一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法与流程

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法及其水中次氯酸的试纸检测应用和非治疗目的的活细胞内次氯酸荧光成像检测应用。

背景技术：

次氯酸是一种重要的活性氧物质，具有强氧化性，在生产和生活中的用途十分广泛，常被用作漂白剂和消毒剂。生物体中的内源性次氯酸是由过氧化氢(h2o2)和氯离子(cl^-)在髓过氧化物酶(mpo)的催化条件下反应生成的。次氯酸由于具有极强的抗菌特性而在免疫系统中起到重要的作用，是生物防御过程中的一个重要环节。此外，次氯酸也影响着多种生理和病理过程，当人体内次氯酸的浓度发生异常时会产生氧化应激现象，损伤组织和蛋白质进而引发癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和肺部损伤等多种疾病。因此，设计高效的次氯酸检测方法具有十分重要的现实意义。

传统的次氯酸检测方法有很多，例如碘滴定法、化学发光法、比色法和核磁共振法等。但是这些方法由于操作复杂、成本高以及对检测的环境有要求等缺点而限制了其应用。相比之下，荧光探针法通过使用前后荧光信号的改变来实现对目标物质的检测，具有灵敏度高、选择性强、响应迅速、操作简单和可视化成像等优点而成为检测次氯酸的有力工具。在各种荧光基团中，香豆素荧光基团由于具有高荧光量子产率、良好的光稳定性、在可见光区域的吸收和发射以及大斯托克斯位移等良好的光学性质而成为首选的理想荧光基团之一。

目前已经报道了许多用于检测次氯酸的荧光探针，但是这些荧光探针具有不同的缺陷，例如合成步骤复杂、对次氯酸的选择性差、背景荧光过高、水溶性低和响应不够迅速等。其中，探针的背景荧光过高是导致检测的准确性降低的重要影响因素。因此，开发出高选择性且具有低背景荧光的次氯酸荧光探针十分必要和重要的。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题及目前需求，本发明人对此做了大量的文献调研和深入研究，提供了一种高选择性次氯酸荧光探针。

本发明的技术方案是，一种高选择性次氯酸荧光探针，其分子结构如下：

本发明还提供了一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法，步骤如下：

(1)惰性气氛保护下，按比例将7-二甲氨基香豆素-3-羧酸与氯化亚砜搅拌反应生成7-二甲氨基香豆素-3-酰氯；

(2)将步骤(1)中制备的7-二甲氨基香豆素-3-酰氯和2，4-二硝基苯肼按一定比例加入到无水二氯甲烷中，再加入无水三乙胺，使用磁力搅拌器在室温下搅拌；

(3)停止反应，旋除溶剂；将粗产物用二氯甲烷为淋洗剂进行硅胶柱柱层析纯化，旋除溶剂并真空干燥，得到黄色固体，为探针分子化合物cmfp-hocl；即为本发明所要制备的一种高选择性次氯酸荧光探针分子。

步骤(1)中，所述7-二甲氨基香豆素-3-羧酸、氯化亚砜的用量关系为1.2g：5ml。

步骤(1)中，所述搅拌反应的温度为室温，搅拌的时间为4h；所述惰性气氛为氮气。

步骤(2)中，所述7-二甲氨基香豆素-3-酰氯、2，4-二硝基苯肼、无水三乙胺和无水二氯甲烷的用量关系为1.2mmol：0.75mmol：2ml：10ml。

步骤(2)中，所述室温搅拌的时间为24h。

步骤(3)中，所述真空干燥的时间为3h。

将本发明制备的高选择性次氯酸荧光探针制成试纸，成功用于水中次氯酸的检测。

将本发明制备的高选择性次氯酸荧光探针应用于非治疗目的的活细胞中次氯酸的荧光成像。

本发明的有益效果：

(1)本发明所制备的高选择性次氯酸荧光探针cmfp-hocl中含有能够自由旋转的n-n单键，可导致荧光基团的荧光淬灭；同时其含有的2，4-二硝基苯肼也是强荧光淬灭基团。在二者的协同作用下荧光探针cmfp-hocl自身荧光极弱，有利于消除背景荧光干扰，得到更准确、更灵敏的检测效果。

(2)本发明所制备高选择性次氯酸荧光探针cmfp-hocl表现出对次氯酸良好的光谱响应性能。探针自身在473nm处具有极低的荧光发射强度；加入次氯酸后，在473nm有明显的荧光发射且随着次氯酸浓度的增加而逐渐增强。然后，探究了荧光探针cmfp-hocl的选择性。考察了探针对常见阴离子(f^-、br^-、cl^-、no2^-、so3^2-)、阳离子(mg²⁺)、活性氧(hocl、h2o2、·oh、¹o2)、活性氮(no·)和与生物相关的氨基酸(cys、hcy、gsh)的荧光响应情况。实验结果表明，只有加入次氯酸时探针才有响应；当加入55μm次氯酸时，荧光强度增强了20倍；而加入其他物质时，探针的荧光强度没有明显改变，表明探针对次氯酸具有良好的选择性。此外，研究了ph对探针响应次氯酸过程的影响。结果表明，探针能够在生理ph条件下对次氯酸进行检测。

