还应当认识到打印可以是同时的或是顺序的，或者是其任意组合，并且一些组分(例如细胞、可流动ecm、或附加组分)可以以第一种模式的形式打印，而一些组分可以以第二种模式的形式打印，等等。打印的特定组合和方式将取决于在其上打印的受试者中的特定组织或器官。

在某些实施方式中，细胞、ecm、和/或任何其他材料(例如合成基质，例如pcl)可以以特定模式进行生物打印，以产生所希望的结果。例如，生物打印材料(例如细胞、ecm、基质、和本文所述的其他组分)可以以不同角度进行成层生物打印，以产生特定的合乎需要的模式，例如具有特定孔径的三维结构。在某些实施方式中，以纵横交错的方式打印生物打印材料(例如细胞、ecm、基质、和本文所述的其他组分)，以产生呈现盒状的具有期望尺寸的孔的生物打印结构。在另一种具体实施方式中，生物打印材料(例如细胞、ecm、基质、和本文所述的其他组分)成角度打印，以产生呈现三角形或菱形状的具有期望尺寸的孔。例如，成特定角度，例如30度角、45度角、60度角的生物打印材料(例如细胞、ecm、基质、和本文所述的其他组分)，以产生特定的模式。根据这种打印方法，可以生成具有所希望品质，例如培养细胞生长和增殖的能力的生物打印结构。参见下述实施例1。在某些实施方式中，在所述生物打印基质上以有益于支持细胞生长和增殖的特定模式对基质，例如合成基质进行生物打印。在某些实施方式中，合成基质是pcl。

4.1.1细胞

根据本文所述的方法，可以使用本领域已知的任何类型的细胞，包括原核细胞和真核细胞。

根据本文所述的方法使用的细胞可以是同系的(即与受体受试者的细胞在基因上是相同或相近的，以使组织移植排斥减至最小)、同种异体的(即来自受者受试者的相同物种的基因不相同成员)或异种的(即来自与受者受试者不同物种的成员)。同系细胞包括自体的(即来自受者受试者)和同系的(即来自基因相同但是不同的受试者，例如来自同卵双胞胎)。细胞可以自，例如供者(活体或尸体)获得，或者来自于已建立的细胞株或细胞系。例如，可以通过本领域已知的标准活组织检查技术从供者收获细胞(例如潜在的受者)。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被包含在可流动的生理可接受的组合物，例如水、缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等)、液体介质(例如0.9n盐溶液、kreb′s溶液、改良的kreb′s溶液、eagle′s培养基、修饰的伊格尔氏培养基(mem)、达尔伯克改良的伊格尔氏培养基(dmem)、hank′s平衡盐等)等中。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞可以包含用一种或多种本领域已知的蛋白酶，例如胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、liberase等从组织或器官分离的原代细胞。可以在用蛋白酶处理组织之前、在其过程中、或之后对器官组织进行物理分散，例如通过切割、浸离、过滤等等。在本文所述的方法中，在使用细胞之前，可以使用标准的、本领域已知的细胞培养技术培养细胞，例如，其目的是产生均匀的或基本上均匀的细胞群，以选择特定的细胞类型，等等。

在一个实施方式中，本文所述的方法中使用的细胞类型包括干细胞。根据本文所述的方法中可以使用的干细胞的非限制性的列表包括：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞(bm-mscs)、骨髓来源的间充质基质细胞、组织塑料贴壁胎盘干细胞(pdacs)、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源的贴壁细胞(amdacs)、成骨胎盘贴壁细胞(opacs)、脂肪干细胞、角膜缘干细胞、牙髓干细胞、成肌细胞、内皮祖细胞、神经元干细胞、脱落牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞、真皮干细胞、单性生殖来源干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞、或侧群干细胞(sidepopulationstemcells)。

在某些实施方式中，本文所述的方法包括胎盘干细胞(例如us7468276和us8057788中所述的胎盘干细胞)的应用。在另一种具体实施方式中，所述胎盘干细胞是在一个实施方式中，所述pdacs是cd34-、cd10+、cd105+、和cd200+。在另一个实施方式中所述pdacs是cd34-、cd10+、cd105+、和cd200+，此外还是cd45-、cd80-、cd86-、和/或cd90+。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法包括amdacs(例如国际专利申请公开号wo10/059828中所述的amdacs)的应用。在一个实施方式中，所述amdacs是oct4-。在另一个实施方式中，所述amdacs是cd49f+。在另一个实施方式中，所述amdacs是oct4-和cd49f+。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法包括pdacs和amdacs的应用。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法包括bm-mscs的应用。

在另一种实施方式中，本文所述的方法中使用的细胞类型包括分化的细胞。在某些实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括内皮细胞、表皮细胞、真皮细胞、内胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、肝细胞、胰细胞、和/或基质细胞。在另一种具体实施方式中，细胞是胰岛素产生细胞，例如胰细胞(例如胰岛细胞)或胰岛素产生细胞系，例如β-tc-6细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括唾液腺粘液细胞、唾液腺浆液细胞、味腺细胞(vonebher′sglandcells)、乳腺细胞、泪腺细胞、耵聍腺细胞、外分泌汗腺暗细胞、顶泌汗腺细胞、墨氏腺细胞(glandofmollcells)、皮脂腺细胞、鲍曼氏腺细胞、十二指肠腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林氏腺细胞、利特雷氏腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细胞、胃粘膜粘液细胞、胃腺酶原细胞、胰腺腺泡细胞、帕内特细胞、ii型肺泡上皮细胞、和/或克拉拉细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括生长激素细胞、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、副滤泡细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、卵泡内膜细胞、黄体细胞、粒层黄体细胞、黄体膜细胞、近肾小球细胞、致密斑细胞、极周细胞、和/或肾系膜细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括血管和淋巴血管内皮有窗孔细胞、血管和淋巴血管内皮连续细胞、血管和淋巴血管内皮脾细胞、滑膜细胞、浆膜细胞(腹膜、胸膜、和心包腔)、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细胞(耳膜内淋巴空间(liningendolymphaticspaceofear))、血管纹基底细胞、血管纹边缘细胞(耳膜内淋巴空间(liningendolymphaticspaceofear))、克劳氏细胞、伯特谢尔细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞状细胞、色素睫状体上皮细胞。非色素睫状体上皮细胞、角膜内皮细胞、栓细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输出精小管纤毛细胞、和/或纤毛室管膜细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法中使用的分化的细胞包括表皮角质细胞、表皮基底细胞、指甲和趾甲的角质细胞、甲床基底细胞、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、角质毛干细胞、角质毛根鞘细胞、赫胥黎氏层毛根鞘细胞、亨利氏层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞、复层鳞状上皮的表面上皮细胞、上皮细胞基底细胞、和/或尿路上皮细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括螺旋器的听觉内毛细胞、螺旋器的听觉外毛细胞、螺旋器的内柱细胞、螺旋器的外柱细胞、螺旋器的内指细胞、螺旋器的外指细胞、螺旋器的边缘细胞、螺旋器的汉森细胞、前庭器支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、雪旺细胞、卫星细胞、肠胶质细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的初级感觉神经元、热敏感的初级感觉神经元、上皮梅克尔细胞、嗅感觉神经元、疼痛敏感初级感觉神经元、视杆细胞、蓝色敏感视锥细胞、红色敏感视锥细胞、本体感受初级神经元、i型颈动脉体细胞、ii型颈动脉体细胞(血液ph传感器)、i型耳前庭器毛细胞(加速度和重力)、ii型耳前庭器毛细胞、i型味蕾细胞、类胆碱神经细胞、肾上腺素能神经细胞、和/或肽能神经细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括星形胶质细胞、神经元、寡树突胶质细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶状体蛋白的晶状体纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脏脂肪细胞、肾脏肾小球壁细胞、肾脏肾小球足细胞、肾脏近端小管刷状边缘细胞、细尿管袢薄段细胞、肾脏远端小管细胞、肾脏集尿管细胞、i型肺泡细胞、胰管细胞、非纹状管细胞、导管细胞、肠刷状边缘细胞、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输出精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、和/或附睾基底细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括成釉细胞上皮细胞、半月面上皮细胞、螺旋器齿间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜基质细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞(odontocytes)、透明软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨祖细胞、体细胞、星形细胞(耳)、肝星形细胞(ito细胞)、胰腺stelle细胞、红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭核袋细胞、肌梭核链细胞、卫星细胞、普通心肌细胞、结节心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、虹膜肌上皮细胞、和/或外分泌腺肌上皮细胞。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用的分化的细胞包括网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮朗格汉斯细胞、树突细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助t细胞、抑制t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞、精子、卵泡细胞、塞尔托利细胞、胸腺上皮细胞、和/或间质性肾细胞。

