用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记及检测引物对、试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记及检测引物、试剂盒和应用，属于分子生物学检测
技术领域：
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背景技术：
：马鹿(cervuselaphus)属偶蹄目、鹿科、鹿属，全世界有22个亚种，主要分为东部马鹿和西部马鹿两大类群。中国分布8个亚种(西藏亚种、东北亚种、阿拉善亚种、阿尔泰亚种、四川亚种、天山亚种、塔里木亚种、甘肃亚种)。目前我国在亚种基础上已培育了3个培育品种(塔河马鹿、清原马鹿、天山马鹿)、1个地方品种(东北马鹿)、5个饲养种群(天山种群、阿尔泰种群、甘肃种群、阿拉善种群和青海种群)。鹿茸等产品应用于人类的医疗保健已有两千多年的历史。鹿肉细嫩，味道鲜美，具有高蛋白、低脂肪、易消化的特点，且有一定的食用价值。中国历代本草和现代药典都记载梅花鹿和马鹿为地道鹿产品，其它鹿种产品视为替代品、习用品，甚至伪品。随着需求的日益增加，市场出现的鹿产品多种多样，良莠不齐，经常出现以驯鹿、赤鹿产品被当作梅花鹿、马鹿产品出售，以次充好，甚至有出现其他非鹿科动物(如牛、猪、羊等)产品以假乱真，被当作鹿产品来销售。严重扰乱了鹿茸及副产品的市场秩序，进而阻碍了鹿产业的深度健康发展。市场上出现鹿茸及副产品的替代品原因众多，其中最主要的是新西兰每年近千吨赤鹿产品涌入中国市场，以假乱真，以次充好的现象严重，从而使得消费者遭受经济损失，阻碍我国养鹿业健康发展。目前对鹿产品鉴别的方法大致可分为四类：性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和分子鉴别。性状鉴别和显微鉴别最为简单方便，但其准确性也最低。理化鉴别方法较之性状鉴别和显微鉴别，准确性较高，主要有光谱鉴别、免疫学方法、醋酸纤维素膜电泳等。分子鉴别方法是目前研究的热点，具有准确性高、反应灵敏、操作简单等优点，且分子标记不受环境因素影响，因而被广泛应用于动物产品鉴别及种源鉴定。但是，目前我们缺乏有效鉴别赤鹿和中国马鹿产品的检测技术，赤鹿和中国马鹿产品的精准鉴别依然是本领域的难题。因此，急需开展中国马鹿和赤鹿亚种间精准鉴别的研究工作，实现鹿产品溯源，保护我国马鹿资源。技术实现要素：针对上述现有技术的不足，本发明提供用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记及检测引物、试剂盒和应用。本发明获得了可以用于精准鉴别中国马鹿与赤鹿产品的snp标记、鉴定方法和鉴定试剂盒，实现了马鹿茸及副产品的精准鉴别，为马鹿产品精准检测标准的制定提供直接依据。本发明提供一种用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记，所述snp标记包括5个snp标记位点：s-1、s-2、s-3、s-4、s-5；位点信息如表1所示：表1、本发明用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记位点标记鹿mtdna基因组位点赤鹿马鹿s-1cox3基因500bp片段第65bpgas-2cox3基因500bp片段第139bpcts-3cox3基因500bp片段第208bptcs-4cox3基因500bp片段第286bpags-5cox3基因500bp片段第418bptc本发明还提供用于鉴别中国马鹿和赤鹿的引物对，所述引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。用所述引物对扩增待测样品，若扩增得到的片段序列的第65位、第139位、第208位、第286位、第418位的碱基，分别为g、c、t、a、t(即序列如seqidno.3所示)，则待测样品为赤鹿；若分别为a、t、c、g、c(即序列如seqidno.4所示)，则待测样品为中国马鹿。本发明还提供所述snp标记或引物对在鉴别中国马鹿和赤鹿中的应用，及制备试剂盒或在检测方法中的应用，所述试剂盒或检测方法的用途为鉴别中国马鹿和赤鹿。