(3)本发明所制备高选择性次氯酸荧光探针cmfp-hocl可以在制成试纸后对不同浓度的次氯酸进行方便与迅速的检测，具有良好的实际应用潜能。

(4)本发明所制备高选择性次氯酸荧光探针cmfp-hocl能够用于非治疗目的的活细胞内次氯酸的荧光成像检测。

附图说明

图1为荧光探针cmfp-hocl的合成路线。

图2(a)为荧光探针cmfp-hocl(10μm)响应不同浓度次氯酸(0～55μm)的荧光光谱；(b)为荧光探针cmfp-hocl(10μm)响应不同浓度次氯酸(0～55μm)时，在473nm处的荧光强度与次氯酸浓度的拟合曲线。

图3(a)为手持型365nm紫外灯照射下，荧光探针cmfp-hocl(10μm)、荧光探针cmfp-hocl(10μm)分别与55μm各反应物(2-15)作用后的荧光图；(b)为荧光探针cmfp-hocl(10μm)、荧光探针cmfp-hocl(10μm)分别与55μm的各反应物(2-15)作用后，探针在473nm处的荧光强度增强倍数(λex＝400nm)；其中反应物2-15分别代表mg²⁺、cys、hcy、gsh、f^-、br^-、cl^-、no2^-so3^2-、hocl、h2o2、·oh、¹o2和no·。

图4为加入20μmhocl前(■)后(●)，荧光探针cmfp-hocl(10μm)的荧光强度随ph的变化图(λex＝400nm，λem＝473nm)。

图5为使用荧光探针cmfp-hocl制备的试纸条分别检测各浓度hocl时，在日光灯下(上图)与365nm紫外灯下(下图)照射下的图像，其中(a)0μm；(b)10μm；(c)60μm；(d)120μm；(e)550μm；(f)1000μm。

图6为荧光探针cmfp-hocl在hela细胞中的成像图。a-c)细胞在37℃下与荧光探针cmfp-hocl(10μm)孵育30min的图像；d-f)细胞先在37℃下与荧光探针cmfp-hocl(10μm)孵育30min，再与hocl(15μm)孵育30min后的图像。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1：

荧光探针的合成；

合成路线如图1。

7-二甲氨基香豆素-3-酰氯的合成：在100ml圆底烧瓶中，加入7-二甲氨基香豆素-3-羧酸(1.2g，5.15mmol)，逐滴滴加5ml无水氯化亚砜。n2保护下室温搅拌4h。抽滤，用冷的无水乙醚对滤饼进行洗涤，得到黄色固体化合物7-二甲氨基香豆素-3-酰氯(0.75g，产率57.8％)。未经纯化，直接用于下一步反应。

荧光探针cmfp-hocl的合成：在100ml圆底烧瓶中，将化合物7-二甲氨基香豆素-3-酰氯(0.3g，1.2mmol)完全溶解于10ml无水ch2cl2中，向其中加入2，4-二硝基苯肼(0.15g，0.75mmol)，再逐滴滴加三乙胺(2ml，14.4mmol)，室温条件下搅拌24h。反应停止后旋除溶剂；将粗产物通过柱层析法纯化(以二氯甲烷为淋洗剂)，旋除溶剂并真空干燥3小时，得到黄色固体产物cmfp-hocl(0.29g，产率69.3％)，即为探针分子化合物cmfp-hocl。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):10.57(s,1h),10.26(s,1h),8.89(d,j＝2.4hz,1h),8.75(s,1h),8.31(dd,j＝9.6hz,2.8hz,1h),7.77(d,j＝8.8hz,1h),7.29(d,j＝9.6hz,1h),6.88(dd,j＝8.8hz,2.4hz,1h),6.69(d,j＝2.4hz,1h),3.13(s,1h)。

实施例2：

荧光探针和次氯酸溶液配制；

1.称取适量的荧光探针cmfp-hocl溶于色谱纯n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中配制成1.0mm的荧光探针分子储备液；

2.称取适量的次氯酸钠用蒸馏水定容，得到10mm次氯酸溶液并经过逐级稀释，得到10～0.1mm的次氯酸溶液；

3.称取适量的kh2po4、na2hpo4、nacl、kcl用蒸馏水定容，得到浓度为0.01m，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)；