可以将根据本文所述的方法使用的细胞配制在组合物中。在某些实施方式中，将根据本文所述的方法使用的细胞配制在仅包含单一细胞类型的组合物中，即组合物中的细胞群体是同质的。在其他实施方式中，将根据本文所述的方法中使用的细胞配制在包含多于一种细胞类型的组合物中，即组合物中的细胞群体是异质的。

在某些实施方式中，将根据本文所述的方法使用的细胞配制在另外包含可流动ecm(参见4.1.3节)的组合物中。或者，根据本文所述的方法，所述可流动ecm可以作为单独的组合物的一部分，与所述细胞的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。在某些实施方式中，将根据本文所述的方法使用的细胞配制在另外包含一种或多种合成单体或聚合物的组合物中。或者，根据本文所述的方法，所述合成单体或聚合物可以作为单独的组合物的一部分，与所述细胞的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。在某些实施方式中，将根据本文所述的方法使用的细胞配制在另外包含可流动ecm和一种或多种合成单体或聚合物的组合物中。在某些实施方式中，将根据本文所述的方法中使用的细胞配制在另外包含交联剂的组合物中。或者，根据本文所述的方法，所述交联剂可以作为单独的组合物的一部分，与所述细胞的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，将根据本文所述的方法使用的细胞配制在另外包含一种或多种附加组分，例如促进细胞的存活、分化、增殖等的组分的组合物中。这种组分可以包括，但不限于营养物、盐、糖、存活因子、和生长因子。根据本文所述的方法可以使用的示例性生长因子包括，但不限于，胰岛素样生长因子(例如igf-1)、转化生长因子-β(tgf-β)、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、结缔组织生长因子(ctgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(1、2和3)、骨桥蛋白、骨形成蛋白-2、生长激素如促生长素、细胞引诱剂和粘附剂等、及其混合物。或者，根据本文所述的方法，所述一种或多种促进细胞的存活、分化、增殖等的附加组分可以作为单独组合物的一部分，与所述细胞的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞是原始培养细胞，例如，已在体外培养的细胞。这种原始细胞可以传代一次或多次，例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、或多于十次。在某些实施方式中，所述原始细胞已传代不超过六次。在另一种具体实施方式中，所述原始细胞来源于要在其体内或体表进行打印的受试者。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化以产生并非是细胞天然产生的蛋白质或多肽，或者被基因工程化以产生蛋白质或多肽的量大于细胞天然产生量。在某些实施方式中，这种细胞包含分化的细胞或由其组成。在另一种具体实施方式中，所述细胞包含指导所述蛋白质或多肽产生的质粒。这种细胞可以以这样的方式进行培养，可以控制和/或优化蛋白质或多肽的量。例如，所述细胞可以被工程化以使得在体外培养中在生长培养基中，在大约24小时中大约1×10⁶个所述细胞产生大约或至少0.01-0.1、0.1-1.0、1.0-10.0、或10.0-100.0μm所述蛋白质或多肽。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化以产生细胞因子或包含其活性部分的多肽。可以由这样的工程化细胞产生的示例性细胞因子包括，但不限于，肾上腺髓质素(am)、血管生成素(ang)、骨形成蛋白(bmp)、脑源性神经营养因子(bdnf)、表皮生长因子(egf)、红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胶质细胞源性神经营养因子(gndf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、生长分化因子(gdf-9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝细胞瘤源性生长因子(hdgf)、胰岛素样生长因子(igf)、促移行因子(migration-stimulatingfactor)、肌肉生长抑制素(gdf-8)、髓单核细胞生长因子(mgf)、神经生长因子(ngf)、胎盘生长因子(plgf)、血小板源性生长因子(pdgf)、促血小板生成素(tpo)、转化生长因子α(tgf-α)、tgf-β、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、血管内皮生长因子(vegf)、或wnt蛋白。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生蛋白质或多肽的可溶性受体，例如细胞因子的可溶性受体。可以由这种细胞产生的示例性的可溶性受体包括，但不限于，am、ang、bmp、bdnf、egf、epo、fgf、gndf、g-csf、gm-csf、gdf-9、hgf、hdgf、igf、促移行因子、gdf-8、mgf、ngf、plgf、pdgf、tpo、tgf-α、tgf-β、tnf-α、vegf、和wnt蛋白的可溶性受体。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化，以产生白介素。可以由这种细胞产生的示例性的白介素包括，但不限于，白介素-1α(il-1α)、il-1β、il-1f1、il-1f2、il-1f3、il-1f4、il-1f5、il-1f6、il-1f7、il-1f8、il-1f9、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-1235kdaα亚基、il-1240kdaβ亚基、il-12α和β亚基二者、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e、il-17f同种型1、il-17f同种型2、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23p19亚基、il-23p40亚基、il-23p19亚基和il-23p40亚基一起、il-24、il-25、il-26、il-27b、il-27-p28、il-27b和il-27-p28一起、il-28a、il-28b、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35、il-36α、il-36β、和il-36γ。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生白介素的可溶性受体。可以由这种细胞产生的示例性的白介素的可溶性受体包括，但不限于，il-1α、il-1β、il-1f1、il-1f2、il-1f3、il-1f4、il-1f5、il-1f6、il-1f7、il-1f8、il-1f9、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-1235kdaα亚基、il-1240kdaβ亚基、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e、il-17f同种型1、il-17f同种型2、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23p19亚基、il-23p40亚基、il-24、il-25、il-26、il-27b、il-27-p28、il-28a、il-28b、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35、il-36α、il-36β、和il-36γ的可溶性受体。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生干扰素。可以由这种细胞产生的示例性干扰素包括，但不限于，ifn-α、ifn-β、ifn-γ、ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3、ifn-k、ifn-ε、ifn-κ、ifn-τ、ifn-δ、ifn-ζ、ifn-ω、和ifn-v。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生干扰素的可溶性受体。可以由这种细胞产生的示例性的干扰素的可溶性受体包括，但不限于，ifn-α、ifn-β、ifn-γ、ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3、ifn-k、ifn-ε、ifn-κ、ifn-τ、ifn-δ、ifn-ζ、ifn-ω、和ifn-v的可溶性受体。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化，以产生胰岛素或胰岛素原。在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生胰岛素受体。在某些实施方式中，所述被基因工程化以产生胰岛素或胰岛素原、和/或胰岛素受体的细胞，另外被基因工程化以产生激素原转化酶1、激素原转化酶2、或羧肽酶e的一种或多种。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化，以产生瘦素。在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生红细胞生成素(epo)。在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生血小板生成素。在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化，以产生酪氨酸3-单加氧酶，一种能由1-酪氨酸产生l-dopa的蛋白。在某些实施方式中，所述细胞被进一步工程化以表达芳香l-氨基酸脱羧酶，其由l-dopa产生多巴胺。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法使用的细胞被基因工程化，以产生激素或激素原。可以由这种细胞产生的示例性激素包括，但不限于，抗苗勒氏管激素(amh)、脂联素(acrp30)、促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素(agt)、血管紧张素原(agt)、抗利尿激素(adh)、加压素、心房钠尿肽(anp)、降钙素(ct)、缩胆囊素(cck)、促肾上腺皮质激素释放激素(crh)、红细胞生成素(epo)、促卵泡激素(fsh)、睾酮、雌激素、胃泌素(grp)、胃饥饿素、胰高血糖素(gcg)、促性腺激素释放激素(gnrh)、生长激素(gh)、生长激素释放激素(ghrh)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、人胎盘催乳素(hpl)、抑制素、黄体化激素(lh)、促黑素细胞激素(msh)、增食欲素、催产素(oxt)、甲状旁腺激素(pth)、催乳素(prl)、松弛素(rln)、分泌素(sct)、生长激素抑制素(srif)、血小板生成素(tpo)、促甲状腺激素(tsh)、和促甲状腺激素释放激素(trh)。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化以产生细胞色素p450侧链裂解酶(p450scc)。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化以产生低密度脂蛋白受体(ldlr)。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化以产生多囊蛋白-1(pkd1)、pkd-2或pkd3。