本发明进一步提供一种鉴别中国马鹿和赤鹿的方法，所述方法是：提取待测样本dna，用seqidno.1和seqidno.2所示引物对进行pcr扩增；对pcr产物进行测序，根据snp标记位点碱基即可鉴别待测样品是赤鹿还是中国马鹿。本发明还提供一种鉴别中国马鹿和赤鹿的试剂盒，所述试剂盒包括seqidno.1和seqidno.2所示引物对。本发明确定5个用于鉴别中国马鹿与赤鹿特异性的snp位点，得到了一对鉴别引物，建立了鉴别中国马鹿和赤鹿的的方法。为中国马鹿与赤鹿产品鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法。本发明弥补了本领域目前尚无鉴别中国马鹿与赤鹿产品的检测技术的不足，实现对中国马鹿与赤鹿产品的精准鉴别。本发明鉴别中国马鹿和赤鹿的实验基础是pcr反应，因此设计鉴定性引物是其中关键环节，引物因素直接影响pcr特异性和灵敏度。一方面，引物必须具有物种的特异性，且扩增的片段必须包含中国马鹿共有snp和赤鹿独有的snp差异位点，这样可以通过测序结果直接比对鉴定。引物设计时要排除引物与模板间的相互干扰，如引物二聚体、非特异性扩增等。另一方面，由于市售鹿茸及副产品经过不同工艺加工处理，导致鹿茸及副产品提取的dna样本可能会有不同程度的降解。为了应用于市场中马鹿鹿茸及副产品的实际检测，因此，本发明选择扩增的目的片段大小为570bp左右，从而可以避免经高温处理的鹿茸及副产品中dna遭到破坏而无法检测。这样极大提高了检测的准确性。本发明具有下列优点及有益效果：(一)本发明提供了准确鉴别中国马鹿和赤鹿的5个特异性snp位点，设计了一对鉴别引物，并建立了准确可靠的检测方法。本发明提供的方法用于鉴别中国马鹿和赤鹿，精确可靠，分子标记组合简化了鉴别程序，操作简单，易于掌握，推广性强。本发明方法具有很好的特异性、稳定性和高灵敏度，检测限为0.25ng/ul。(二)本发明首次将分子标记的技术应用于鉴别中国马鹿和赤鹿，有效避免了因外观形态难以区分造成的经济损失，有助于解决鹿产品市场混乱和种质资源混杂的问题，可提高鹿产品市场的监管和保护力度。用本发明方法检测了辽宁西丰马鹿产品市场的100个鹿茸及副产品(采自5个商店)。结果表明87个鹿茸片中其中赤鹿占94％，马鹿茸占6％。13个鹿鞭产品中赤鹿鞭占85％，马鹿鹿鞭占15％。本发明分子鉴定的方法与用nj法构建系统发育树进行聚类分析来验证检测结果完全一致，准确率为100％。(三)本发明从基因水平上拓展了马鹿可用标记位点范围，为马鹿种质资源鉴定提供了新思路和方法，为育种和生产中种质资源选择的准确性提供了保障，对马鹿种质资源鉴定，dna指纹图谱绘制，本土品种保护和管理等方面具有重要理论与应用价值。附图说明图1为赤鹿与中国马鹿mtdna序列差异性snp位点。cl：赤鹿；al：阿尔泰马鹿；db：东北马鹿；gs：甘肃马鹿；qy：清原马鹿；tl：塔河马鹿；ts：天山马鹿。图2为实施例2设置温度梯度电泳检测结果。m：dnamaker1000；1-3：61℃；4-6：59℃；7-9：57℃；10-12：55℃；13-15：53℃；16：空白对照。图3为实施例2不同温度下扩增条带的测序文件。图4为实施例3特异性实验结果。m：dnamaker1000；1-2：白唇鹿；3-4：梅花鹿；5-6：赤鹿；7：阿尔泰马鹿；8：东北马鹿；9：清原马鹿；10：甘肃马鹿；11：塔河马鹿；12-13：鸭；14：空白对照。图5为实施例3稳定性实验结果。m：dnamaker1000；1-3：pcr仪器型号-mastercyclernexus；4-6：pcr仪器型号-thermalcycler；7-9：pcr仪器型号-梯度pcr仪；10-12：上午时间操作；13-15：中午时间操作；16-18：下午时间操作；19-21：不同人员操作；22：空白对照。图6为实施例3灵敏度实验结果。m：dnamaker1000；1：原液作阳性对照；2：5倍稀释；3：10倍稀释；4：100倍稀释；5：200倍稀释；6：400倍稀释；7：800倍稀释；8：1000倍稀；9：空白对照。图7为实施例4鹿产品nj法聚类分析结果。lr1-87：鹿茸；lb88-100：鹿鞭；cl：赤鹿；th：塔河马鹿；db：东北马鹿；gs：甘肃马鹿；al：阿拉善马鹿；ts：天山马鹿；xl：驯鹿。