4.使用乙腈与步骤3所得的pbs按照乙腈：pbs＝4：6的体积比混合，加入一定体积的步骤1中的荧光探针储备液以及步骤2中的次氯酸溶液，得到的混合待测溶液中荧光探针分子的浓度为10μm，次氯酸浓度为0～55μm。

实施例3：

荧光探针响应hocl的荧光光谱测定；

图2(a)为荧光探针cmfp-hocl(10μm)响应0～55μm次氯酸的荧光发射光谱。实验所用激发光谱为400nm，发射波长范围是420～600nm。激发和发射狭缝宽度均为10nm，所用的荧光测定仪器为thermofisherlumina荧光分光光度计。如图2所示，荧光探针cmfp-hocl自身只发出微弱的荧光。加入次氯酸后，溶液在473nm处发出明显的荧光发射，并且荧光强度随次氯酸浓度的增加而增强。这是由于次氯酸能够特异性地切断荧光探针分子中的酰肼键，释放出荧光基团7-二甲氨基香豆素-3-羧酸的荧光。图2(b)为荧光探针cmfp-hocl(10μm)响应不同浓度hocl(0～55μm)时在473nm处的荧光强度与hocl浓度变化的拟合曲线。从图上可以看出，探针能够线性响应0～55μm的次氯酸浓度的改变，检测下限为54.8nm，表明探针对次氯酸的检测具有高灵敏度。

实施例4：

荧光探针对hocl检测的选择性；

荧光探针分别与55μm各反应物(2-15)作用后的荧光图

图3(a)为手持型的365nm紫外灯照射下，荧光探针cmfp-hocl(10μm)的图片(标号1)，荧光探针cmfp-hocl(10μm)中分别加入55μm的mg²⁺、cys、hcy、gsh、f^-、br^-、cl^-、no2^-so3^2-、hocl、h2o2、·oh、¹o2和no·时的图片(标号2-15)。从图中可以看出，只有加入次氯酸的溶液(标号11)表现出蓝色的荧光发射；而加入其他物质(标号2-10，12-15)时，溶液不发出荧光。图3(b)为荧光探针对hocl检测的选择性。考察了荧光探针cmfp-hocl(10μm)与浓度均为55μm的常见阴离子(f^-、br^-、cl^-、no2^-、so3^2-)、阳离子(mg²⁺)、活性氧(hocl、h2o2、·oh、¹o2)、活性氮(no·)及与生物相关的氨基酸(cys、hcy、gsh)的荧光响应情况。如图所示，只有加入次氯酸的溶液才表现出20倍的明显荧光增强，而加入其他物质时溶液的荧光强度基本不变,表明荧光探针分子cmfp-hocl对次氯酸具有高度的选择性。

实施例5：

溶液的ph对荧光探针检测次氯酸的影响；

图4为在2.5～9.0的ph范围内，荧光探针cmfp-hocl(10μm)响应20μm次氯酸时473nm处的荧光发射强度。如图4所示，在2.5～9.0的ph范围内，荧光探针分子自身的荧光强度没有明显变化，表明探针自身在上述ph范围内十分稳定，结构不受ph的影响。当加入20μm的次氯酸后，在6.5～8.3的ph范围内，溶液的荧光强度均有明显增强；当ph为9.0时，溶液的荧光强度有所下降。上述结果表明该探针可以在生理条件下实现对次氯酸的检测。

实施例6：

使用由荧光探针cmfp-hocl制成的试纸对次氯酸的检测；

将滤纸裁剪后得到1×1.5cm²大小的纸条，在荧光探针溶液(10μm)中均匀浸泡20min后取出并晾干。将制得的试纸分别用浓度为0μm、10μm、60μm、120μm、550μm及1000μm次氯酸溶液(a-f)润湿，晾干后结果如图5所示。在次氯酸浓度升高的过程中，日光灯下观察到试纸的颜色先由金黄色变为橘色，再变为白色(上图)；而在365nm手持紫外灯下观察到上述试纸上的蓝色荧光随次氯酸浓度逐渐升高而逐渐增强(下图)。该试纸在检测次氯酸后表现出的明显且快速的颜色改变，表明该试纸能够迅速、方便地检测次氯酸，具有良好的实际应用潜力。

实施例7：

荧光探针分子cmfp-hocl对活细胞中hocl的荧光成像。

图6中a-c为使用荧光探针分子cmfp-hocl(10μm)培养hela细胞30min的图像。从图上可以看到绿色通道内没有信号发射。图d-f为hela细胞经过荧光探针cmfp-hocl(10μm)孵育后，进一步与hocl(15μm)培养30min后的图像。此时可以看到绿色通道中显著增强的信号。说明荧光探针cmfp-hocl能够成像活细胞中hocl。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。