在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法中使用的细胞被基因工程化以产生苯丙氨酸羟化酶。

在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在另外包含可聚合单体的组合物中。在这种实施方式中，例如，可以在生物打印之前即时加入聚合催化剂，以使得一旦细胞被打印，单体就进行聚合，形成捕捉细胞和/或为细胞提供物理支持的凝胶。例如，包含细胞的组合物可以包含丙烯酰胺单体，进而在生物打印前即时向组合物中加入temed和过硫酸铵，或核黄素。组合物中的细胞沉积到表面上以后，丙烯酰胺聚合、汇集并支持细胞。

在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在另外包含粘合剂的组合物中。在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在另外包含软组织粘合剂的组合物中，所述软组织粘合剂包括，但不限于氰基丙烯酸盐粘合剂、血纤蛋白粘合剂、和/或明胶-间苯二酚-甲醛胶。在另一种具体实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在另外包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)配体、细胞外蛋白、和/或细胞外蛋白类似物的组合物中。

在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在组合物中，以使细胞可以以单个细胞的形式(即细胞的沉积是一次沉积一个细胞)沉积在受试者体内或体表的表面上。

在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在组合物中，以使细胞以包含多个细胞的聚集体的形式沉积在受试者体内或体表的表面上。这种聚集体可以包含单一类型的细胞，或者可以包含多种细胞类型，例如两种、三种、四种、五种或更多种细胞类型。

在某些实施方式中，将根据本文所述方法使用的细胞配制在组合物中，以使细胞作为组合物的一部分形成组织，其中可以使用本文所述方法使所述组织沉积在受试者的体内或体表的表面上。这种组织可以包含单一类型的细胞，或者可以包含多种细胞类型，例如两种、三种、四种、五种或更多种细胞类型。

在某些实施方式中，根据文本所述方法使用的细胞以具有小体积，例如每液滴0.5-500皮升(picoliters)的细胞和/或组合物的单个液滴的形式被沉积到受试者的体内或体表的表面上。在不同的实施方式中，细胞、或包含细胞的组合物的体积，是大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、20、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮升，或者在大约1-90皮升、大约5-85皮升、大约10-75皮升、大约15-70皮升、大约20-65皮升、或大约25-大约60皮升之间。

4.1.2组织和器官

本文提供了使用本文提供的一种或多种方法在受试者体内或体表的组织和器官上进行生物打印的方法。本文还提供了在受试者体内或体表生物打印新组织的方法。本文还提供了在受试者中的已有器官内或其上生物打印组织的方法，以及在受试者中生成新器官的方法。

使用本文描述的方法可以在受试者体内或体表打印本领域已知的任何类型的组织。在某些实施方式中，在受试者体内或体表打印的组织包含单一细胞类型。在其他实施方式中，在受试者体内或体表打印的组织包含多种细胞类型。在某些实施方式中，在受试者体内或体表打印的组织包含多于一种类型的组织。

在某些实施方式中，本文描述的方法包括细胞、ecm、和/或其他组分在受试者体内或体表的表面上的沉积，其中所述表面包含来自受试者的组织。在某些实施方式中，本文描述的方法包括细胞、ecm、和/或其他组分在受试者体内或体表的表面上的沉积，其中所述表面包含受试者的器官。

在某些实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞包含肌肉组织细胞。在某些实施方式中，所述结缔组织细胞被打印在所述受试者的结缔组织(即受试者体内或体表的结缔组织)上。

在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞包含肌肉组织细胞。在某些实施方式中，所述肌肉组织细胞被打印在所述受试者的肌肉组织(即受试者体内或体表的肌肉组织)上。肌肉组织可以包含内脏(平滑)肌组织、骨骼肌组织、或心肌组织。

在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞包含神经组织细胞。在某些实施方式中，所述神经组织细胞被打印在所述受试者的神经组织(即受试者体内或体表的神经组织)上。神经组织可以包含中枢神经系统组织(例如脑组织或脊髓组织)或外周神经系统组织(例如脑神经和脊神经)。

在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞包含上皮组织细胞。在某些实施方式中，所述上皮组织细胞被打印在所述受试者的上皮组织(即受试者体内或体表的上皮组织)上。上皮组织可以包含内皮。

在某些实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在受试者的器官上。细胞、ecm、和/或其他组分可以被打印在受试者的器官体内或体表，所述器官与任何已知的哺乳动物器官系统，即消化系统、循环系统、内分泌系统、排泄系统、免疫系统、皮肤系统、肌肉系统、神经系统、生殖系统、呼吸系统、和/或骨骼系统相关。根据本文所述的方法可以生成或形成的示例性的器官包括，但不限于，肺、肝、心、脑、肾、皮肤、骨骼、胃、胰、膀胱、胆囊、小肠、大厂、前列腺、睾丸、卵巢、脊髓、咽、喉、气管、隔膜、输尿管、尿道、食管、结肠、胸腺、和脾。在某些实施方式中，根据本文所述的方法，生成或形成胰或其部分。

在某些实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在骨上。在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在皮肤上。在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分不被打印在皮肤上。在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在肺组织、或肺或其部分上。在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在肝组织、或肝或其部分上。在另一种具体实施方式中，在受试者体内或体表打印的细胞、ecm、和/或其他组分被打印在神经组织、或神经或其部分上。

4.1.3细胞外基质(ecm)

本文所述的方法包括细胞(例如包含单一细胞的组合物和/或包含多种细胞的组合物)和细胞外基质(ecm)，包括可流动ecm，在受试者体内或体表的表面上的沉积。ecm可以来源于任何已知的ecm来源，并且可以用本领域已知的任何方法制成可流动的。在某些实施方式中，ecm包括可流动ecm。可以使用，例如下述4.1.3节所述的方法将ecm制成可流动的。在某些实施方式中，可以用下述4.1.3.2节所述的方法使ecm交联。

可以将根据本文所述的方法使用的ecm(例如可流动ecm)配制成组合物的一部分，以根据本文所述的方法使用。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的ecm包括哺乳动物ecm、植物ecm、软体动物ecm、和/或鱼ecm。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法使用的ecm包括哺乳动物ecm。在另一种具体实施方式中，根据本文所述的方法使用的ecm包括哺乳动物ecm，其中所述哺乳动物ecm来自于胎盘(例如人胎盘)。在另一种具体实施方式中，所述来自胎盘的ecm包含端肽胶原。

在另一种具体实施方式中，所述来自胎盘的ecm包含未被化学修饰或与蛋白酶接触的、碱处理的和/或去垢剂处理的i型端肽胎盘胶原，其中所述ecm包含按重量计少于5％的纤连蛋白或少于5％的层粘连蛋白；按重量计在25％-92％之间的i型胶原；和按重量计2％-50％的iii型胶原或2％-50％的iv型胶原。