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。实施例1、用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记的获得1、dna提取提取白唇鹿、梅花鹿、阿尔泰马鹿、东北马鹿、清原马鹿、甘肃马鹿、塔河马鹿、鸭等的基因组dna，操作步骤见天根血液基因组试剂盒(dp304)说明书。2、中国马鹿与赤鹿差异snp位点筛选根据赤鹿、中国马鹿(包括塔河马鹿、阿尔泰马鹿、甘肃马鹿、青海马鹿、天山马鹿、东北马鹿、阿拉善马鹿、西藏马鹿、川藏马鹿、高产鹿王)的mtdna全序列，用mega6.0比对，初筛差异性snp位点123个，最终选取赤鹿和中国马鹿的cox3基因片段上的7个特异性snp鉴别位点(筛选snp位点主要从三个方面考虑：一是找出赤鹿独有snp且中国马鹿共有的特异性snp位点；二是选择易扩增且包含snp位点多的片段；三是考虑测序稳定性和成本)。然后利用bioedit7.0截取cox3基因片段，序列长度大小为570bp，用于设计鉴别引物。3、引物设计根据截取的目的基因片段，结合primer5.0与oligo7.0设计鉴别引物。最终选择的鉴别引物序列：f：5'ccaaacccacgcttatcaca3'(seqidno.1)；r：5'agccataaactccgtctgaa3'(seqidno.2)。引物设计好后由吉林省库美生物公司合成。利用该引物对22个中国马鹿新个体(4个东北马鹿、5个甘肃马鹿、5个清原马鹿、5个塔河马鹿、3个阿尔泰马鹿)扩增，送至吉林省库美生物公司测序。测得22个目的基因序列，经bioedit7.0对比峰图人工校正，去除两端不准的序列，通过mega6.0分析50个赤鹿序列与新获得的22条中国马鹿序列，最终确定赤鹿和中国马鹿鉴别用的snp标记，共5个(确定5'端起第65位、第139位、第208位、第286位、第418位的碱基)。如果第65位碱基为g、第139位为c、第208位和418位为t、第286位为a则鉴定为赤鹿，如果第65位碱基为a、第139位为t、第208位和418位为c、第286位为g则鉴定为中国马鹿(图1箭头标出)。实施例2、鉴别中国马鹿和赤鹿的方法的建立根据上述seqidno.1和seqidno.2所示引物对，进行pcr实验，以建立鉴别中国马鹿和赤鹿的方法。该引物退火温度理论值为57℃，每隔2℃设一个梯度，在理论值上下5℃范围内。即退火温度设为53℃、55℃、57℃、59℃，61℃同一温度用三个不同样本dna模板进行实验，条件如表2。表2pcr检测反应条件产物电泳检测结果(见图2)：tm为61℃、53℃时，无电泳条带，说明tm过低或过高都影响引物与模板的结合。tm为57℃，有一个样本dna无法扩增出条带，说明tm为57℃时，引物扩增不稳定。当tm为55℃、59℃时，均出现明亮单一的条带，符合测序要求，测序结果见图3，当tm为55℃时，测序结果不理想，当tm为59℃，测序结果完整，峰图完整。说明tm为59℃时扩增效果好、引物与模板结合稳定。因此，最佳退火温度为59℃。确定了退火温度后，进一步优化反应条件，最终确定pcr反应体系包括：所述pcr扩增的过程为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、59℃退火30sec、72℃延伸30sec，共进行30～35个循环；72℃再延伸5min，4℃保存。实验结果表明本发明成功建立了有效鉴别中国马鹿和赤鹿的方法。实施例3本发明方法特异性、稳定性、灵敏度实验一、特异性：利用本发明鉴定性引物扩增鹿科动物分别为：白唇鹿、梅花鹿、赤鹿、东北马鹿、清原马鹿、甘肃马鹿、塔河马鹿和鸭，进行pcr，判断引物的特异性。产物电泳检测结果见图4，鹿科动物均能扩增出单一、明亮的条带，非鹿科动物(鸭)无条带。说明本发明具有物种特异性。二、稳定性：不同操作人员同一时间或不同时间(上午、中午、下午)或者在不同pcr仪器操作，通过观察电泳图条带的有无，来进行稳定性验证。在不同人员、不同时间以及在不同pcr仪器下，使用本发明方法检测马鹿产品dna，结果表明pcr产物均能扩增出明亮单一的电泳条带(见图5)。说明本发明方法具有稳定性。三、灵敏度：将鹿茸及副产品提取的dna按照一定比例稀释至100ng/ul，然后按着倍比稀释，pcr扩增样品dna，观察电泳图条带亮度，直到看不出条带为止。