本发明涉及生物工程技术领域，涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法；尤其涉及一种通过预水解和多酶复合的方法来提高酶解效率的从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法。
背景技术：
蛋壳膜的主要有粗蛋白、脂肪和多糖组成，其中粗蛋白约占膜总重的90％左右，主要以糖蛋白形式存在，另外还含有约3％的脂肪及2％的多糖类。蛋白质以角蛋白为主，还含有胶原蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白等；粘多糖主要有透明质酸和硫酸软骨素组成；这些生物活性成分对人体有着重要的生理作用，在食品、化妆品、药品、化工等行业有着广泛的应用。传统的蛋壳膜水解工艺以酸、碱水解法为主，具有简单、方便、容易实现等优点，但在生产过程中易产生对环境有毒、有害的物质，导致产品后处理难度大，且酶解过程存在反应剧烈、难以控制，使蛋白分子结构破坏严重，活性物质损失较大。酶水解工艺属于生物法，具有反应条件温和，过程易于控制，对环境友好，提纯成本低，酶解产物稳定等优点，但由于蛋壳膜水溶性差，与酶作用的活性位点少，导致酶解效率低，因此，通过对蛋壳膜的预处理来提高酶解效率显得尤为重要，例如，国内申请号为201911080199.2的一种蛋壳膜多肽的制备方法和国内申请号为201410521600.2的一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法分别采用了碱溶液和离子液体预处理的方法来提高提高酶解效率，但这些有害试剂的使用降低酶水解的工艺优势。本发明通过预水解和特定多酶复合的方法来提高酶解效率，从而避免使用离子液体、有机溶剂等有毒试剂，制备酶解物含有大量的多肽、透明质酸、硫酸软骨素等生物活性物质。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提出了一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，不仅能够大大的提高蛋壳膜的酶解效率，还具有反应条件温和，过程易于控制，对环境友好，提纯成本低，酶解产物稳定等优点。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，其所用的复合酶是质量比为1:4～5:1的胰蛋白酶和中性蛋白酶的复合酶。
作为本发明的一个实施方案，所述方法包括如下步骤：
s1、预水解：将蛋壳膜粉末与其干重10～50倍的水混合，然后把蛋壳膜水溶液加热到50～80℃，搅拌0.5～3h；
s2、水解：将步骤s1预水解处理后的蛋壳膜水溶液降低到35～60℃，并把ph调至6.5～9.5，然后加入所述复合酶，搅拌水解3～8h；得蛋壳膜水解混合液；
s3、生物活性物质的制备：将所述蛋壳膜水解混合液高温灭酶，待其温度降至室温后，离心取上清，除菌，得到澄清的蛋壳膜酶解液；所述蛋壳膜酶解液脱盐浓缩，喷雾干燥。
作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述蛋壳膜粉末的粒径为40～80目。
作为本发明的一个实施方案，所述蛋壳膜粉末是将蛋壳通过壳膜分离机实现壳膜分离，把得到的蛋壳膜清洗、灭菌，在不高于80℃条件下烘3～10h后，粉碎，过40～80目的筛网制备而得。
作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，通过加入氢氧化钠溶液将蛋壳膜水溶液的ph调至6.5～9.5。
作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述复合酶的用量是蛋壳膜粉末总质量的1％～10％。
作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述高温灭酶是80～100℃下进行的。
作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述离心是在5000～10000r/min的条件下离心10～30min。
作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述除菌为过200nm陶瓷膜除菌；所述脱盐浓缩是将澄清的蛋壳膜酶解液过150da的超滤膜脱盐浓缩。
作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述喷雾干燥的温度为150～250℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明反应条件温和，过程易于控制，对环境友好；
2)本发明反应提纯成本低，酶解产物稳定；
3)本发明通过预水解和特定多酶水解的方法大大提高酶解效率，其中，总氮回收率达到85.32％，透明质酸含量11.26mg/g，硫酸软骨素含量13.47mg/g，且分子量主要在3500da以下，占93.28％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，
(1)总氮含量检测方法采用凯氏定氮法。
(2)透明质酸的检测方法参照企标qb/t4576-2013《透明质酸钠》。
(3)硫酸软骨素的检测方法参照gb/t20365-2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定液相色谱法》。
实施例1
本实施例涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，包括如下步骤：
(1)蛋壳膜制备：将蛋壳通过壳膜分离机实现壳膜分离，把得到的蛋壳膜清洗、灭菌，在80℃条件下烘10h后，再粉碎，最后，过40目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预水解：将蛋壳膜粉末与其干重10倍的水混合，然后把水溶液加热到60℃，并在该温度下搅拌0.5h；
(3)水解：将步骤(2)中的水溶液降低到35℃，并把ph调至6.5，然后加入1％的复合酶(复合酶由质量比为1:4胰蛋白酶和中性蛋白酶组成)，搅拌水解3h；