在另一种具体实施方式中，所述来自胎盘的ecm包含未被化学修饰或与蛋白酶接触的、碱处理的和/或去垢剂处理的i型端肽胎盘胶原，其中所述ecm包含按重量计少于1％的纤连蛋白或少于1％的层粘连蛋白；按重量计在74％和92％之间的i型胶原；和按重量计4％-6％的iii型胶原或2％-15％的iv型胶原。

根据本文所述的方法使用的胎盘ecm，例如包含胎盘端肽胶原的ecm，可以用本领域已知的方法制备，或者可以如下所述制备。首先，通过标准方法获得胎盘组织(完整胎盘或其部分)，例如在剖腹产或正常生产之后，一旦情况许可就进行收集，例如无菌地。胎盘组织可以来自于胎盘的任何部分，包括羊膜，无论是可溶的或是不可溶的或是二者、绒毛膜、脐带或来自于完整胎盘。在某些实施方式中，由不含脐带的完整人胎盘制备胶原组合物。胎盘可以储存在室温、或大约2℃-8℃的温度，直至进一步处理。优选除去胎盘血液，即完全排出生产后剩余的胎盘和脐带血。在某些实施方式中，在生产之前对待产妇女筛查例如hiv、hbv、hcv、htlv、梅毒、cmv、和已知污染胎盘组织的其他病毒病原体。

可以在产生ecm之前对胎盘组织进行脱细胞。可以根据本领域技术人员已知的任何技术对胎盘组织进行脱细胞，例如在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中详细描述的，通过引用将其全文内容合并入本文。

可以对胎盘组织进行渗透休克。渗透休克可以是任何纯化步骤的补充，或者它可以是唯一的纯化步骤，根据本领域技术人员的判断确定。可以在本领域技术人员已知的任何渗透休克条件下进行渗透休克。这种条件包括在高渗透势、或低渗透势或高渗透势和低渗透势交替的溶液中温育组织。高渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何高渗透势溶液，例如包含nacl(例如0.2-1.0m或0.2-2.0m)、kcl(例如0.2-1.0或0.2-2.0m)、硫酸铵、单糖、二糖(例如20％蔗糖)、亲水聚合物(例如聚乙二醇)、甘油等的一种或多种的溶液。在某些实施方式中，高渗透势溶液是氯化钠溶液，例如至少0.25m、0.5m、0.75m、11.0m、1.25m、1.5m、1.75m、2m、或2.5mnacl。在一些实施方式中，氯化钠溶液是大约0.25-5m、大约0.5-4m、大约0.75-3m、或大约1.0-2.0mnacl。低渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何低渗透势溶液，例如水，例如根据本领域已知的任何方法进行去离子化的水。在一些实施方式中，渗透休克溶液包含渗透休克势小于50mmnacl的渗透休克势的水。在某些实施方式中，在氯化钠溶液中进行渗透休克，然后在水溶液中进行渗透休克。在某些实施方式中，进行一种或两种nacl溶液处理，然后再进行水洗。

在某些实施方式中，渗透休克获得的组合物随后可以与去垢剂温育。去垢剂可以是本领域技术人员已知的能够破坏细胞或亚细胞膜的任何去垢剂，例如离子型去垢剂、非离子型去垢剂、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠、tritonx100、tween等。可以在大约0℃至大约30℃、大约5℃至大约25℃、大约5℃至大约20℃、大约5℃至大约15℃、大约0℃、大约5℃、大约10℃、大约15℃、大约20℃、大约25℃、或大约30℃进行去垢剂处理。去垢剂处理可以进行，例如大约1-24小时、大约2-20小时、大约5-15小时、大约8-12小时、或大约2-5小时。

在某些实施方式中，去垢剂处理获得的组合物可以随后在碱性条件下温育。用于碱处理的特定的碱包括浓度为，例如，0.2-1.0m的生物相容的碱、挥发性碱、或任何有机或无机碱。在某些实施方式中，碱选自由nh4oh、koh和naoh组成的组，例如0.1mnaoh、0.25mnaoh、0.5mnaoh、或1mnaoh。可以在例如0℃-30℃、5℃-25℃、5℃-20℃、5℃-15℃、大约0℃、大约5℃、大约10℃、大约15℃、大约20℃、大约25℃、或大约30℃进行碱处理，处理时间为例如，大约1-24小时、大约2-20小时、大约5-15小时、大约8-12小时、或大约2-5小时。

可以不用碱处理来产生ecm；省略碱处理步骤通常导致ecm组合物与包括碱处理产生的ecm组合物相比，包含相对较多量的弹性蛋白、纤连蛋白和/或层粘连蛋白。

典型地，上述的人胎盘组织的工艺导致产生胎盘ecm，其包含未被化学修饰或与蛋白酶接触的、碱处理的和/或去垢剂处理的i型端肽胎盘胶原，其中所述ecm包含按重量计少于5％的纤连蛋白或少于5％的层粘连蛋白；按重量计在25％和92％之间的i型胶原；在2％和50％之间的iii型胶原；按重量计在2％和50％之间的iv型胶原；和/或按重量计少于40％的弹性蛋白。在更具体的实施方式中，该工艺导致产生碱处理的、去垢剂处理的i型端肽胎盘胶原，其中所述胶原未被化学修饰或与蛋白酶接触，且其中所述组合物包含按重量计少于1％的纤连蛋白；按重量计少于1％的层粘连蛋白；按重量计在74％和92％之间的i型胶原；按重量计在4％和6％之间的iii型胶原；按重量计在2％和15％之间的iv型胶原；和/或按重量计少于12％的弹性蛋白。

在某些实施方式中，本文提供的包含可流动ecm的组合物可以另外包含其他组分。在某些实施方式中，本文提供的包含可流动ecm的组合物另外包含一种或多种细胞类型，例如上述4.1.1节中详细描述的细胞类型的一种或多种。或者，根据本文所述的方法，所述细胞可以作为单独的组合物的一部分，与所述ecm的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，本文提供的包含可流动ecm的组合物另外包含水凝胶(例如热敏水凝胶和/或光敏水凝胶)。或者，根据本文所述的方法，水凝胶可以作为单独的组合物的一部分，与所述ecm的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，本文提供的包含可流动ecm的组合物另外包含一种或多种细胞类型，例如上述4.1.1节中详细描述的细胞类型的一种或多种，和水凝胶。在某些实施方式中，配制本文提供的包含可流动ecm和水凝胶(例如热敏水凝胶和/或光敏水凝胶)的组合物以使ecm∶水凝胶的比例在按重量计大约10∶1至大约1∶10的范围内。

示例性的水凝胶可以包括可以通过共价、离子、或氢键进行交联而产生三维开放式晶格结构的有机聚合物(天然的或合成的)，其捕捉水分子以形成凝胶。用于这种组合物的合适的水凝胶包括自组装肽，例如rad16。水凝胶形成材料包括多糖例如藻酸盐或其盐、肽、聚膦嗪、和聚丙烯酸酯，其进行离子交联；或嵌段聚合物例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或ph交联。在一些实施方式中，水凝胶或基质可以是生物可降解的。

在某些实施方式中，本文提供的包含可流动ecm的组合物额外包含合成聚合物。在某些实施方式中，合成聚合物包括聚丙烯酰胺、聚偏二氯乙烯、聚(邻-羧基苯氧基)-对二甲苯)(聚(cpx))、聚(丙交酯-酸酐)(plaa)、n-异丙基丙烯酰胺、季戊四醇二丙烯酸酯(penterythritoldiacrylate)、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素、和/或聚乳酸聚乙醇酸共聚物(plga)。在另一种具体实施方式中，合成聚合物包括热塑性聚合物，例如聚己酸内酯(pcl)、聚乳酸、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚乙酸乙烯酯、和/或聚氯乙烯。或者，根据本文所述的方法，一种或多种合成聚合物可以作为单独的组合物的一部分，与所述ecm的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。在某些实施方式中，合成聚合物是pcl。