由图6可知，当稀释到400倍时，条带明亮；稀释至800倍时条带变弱且不清晰；稀释至1000倍则完全无条带。说明本发明灵敏度高，检测限为0.25ng/ul。实施例4.本发明鉴别中国马鹿和赤鹿的方法的具体应用一、试验方法：从辽宁西丰马鹿产品市场随机购买100个鹿产品(87个鹿茸片、13个鹿鞭)；使用本发明方法检测鹿茸和鹿鞭，进行pcr扩增，扩增产物送吉林省库美生物公司测序，通过bioedit7.0对测序峰图进行分析，得到序列。用mega6.0比对分析待测样品和已知赤鹿序列，以中国马鹿和赤鹿差异性snp位点上的碱基作为判定依据。利用本发明设计的鉴别性引物，pcr扩增100个鹿产品，得到100条cox3基因序列，ncbi下载的赤鹿(nc_007704)、东北马鹿(gu457434.1)、塔河马鹿(gu457435.1)、甘肃马鹿(nc_039923.1)、阿拉善马鹿(ku942399.1)、天山马鹿(nc_014703.1)、驯鹿(nc-007703)用bioedit7.0比对截取相应cox3目的基因片段，利用mega6.0和evolview在线软件(https://www.evolgenius.info/evolview/#mytrees/100-1/100-1)，以驯鹿为外源，bootstrap值为1000次，用nj法构建系统发育树进行聚类分析来验证检测结果。二、实验结果1、本发明snp分子标记鉴别的方法检测市售鹿茸及副产品的结果根据本发明确定的mtdna特异性snp分子标记来判定。鉴别结果见表3：有5个鹿茸片为马鹿鹿茸、76个鹿茸片为赤鹿茸、6个鹿茸片疑似为赤鹿茸片。5个鹿茸片(产品序号：lr83-lr87)测得的mtdna序列在第65位、139位、208位、286位、418位的碱基分别为a、t、c、g、c，与中国马鹿一致，说明这5个鹿茸片为马鹿鹿茸，将这5个马鹿序列放入ncbi数据库中进行比对，我们认为这5个马鹿茸很有可能是天山马鹿鹿茸(登录号：kj025072.1)，同源性达到99％以上。76个鹿茸片(产品序号：lr1-lr76)的mtdna序列的由5’端开始在第65位(g)、139位(c)、208位(t)、286位(a)、418位(t)，与赤鹿一致，表明该76个鹿茸片为赤鹿茸；4个鹿茸片(产品序号：lr77-lr80)的mtdna序列只有第65位、139位、208位碱基与马鹿一致，第286位、418位碱基与赤鹿的相同，将这些序列放入ncbi数据库进行比对发现，与赤鹿(登录号：mf872247)同源性为97.73％以上，与中国马鹿同源性为97.39％-97.73％；这4个鹿茸片疑似为赤鹿鹿茸片，2个鹿茸(产品序号：lr81-lr82)的目的基因序列第65位、208位与马鹿一致，第139位、286位、418位上的碱基与赤鹿相同，将该序列放入ncbi数据库比对，发现与赤鹿(登录号：mf872247)、青海马鹿(登录号：kx449334)同源性相同，均为98.49％，猜测这可能是由于鹿茸在加工过程中，将马鹿鹿茸和赤鹿茸相互掺杂造成的。同理，13个鹿鞭产品中的鉴别结果为2个马鹿鹿鞭、7个赤鹿鞭、4个鹿鞭产品疑似为赤鹿鹿鞭。2个马鹿鹿鞭(产品序号：lb99-lb100)mtdna序列中，用于鉴定snp位点上的碱基与中国马鹿一致，将这些序列放入ncbi比对，与天山马鹿同源性均为99.24％。7个赤鹿鞭(产品序号：lb88-lb94)上snp位点上的碱基与赤鹿一致。4个鹿鞭(产品序号：lb95-lb98)测得序列在鉴别性snp位点上第65位、208位的碱基与马鹿一致，而第139位、286位及418位与赤鹿相同，将这些序列放到ncbi数据库查看，发现与赤鹿(登录号：mf872245)、中国马鹿(kx449334.1)同源性均达到98.30％，说明该鹿鞭产品含有赤鹿源性成分。综上所述，说明用本文组装的试剂盒鉴别马鹿茸及副产品时，只有当5个snp分子鉴定的标记都与马鹿上的碱基完全相同，才可判定为马鹿产品。