在某些实施方式中，本文提供的包括可流动ecm的组合物另外包含腱生蛋白c，一种已知与纤连蛋白或其片段相互作用的人蛋白。或者，根据本文所述的方法，腱生蛋白c可以作为单独的组合物的一部分，与所述ecm的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，本文提供的包括可流动ecm的组合物额外地包含钛-铝-钒(ti6al4v)。或者，根据本文所述的方法，ti6al4v可以作为单独的组合物的一部分，与所述ecm的沉积同时、在其之前、或在其之后沉积。

在某些实施方式中，本文提供的组合物中的ecm和/或组合物中的附加组分，例如合成聚合物，可以是衍生化的。ecm和合成聚合物衍生化的方法是本领域已知的，包括，但不限于使用细胞粘附肽(例如包含一个或多个rgd基序的肽)进行的衍生化、使用细胞粘附蛋白进行的衍生化、使用细胞因子(例如血管内皮生长因子(vegf)、或骨形成蛋白(bmp))进行的衍生化、和使用葡糖氨基聚糖进行的衍生化。

4.1.3.1生成可流动ecm的方法

可以使用本领域已知的和本文所述的方法将根据本文所述的方法中使用的ecm制成可流动的。

在一个实施方式中，通过使ecm与酸或碱，例如包含足以溶解所述ecm的量的所述酸或碱的酸性或碱性溶液接触，将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。一旦ecm被制成可流动的，如果需要的话，可以通过本领域已知的方法将含ecm的组合物制成中性的，或者达到所希望的ph。

在另一个实施方式中，通过使ecm与酶或酶的组合，例如蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、和/或弹性蛋白酶接触，将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。一旦ecm被制成可流动的，如果需要的话，可以通过本领域已知的方法使酶失活。

在另一个实施方式中，可以使用物理方法将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。在某些实施方式中，通过将ecm磨碎，即研磨ecm以克服内部键合力，将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。在另一种具体实施方式中，通过剪切ecm，例如使用搅拌机或其他来源，将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。在另一种具体实施方式中，通过切割ecm，将根据本文所述的方法使用的ecm制成可流动的。在某些实施方式中，当通过使用物理方法使ecm更易流动时，可以在冷冻状态(例如ecm被冻干或在液氮中冷冻)下对ecm进行操作。

4.1.3.2交联ecm的方法

可以使用本领域已知的和本文所述的方法使根据本文所述方法使用的ecm交联。

在某些实施方式中，在其被施加于受试者体内或体表的表面上之前使ecm交联，即ecm可以在打印之前交联。根据这样的实施方式，交联剂可以被包括在包含ecm的组合物中，并且，必要时，可以在ecm打印之前在引起ecm交联的条件下处理包含ecm和交联剂的组合物。

在其他实施方式中，在其被施加于受试者体内或体表的表面上之后使ecm交联，即ecm可以在打印之后交联。在一个实施方式中，通过首先将ecm打印到所述表面上，然后将交联剂打印到所述表面上(即ecm和交联剂作为单独的组合物打印)，在其被施加于受试者体内或体表的表面上之后使ecm交联。根据该实施方式，必要时，可以随后在引起ecm交联的条件下处理ecm和交联剂使ecm交联。

在另一个实施方式中，通过将包含ecm和交联剂二者的组合物打印到表面上，并且，在所述打印之后，在引起ecm交联的条件下处理ecm和交联剂，从而使ecm在被施加于受试者体内或体表的表面上之后交联。

在某些实施方式中，通过透明质酸，一种ecm组分的化学交联使ecm交联。在另一种具体实施方式中，通过ecm蛋白的化学交联使ecm交联。化学交联透明质酸和ecm组分的示例性手段包括在例如burdick和prestwich，2011，adv.mater.23：h41-h56中描述的那些。

在另一种具体实施方式中，通过使用例如甲基丙烯酸酐和/或甲基丙烯酸缩水甘油酯使透明质酸进行光聚合，来使ecm交联(参见，例如burdick和prestwich，2011，adv.mater.23：h41-h56)。

在另一种具体实施方式中，使用酶使ecm交联。适用于ecm交联的酶包括，但不限于赖氨酰氧化酶(参见，例如，levental等人，2009，cell139：891-906)和组织类型转谷氨酰胺酶(参见，例如griffin等人，2002，j.biochem.368：377-96)。

本领域技术人员将会理解需要选择生物相容的化学交联剂，即已被视为是安全用于受试者(例如人受试者)的交联剂。

4.1.4表面

根据本文所述的方法，可使用受试者体内或体表的任何合适的表面作为细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分可以沉积(例如打印)在其上的表面。

在一个实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在其上的受试者体内或体表的表面包括已移植到所述受试者中的人造表面，即已人为制造的表面。在某些实施方式中，所述人造表面是假体。可以基于它们对受试者，例如人受试者的施用和/或移植的适合性选择这种人造表面。例如，可以选择使用已知不具有免疫原性的人造表面(即不引发宿主免疫反应的表面)。在某些实施方式中。可以对人造表面进行处理以使其适合于施用和/或移植给受试者，例如人受试者。

在一种实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在其上的受试者体内或体表的表面包括塑料表面。所述细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分可以沉积在其上的示例性类型的塑料表面包括，但不限于聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、和聚氨酯。

在一种实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在其上的受试者体内或体表的表面包括金属表面。所述细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分可以沉积在其上的示例性类型的塑料表面包括，但不限于，铝、铬、钴、铜、金、铁、铅、镁、锰、贡、镍、铂、银、锡、钛、钨、和锌。

在某些实施方式，构建细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在其上的受试者体内或体表的人造表面，使其形成特定的形状。例如，可以构建人造表面，使其成为骨骼(例如耳骨)的形状，且可以将适当的细胞(例如骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和其他骨相关细胞)、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在所述表面之上和/或之内。

在另一个实施方式中，受试者体内或体表的所述表面包括受试者(例如人受试者)的组织或器官。在某些实施方式中，来自受试者的所述组织或器官的受试者的体内或体表的表面可以被脱细胞，例如被处理以从组织或器官的全部或部分表面除去细胞。

在另一个实施方式中，通过在所述打印之前将包含生物分子的组合物沉积在所述表面上，来为本文所述的方法制备受试者体内或体表的所述表面，其中所述生物分子是一种类型的胶原、一种类型的纤连蛋白、一种类型的层粘连蛋白、或组织粘合剂，或者包含它们。

在另一种实施方式中，通过用脱细胞组织，例如脱细胞羊膜、脱细胞隔膜、脱细胞皮肤、或脱细胞筋膜覆盖所述表面的全部或部分，来为本文所述的方法制备受试者体内或体表的所述表面。

根据本文所述的方法，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分可以沉积在(打印在)受试者的任何适当的组织或器官上。在某些实施方式中，提供打印表面的受试者的组织是结缔组织(包括骨)、肌肉组织(包括内脏(平滑)肌组织、骨骼肌组织、和心肌组织)、神经组织(包括中枢神经系统组织(例如脑组织或脊髓组织)或外周神经系统组织(例如脑神经和脊髓神经))、或上皮组织(包括内皮)。在另一种具体实施方式中，提供打印表面的受试者的器官来自任何已知的哺乳动物器官系统，包括消化系统、循环系统、内分泌系统、排泄系统、免疫系统、皮肤系统、肌肉系统、神经系统、生殖系统、呼吸系统、和/或骨骼系统、在另一种具体实施方式中，提供打印表面的受试者的器官是肺、肝、心、脑、肾、皮肤、骨、胃、胰、膀胱、胆囊、小肠、大厂、前列腺、睾丸、卵巢、胸腺、和脾的全部或部分。在另一种具体实施方式中，受试者的胰为本文所述的方法提供打印表面。

在某些实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在(打印在)受试者体内或体表的表面上，所述表面包含骨或由骨组成。可以被打印在其上的示例性的骨包括长骨、短骨、扁骨、不规则骨、和籽骨(seismoidbone)。可以被打印在其上的特定的骨包括，但不限于，颅骨、面骨、耳骨、指骨、肱骨、股骨、肋骨、手骨和手指骨、脚骨和脚趾骨、踝骨、腕骨、胸骨(chestbones)(例如胸骨(stemum))等。

在某些实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在(打印在)受试者体内或体表的表面上，其中所述表面在所述受试者的外部上。在某些实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在(打印在)受试者体内或体表的表面上，其中所述表面在所述个体的内部。在某些实施方式中，细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分沉积在(打印在)受试者体内或体表的表面上，其中所述表面在所述个体的体腔或器官内部。

在某些实施方式中，作为细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分的沉积(例如通过生物打印或通过其他方式进行的沉积)支架的本文所述的受试者体内或体表的表面是尚未进行生物打印的表面。在某些实施方式中，作为细胞、可流动ecm、和/或任何附加组分的沉积(例如通过生物打印或通过其他方式进行的沉积)支架的本文所述的受试者体内或体表的表面是已进行生物打印的表面，例如已根据本文所述的方法进行生物打印。在某些实施方式中，生物打印表面包含合成材料。在某些实施方式中，合成材料是pcl。

4.2组合物

本文提供了根据本文所述方法可使用的组合物。在一个实施方式中，本文提供了根据本文所述方法适合使用的包含细胞(例如上述4.1.1节中所述的细胞)的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了根据本文所述方法适合使用的包含可流动ecm(例如上述4.1.3节中所述的可流动ecm)的组合物。在另一个实施方式中，提供了根据本文所述方法适合使用包含一种或多种交联剂(例如上述4.1.3.2节中所述的交联剂)的组合物。

在一个实施方式中，本文提供了包含细胞(例如上述4.1.1节中所述的细胞)和可流动ecm(例如上述4.1.3节中所述的可流动ecm)的组合物。在某些实施方式中，细胞包含干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞(bm-mscs)、组织塑料贴壁胎盘干细胞(pdacs)、和/或羊膜来源的贴壁细胞(amdacs)。在另一种具体实施方式中，可流动ecm来自胎盘(例如人胎盘)。

在另一种实施方式中，本文提供了包含可流动ecm(例如上述4.1.3节中所述的可流动ecm)和一种或多种交联剂(例如上述4.1.3.2节中所述的交联剂)的组合物。

在另一种实施方式中，本文提供了包含细胞(例如上述4.1.1节中所述的细胞)和一种或多种交联剂(例如上述4.1.3.2节中所述的交联剂)的组合物。

在另一种实施方式中，本文提供了包含细胞(例如上述4.1.1节中所述的细胞)、可流动ecm(例如上述4.1.3节中所述的可流动ecm)、和一种或多种交联剂(例如上述4.1.3.2节中所述的交联剂)的组合物。

在某些实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动ecm，其中所述干细胞是pdacs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是pdacs。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动ecm、和交联剂，其中所述干细胞是pdacs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。

在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动ecm，其中所述干细胞是amdacs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是amdacs。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动ecm、和交联剂，其中所述干细胞是amdacs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。

在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动ecm，其中所述干细胞是bm-mscs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是bm-mscs。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动ecm、和交联剂，其中所述干细胞是bm-mscs，并且其中所述可流动ecm来自胎盘。

本文提供的组合物，除了包含细胞(例如上述4.1.1节中所述的细胞)和/或可流动ecm(例如上述4.1.3节中所述的可流动ecm)和/或一种或多种交联剂(例如上述4.1.3.2节中所述的交联剂)之外，还可以另外包含其他组分。在某些实施方式中，本文提供的组合物另外包含水凝胶(例如热敏水凝胶和/或光敏水凝胶)。或者，可以将水凝胶配制在独立于本文提供的含细胞和ecm组合物的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物另外包含合成聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚偏二氯乙烯、聚(邻-羧基苯氧基)-对二甲苯)(聚(o-cpx))、聚(丙交酯-酸酐)(plaa)、n-异丙基丙烯酰胺、季戊四醇二丙烯酸酯(penterythritoldiacrylate)、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(plga)、和/或热塑性聚合物(例如聚己酸内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚乙酸乙烯酯、和/或聚氯乙烯)。或者，可以将合成聚合物配制在独立于本文提供的含细胞和ecm组合物的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物另外包含腱生蛋白c或其片段。或者，可以将腱生蛋白c或其片段配制在独立于本文提供的含细胞和ecm组合物的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物另外包含钛-铝-钒(ti6al4v)。或者，可以将ti6al4v配制在独立于本文提供的含细胞和ecm组合物的组合物中。

在某些实施方式中，本文提供的组合物另外包含一种或多种促进组合物中使用的细胞的生存、分化、增殖等的附加组分。这种组分可以包括，但不限于，营养物、盐、糖、存活因子、和生长因子。根据本文所述的方法中可以使用的示例性生长因子包括，但不限于，胰岛素样生长因子(例如igf-1)、转化生长因子-β(tgf-β)、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、结缔组织生长因子(ctgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(1、2和3)、骨桥蛋白、骨形成蛋白-2、生长激素如促生长素、细胞引诱剂和粘附剂等、及其混合物。或者，可以将一种或多种促进组合物中使用的细胞的生存、分化、增殖等的附加组分配制在独立于本文提供的含细胞和ecm组合物的组合物中。

4.3应用

本文所述的方法可以用于任何适当的目的。在某些实施方式中，本文所述的方法用于治疗目的，例如，细胞、ecm、和/或其他附加组分被打印在受试者体内或体表，以获得在所述受试者中的治疗效果。

4.3.1治疗应用

在某些实施方式中，本文所述的方法用于治疗需要移植(例如组织或器官移植)的受试者。在某些实施方式中，本文所述的方法用于治疗需要移植(graft)(例如皮肤移植)的受试者。移植，包括移植(grafting)(例如皮肤移植)的方法和手术移植程序对本领域技术人员来说是公知的，并且可以对其进行修改以符合本文所述的方法。

在某些实施方式中，本文所述的方法中使用的细胞和/或ecm来自于移植受者。在其他实施方式中，本文所述的方法中使用的细胞和/或ecm并非来自于移植受者，而是来自于另一个受试者，例如供者、尸体等。在某些实施方式中，本文所述的方法中使用的细胞来自于移植受者，而本文所述的方法中使用的ecm并非来自于移植受者，而是来自于另一个来源。在某些实施方式中，本文所述的方法中使用的ecm来自于胎盘(例如人胎盘)。在某些实施方式中，本文所述的方法中使用的ecm来自于移植受者，而本文所述的方法中使用的细胞并非来自于移植受者，而是来自于另一个来源。