表3鹿产品检测结果2、鹿产品dna序列聚类分析结果通过mega6.0和evolview对鹿产品mtdna序列与ncbi中公布的中国马鹿、赤鹿序列做了聚类分析，以驯鹿为外源，构建nj法进化树，结果如图7：lr83-lp87和lb99-lb100与中国马鹿聚为一大支系，76个赤鹿鹿茸(lr1-lr76)和7个赤鹿鹿鞭(lb88-lb94)及10个疑似赤鹿样本(lr77-lr82、lb95-lb98)均与赤鹿聚为一大支系，与本发明依据中国马鹿与赤鹿差异性snp位点的鉴定结果一致。说明本发明方法检测马鹿产品时，可以依据差异性snp位点进行鉴别。进一步验证了本发明方法检测结果高度真实有效。分子鉴别试剂盒是基于dna的分子检测方法。因此，使用分子鉴别试剂盒检测鹿茸及副产品时，首先需要对待检测产品提取dna。dna提取的方法包括传统方法(常用的是饱和酚仿抽提法)和试剂盒提取法两种。传统dna提取方法，虽能获取高纯度dna，但耗时长、dna回收率低、长期操作对人员健康有损害。本发明的分子鉴别方法和鉴别试剂盒在准确、易操作之间找到结合点。本发明方法由于对dna纯度要求没有那么高，因此用试剂盒提取即可，方便、准确、安全。本发明对中国马鹿产品的真伪鉴定，达到了精准检测、稳定可靠、成本低、时间短的效果。序列表<110>中国农业科学院特产研究所<120>用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记及检测引物对、试剂盒和应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ccaaacccacgcttatcaca20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agccataaactccgtctgaa20<210>3<211>500<212>dna<213>reddeer<400>3aggagctctatcagccctattaataacttccggcttaattatatgatttcattttaactc60aatagtcctattaacacttggcctaacaacaaatatacttacaatataccaatgatggcg120agacattattcgagaaagcactttccaaggacaccatactccagccgtccaaaaaggcct180ccgctacggaataattctcttcattatttccgaagtcttattcttcaccggatttttctg240agcattttaccactcaagccttgccccaacacccgaattaggcggatgctgacccccaac300aggcattcacccgctaaaccccctagaagtcccactactcaatacctctgttttactagc360ctcaggagtttctatcacctgagcccatcatagccttatagaaggaaaccgcaaccatat420actacaagccttatttattactatcgcactaggcgtctattttacactactacaagcctc480agaatactatgaagcaccct500<210>4<211>500<212>dna<213>chinesewappit<400>4aggagctctatcagccctattaataacttccggcttaattatatgatttcatttcaactc60aatgaccctgctaacacttggcctaacaacaaacatacttacaatataccaatggtgacg120agacatcattcgagaaagtactttccaaggacaccatactccgactgtccaaaagggcct180ccgctacggaataatcctctttattatctccgaagtcctattcttcaccgggtttttctg240agcattttaccactcaagccttgccccaacacccgaattaggcgggtgctgacctccaac300aggcattcacccactaaaccccctagaagtcccactactcaatacctctgttttactagc360ctcaggagtctctattacctgagcccatcatagccttatagaaggaaaccgcaaccacat420actacaagccttatttattactatcgcactaggcgtttatttcacgctattacaagcctc480agaatactatgaagcaccct500当前第1页12