在某些实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成上皮组织(例如皮肤、真皮、或表皮)，其中所述受试者需要这样的上皮组织(例如受试者是烧伤病人或者患有某种形式的皮肤病)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，方法中使用的至少一种细胞组合物包含表皮细胞。在另一种具体实施方式中，方法中使用的至少一种细胞组合物包含真皮细胞。在另一种具体实施方式中，方法中使用的至少一种细胞组合物包含间充质干细胞。在另一种具体实施方式中，该方法中使用的一种或多种细胞组合物(thecellularcomposition(s))包含表皮细胞、真皮细胞、和间充质干细胞。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者皮肤的一部分。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法不用于在受试者体内或体表的表面上生成上皮组织(例如皮肤、真皮、或表皮)。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成结缔组织(例如骨)，其中所述受试者需要这样的结缔组织(例如受试者患有骨质疏松症或骨癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的一块或多块骨。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成神经组织(例如脑组织或脊髓组织)，其中所述受试者需要这样的神经组织。在某些实施方式中，所述受试者已被诊断患有神经系统疾病(例如中枢或外周神经系统疾病)。在另一种具体实施方式中，所述受试者受到外伤，损坏了受试者的中枢或外周神经系统，例如受试者经受了外伤性脑损伤(tbi)或脊髓损伤(sci)。在另一种具体实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的脑。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的脊髓。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成肝组织，其中所述受试者需要这样的肝组织(例如受试者患有肝硬化、肝炎、或肝癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的肝。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成肺组织，其中所述受试者需要这样的肺组织(例如受试者患有肺癌、肺气肿、或copd)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的肺。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成循环系统组织(例如心脏组织、动脉、或静脉)，其中所述受试者需要这样的循环系统组织(例如受试者患有心脏病、冠状动脉疾病、或心脏瓣膜问题)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的心脏。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的一条或多条动脉或静脉。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成肾组织，其中所述受试者需要这样的肾组织(例如受试者患有某种形式的肾病)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，方法中使用的细胞组合物包含至少一种类型的实质细胞和一种类型的基质细胞。在另一种具体实施方式中，所述一种类型的实质细胞和所述一种类型的基质细胞存在于由自体同源(autologous)或同种异源(allogeneic)的肾组织解聚的肾细胞群中。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的一个或两个肾。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成胰组织，其中所述受试者需要这样的胰组织(例如受试者患有胰腺癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的胰脏。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成前列腺组织，其中所述受试者需要这样的前列腺组织(例如受试者患有前列腺癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的前列腺。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成胃组织，其中所述受试者需要这样的胃组织(例如受试者患有胃癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的胃。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成结肠组织，其中所述受试者需要这样的结肠组织(例如受试者患有结肠癌)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的结肠。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成肠组织(例如与小肠或大肠相关的一种或多种组织))，其中所述受试者需要这样的肠组织(例如受试者患有肠部疾病)。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者小肠的一部分。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者大肠的一部分。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成食道组织，其中所述受试者需要这样的食道组织。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的食道。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者体内或体表的表面上生成甲状腺组织，其中所述受试者需要这样的甲状腺组织。在某些实施方式中，所述受试者是人。在另一种具体实施方式中，受试者的表面是受试者的甲状腺。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在受试者中沉积细胞，其中所述细胞被工程化以表达一种或多种因子(例如蛋白质或多肽)，并且其中所述受试者需要所述的一种或多种因子，例如受试者缺乏所述的一种或多种因子(例如由于基因突变或遗传易感性)。在某些实施方式中，受试者是人，例如具有遗传病或失调的人，其中所述遗传病或失调可以全部或部分地用所述一种或多种因子进行治疗。在另一种具体实施方式中，受试者是患有可以全部或部分地用所述的一种或多种因子治疗的疾病的人。根据这样的实施方式，细胞可以沉积在所述受试者体内或体表的任何表面上，只要由所述细胞表达的一种或多种因子的量足以治疗所涉及的疾病或失调。所述细胞可以沉积在其上的受试者体内或体表的示例性组织和器官在上述4.1.2节中描述。可以由所述细胞产生的示例性因子在上述4.1.1节中描述。

4.3.2患者群体

本文所述的方法可用于使不同的患者群体受益。在一个实施方式中，本文所述的方法用于需要器官移植的受试者。在另一个实施方式中，本文所述的方法用于需要治疗疾病或失调的受试者。

在某些实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有癌症的受试者中构建组织，即替换所述患者的已受到癌症影响的一个或多个器官/组织的全部或部分。在某些实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为骨或结缔组织肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌(sclc)、(nsclc)、喉癌、和间皮瘤)、结肠癌和/或前列腺癌的受试者中构建组织。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有呼吸系统疾病的受试者中构建组织，例如所述患者已被诊断患有哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、肺气肿、肺炎、肺结核、肺癌和/或囊性纤维化。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有肝病的受试者中构建组织，例如所述受试者已被诊断患有肝炎(例如甲型、乙型或丙型肝炎)、肝癌、血色素沉着症、或肝硬化。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有骨癌(例如骨肉瘤)、骨坏死、代谢性骨病、进行性骨化性纤维发育不良或骨质疏松症的受试者中构建组织。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有神经系统疾病(例如中枢或外周神经系统)的受试者中构建组织，例如所述受试者已被诊断脑癌、脑炎、脑膜炎、阿尔茨海默病、帕金森氏病、中风、或多发性硬化。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在经受损坏受试者的中枢或外周神经系统的外伤的受试者中构建组织，例如所述受试者经受了外伤性脑损伤(tbi)或脊髓损伤(sci)。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有循环系统的受试者中构建组织，例如所述受试者已被诊断患有冠心病、心肌病肝炎(例如内源性或外源性心肌病)、心力衰竭、中风、验证性心脏病、高血压性心脏病、或心脏瓣膜病。

在另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为患有肾病的受试者中构建组织。在一个实施方式中，受试者有一个肾发生功能障碍。在另一个实施方式中，受试者两个肾均发生功能障碍。

另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为遗传病或失调的受试者中构建组织，例如所述受试者已被诊断患有家族性高胆固醇血症、多囊肾病、或苯丙酮尿症。

另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为糖尿病的受试者中构建组织。

另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在已被诊断为腭裂的受试者中构建组织。

另一种具体实施方式中，本文所述的方法用于在经受需要穿刺受试者皮肤的正规程序的受试者(例如受试者是透析患者)中构建组织。

在一些实施方式中，接受根据本文所述方法生成的组织或器官移植的受试者是动物。在某些实施方式中，所述动物是鸟类。在某些实施方式中，所述动物是犬。在某些实施方式中，所述动物是猫。在某些实施方式中，所述动物是马。在某些实施方式中，所述动物是奶牛。在某些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如马、猪、小鼠、或灵长类，优选是人。在某些实施方式中，接受根据本文所述方法生成的组织或器官移植的受试者是人。

在某些实施方式中，接受根据本文所述方法生成的组织或器官移植的受试者是人类成人。在某些实施方式中，接受根据本文所述方法生成的组织或器官移植的受试者是人类婴儿。在某些实施方式中，接受根据本文所述方法生成的组织或器官移植的受试者是人类儿童。

4.4试剂盒

本文提供药物包或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装有本文所述的组合物的一种或多种成分。任选地，伴随这种容器的可以是在形式上由政府机构规定的管理药物或生物制品的制造、使用或销售的公告(notice)，所述公告表明获得政府机构批准进行制造、使用或销售，用于人给药。

在某些实施方式中，本文提供的试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文所述的细胞和本文所述的可流动ecm。这种试剂盒可以任选地包含组合物，所述组合物包含一种或多种附加组分。本文包括的试剂盒可用于根据本文所述的方法。

5实施例

5.1实施例1：生物打印的支架支持胎盘干细胞的粘附和生长

本实施例证明合成材料可以被生物打印，以产生纤维直径和孔径可控的支架，并且这种支架为细胞外基质(ecm)的应用提供了合适的基材。本实施例进一步证明包含生物打印合成材料和ecm的支架(混合支架)代表了一种合适的基材，用于细胞，包括胎盘细胞，例如胎盘干细胞的粘附和生长。

5.1.1方法

为了制造包含合成材料和ecm的混合支架，首先使用生物打印机(envisiontec，gladbeck，德国)将聚己酸内酯(pcl)(mn45,000，sigma)打印到支架上(54×54×0.64mm)。打印条件如下：温度为90℃，打印压力为3～5.5巴，打印速度为2～6mm/s，用合适尺寸的针头。如前所述从人胎盘中分离ecm(参见，例如bhatiamb，wounds20，29，2008)。将分离的ecm施加于生物打印pcl支架的两面，使其干燥(脱水)，以生成包含pcl和ecm的混合支架。将获得的混合pcl-ecm支架插入10mm直径的盘上，用介质预湿过夜，并用根据本文所述方法制备的胎盘干细胞(参见，例如4.1.1节)接种，密度为12,500个细胞/cm²。细胞培养8天的时间。在不同的时间点(n＝3)根据标准方案进行钙黄绿素染色和mts增殖检测，以确定细胞活力和增殖。

5.1.2结果

通过优化打印条件，生成了不同纤维尺寸、孔径和孔结构的pcl支架(图1)。打印的纤维形成稳定的网络，用于生成包含pcl和ecm的混合支架。进一步，不同纤维尺寸和孔结构的打印使得能够制造包含不同性能的混合支架。

生物打印pcl支架的两面上ecm的脱水导致生成混合支架。在pcl和ecm之间观察到良好的融合；当通过对支架的处理或培养，包括脱水，对混合支架进行操作时，没有察觉到在pcl和ecm之间的分离(图2)。

随着时间经过，胎盘干细胞遍布于混合支架表面，并且到培养6天时覆盖了混合支架表面的大部分。mts细胞增殖检测证明细胞数量随着时间显著增加(图3)。此外，在8天的培养期中，接种在混合支架上的胎盘干细胞证明有良好的活性，如钙黄绿素染色所显示的(图4)。这些数据共同表明pcl-ecm混合支架支持细胞粘附、生存、和生长。

5.1.3结论

本实施例证明可以通过包括生物打印的方法生成包含ecm和合成材料(pcl)的混合支架，并且细胞不仅仅是粘附在该支架上，而且当在该支架上培养时能够存活和增殖。

5.2实施例2：生物打印支架支持胎盘干细胞的粘附和生长

本实施例证明合成材料和包含细胞，例如胎盘细胞，例如胎盘干细胞的ecm，可以被同时生物打印以产生混合支架。如本实施例所证明的，生物打印细胞不仅在生物打印过程中存活，并且，在用混合支架进行培养时随时间而增殖。

5.2.1方法

如实施例1所述制备ecm并与包含1百万个/ml胎盘干细胞的0.5％藻酸盐水凝胶混合。接下来，pcl和含细胞ecm被成层生物打印，以生成包含pcl和ecm的混合支架。在支架的每一层中，首先打印pcl，然后打印ecm/细胞组分以充满pcl纹路之间的空隙。这种层打印两层或五层，并用cacl2溶液交联已生成混合支架。培养生物打印的含细胞支架(细胞/ecm/pcl)七天，在不同的时间点通过钙黄绿素染色和mts细胞增殖检测评价细胞增殖和存活。

5.2.2结果

在细胞培养的整个过程中，生物打印的支架保持完整的结构(图5)。pcl为ecm水凝胶提供了良好的结构支持，这允许生成三维构建体。在生物打印和整个培养之后，细胞较好地遍布于三维构建体上；在培养过程中发现贯穿支架的纵深方向存在细胞(图6)。

胎盘干细胞在生物打印过程中存活并在整个培养过程中在三维生物打印混合支架中继续增殖，如钙黄绿素染色所证明的(图7)。如图8所示，发现大部分细胞遍布于混合支架中的ecm，表明ecm促进细胞粘附和在ecm水凝胶中的散布。通过将细胞在单独的藻酸盐中的位置与细胞在支架中的位置进行比较可以证明这一点。此外，如图9所示，mts细胞增殖检测证明对于2层和5层的支架，细胞数量均增加，表明这些混合支架支持细胞生长。

5.2.3结论

本实施例证明可以通过这样的方法生成包含ecm和合成材料(pcl)的混合支架，所述方法包括同时生物打印ecm和pcl。本实施例还证明了这样的事实，细胞可以与混合支架的组分(ecm和pcl)一起进行生物打印，并且所述细胞在生物打印过程中存活。进一步，当在这种支架上培养时，与混合支架组分一起进行生物打印的细胞增殖，并且与在单独的细胞基质(藻酸盐)中培养时相比，更好地散布于整个支架上。

5.3实施例3：功能性生物打印支架

本实施例证明合成材料和包含细胞的ecm可以被生物打印以产生功能性支架。

将β-tc-6，一种胰岛素产生细胞，与来自人胎盘的细胞外基质(ecm)生物打印到生物打印支架中。该支架的尺寸是15×15×2.5mm，包括5层。在每一层中，首先打印聚己酸内酯(pcl)，然后打印β-tc-6细胞，以藻酸盐-ecm水凝胶(1％藻酸盐和12％ecm)中15百万个细胞/ml的量在pcl纹路之间混合。将整个支架浸在1％氯化钙溶液中交联20分钟。然后在细胞培养箱中，在6孔板中在含有15％胎牛血清的deme培养基中(每孔3-5ml培养基)培养支架。在不同的时间点，收获支架进行钙黄绿素染色和mts增殖检测，以分别表征细胞活力和细胞增殖。图10显示了生物打印支架的结构。

钙黄绿素染色证明β-tc-6细胞在打印过程中存活并在培养过程中保持活力。支架的剖视图表明细胞均匀分布于整个支架上，并在每一层中保持存活(参见图10)。mts检测证明胰岛素产生β-tc-6细胞保持存活达3周，存活细胞的总体数量保持恒定(参见图11)。

为了确定β-tc-6细胞是否能在生物打印支架中发挥功能，测量细胞的胰岛素产生。为了测量胰岛素产生，将生物打印支架暴露于新鲜培养基(6孔板中，3ml/孔)2小时，并通过小鼠胰岛素elisa试剂盒(millipore)测量来自每一个支架的上清等分的胰岛素浓度。在第0天检测到最高水平的胰岛素产生(参见图12)。在之后的培养物中(第3天和第6天)分泌的胰岛素水平下降，但从第3天至第6天在培养物中保持稳定(参见图12)。因此在进行生物打印后β-tc-6细胞保持产生和分泌胰岛素的能力。

胰腺中胰岛素产生细胞的主要功能是产生胰岛素应对血液中增加的葡萄糖水平。因此将支架暴露于葡萄糖激增负荷，来检查包含pcl、ecm和β-tc-6细胞的生物打印支架是否保持此功能(参见图13)。将一个支架(图13中的“a”)暴露于葡萄糖饥饿条件(不含葡萄糖的imdm培养基，含10％fcs)两天，然后负荷以胰岛素产生条件(50mm葡萄糖/1mmibmx)。作为对照，将生物打印支架保持在具有稳定葡萄糖水平的正常培养基中(图13的“b”和“c”)。在对照中，在对测试支架(即图13的a)进行胰岛素产生条件负荷的同时更换培养基。每半个小时对每一个培养物(a、b和c)的上清进行取样并通过elisa测定每一个上清的胰岛素浓度。图13显示了不同时间点每一个培养物的胰岛素产生水平，并证明暴露于葡萄糖饥饿条件，并随后负荷以胰岛素产生条件的生物打印支架(即图13的a)在负荷后3小时产生的胰岛素比负荷后0.5小时产生的胰岛素水平高多于80倍，而对照(即图13的b和c)产生更少的胰岛素(在更换培养基后3小时产生的胰岛素仅仅比更换培养基后0.5小时产生胰岛素水平高大约2倍)。

本实施例证明可以生成包含合成材料、细胞和ecm的生物打印支架，并且生物打印支架的细胞同时保持存活和功能性。

本文公开的组合物和方法并不限于本文公开的具体实施方式的范围。事实上，除了所描述的之外，对组合物和方法的各种修改对本领域技术人员来说将会由前文的描述和附附图而变得显而易见。这种修改将落入所附权利要求的范围。

本文引用了各种出版物、专利和专利申请，通过引用将其全文公开的内容合并入本文。