(4)生物活性物质的制备：将步骤(3)中的混合液高温灭酶，待其温度降至室温后，通过离心机在5000r/min的条件下，离心10min，然后取上层清液，过200nm陶瓷膜除菌，得到澄清的蛋壳膜酶解液，再将上述澄清液过150da的超滤膜脱盐浓缩，最后将浓缩液喷雾干燥获得最终产品。
实施例2
本实施例涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，包括如下步骤：
(1)蛋壳膜制备：将蛋壳通过壳膜分离机实现壳膜分离，把得到的蛋壳膜清洗、灭菌，在80℃条件下烘10h后，再粉碎，最后，过80目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预水解：将蛋壳膜粉末与其干重50倍的水混合，然后把水溶液加热到80℃，并在该温度下搅拌2h；
(3)水解：将步骤(2)中的水溶液降低到60℃，并把ph调至9.5，然后加入10％的复合酶(复合酶由质量比为5:1胰蛋白酶和中性蛋白酶组成)，搅拌水解8h；
(4)生物活性物质的制备：将步骤(3)中的混合液高温灭酶，待其温度降至室温后，通过离心机在10000r/min的条件下，离心30min，然后取上层清液，过200nm陶瓷膜除菌，得到澄清的蛋壳膜酶解液，再将上述澄清液过150da的超滤膜脱盐浓缩，最后将浓缩液喷雾干燥获得最终产品。
实施例3
本实施例涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，包括如下步骤：
(1)蛋壳膜制备：将蛋壳通过壳膜分离机实现壳膜分离，把得到的蛋壳膜清洗、灭菌，在60℃条件下烘8h后，再粉碎，最后，过60目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预水解：将蛋壳膜粉末与其干重25倍的水混合，然后把水溶液加热到65℃，并在该温度下搅拌1h；
(3)水解：将步骤(2)中的水溶液降低到55℃，并把ph调至7.5，然后加入8％的复合酶(复合酶由质量比为3:2胰蛋白酶和中性蛋白酶组成)，搅拌水解6.5h；
(4)生物活性物质的制备：将步骤(3)中的混合液高温灭酶，待其温度降至室温后，通过离心机在8000r/min的条件下，离心20min，然后取上层清液，过200nm陶瓷膜除菌，得到澄清的蛋壳膜酶解液，再将上述澄清液过150da的超滤膜脱盐浓缩，最后将浓缩液喷雾干燥获得最终产品。
实施例4
本实施例涉及一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法，包括如下步骤：
(1)蛋壳膜制备：将蛋壳通过壳膜分离机实现壳膜分离，把得到的蛋壳膜清洗、灭菌，在70℃条件下烘6.5h后，再粉碎，最后，过80目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预水解：将蛋壳膜粉末与其干重35倍的水混合，然后把水溶液加热到75℃，并在该温度下搅拌1.5h；
(3)水解：将步骤(2)中的水溶液降低到60℃，并把ph调至8.5，然后加入6％的复合酶(复合酶由质量比为2:3胰蛋白酶和中性蛋白酶组成)，搅拌水解4.5h；
(4)生物活性物质的制备：将步骤(3)中的混合液高温灭酶，待其温度降至室温后，通过离心机在7000r/min的条件下，离心25min，然后取上层清液，过200nm陶瓷膜除菌，得到澄清的蛋壳膜酶解液，再将上述澄清液过150da的超滤膜脱盐浓缩，最后将浓缩液喷雾干燥获得最终产品。
对比例1
本对比例1与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤(2)中，本对比例无步骤2预水解。
对比例2
本对比例与实施例3的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤(3)中，本对比例添加的酶为8％的中性蛋白酶。
对比例3
本对比例与实施例4的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤(3)中，本对比例添加的酶为6％的胰蛋白酶。
对比例4
本对比例与实施例3的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤(3)中，本对比例中的组合酶为角蛋白酶和碱性蛋白酶。
对比例5
本对比例与实施例3的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤(3)中，本对比例中的组合酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。
表1为本发明实施实施例1、2、3、4和对比例1、2、3、4、5制备工艺的总氮回收率和制备得到的活性物中透明质酸、硫酸软骨素的含量。
表1
(1)对比表1中实施例1和对比例1的总氮回收率、透明质酸含量和硫酸软骨素含量可知，通过对蛋壳膜进行预水解可以大大的提高总氮回收率、透明质酸含量和硫酸软骨素含量，因为预水解可以使蛋白分子的立体致密结构变得松散，暴露蛋白内部作用位点，蛋膜蛋白经过酶解产生了更多亲水基团，即可提高溶解性能。另外，加热可以杀灭溶液中的细菌，防止在酶解过程中细菌繁殖而降低蛋白质的营养学价值。
(2)对比实施例3和对比例2，以及实施例4和对比例3的总氮回收率、透明质酸含量和硫酸软骨素含量可以发现，单独使用任何一种酶对蛋壳膜进行水解都不能达到较好的水解效果或水解效果极差，由此能够说明，复合蛋白酶中的胰蛋白酶和中性蛋白酶相互协同作用使得蛋壳膜的水解效果更好，使总氮回收率、透明质酸含量和硫酸软骨素含量大幅度提高。
(3)对比实施例3和对比例4、5的总氮回收率、透明质酸含量和硫酸软骨素含量可以发现，由胰蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合蛋白酶相较于角蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合蛋白酶效果更好，说明胰蛋白酶和中性蛋白酶组成复合蛋白酶可以很好相互协同使蛋壳膜的水解效果更好、更彻底。
表2本发明实施实施例1、2、3、4和对比例1、2、3、4、5制备工艺的得到的生物活性物的分子量分布情况(超滤法)。
表2
(1)对比表2中实施例1和对比例1的生物活性物的分子量分布可知，实施例1的分子量小于3500da的物质占89.16％高于对比例1的85.35％，这说明采用预水解技术可以有效地降低制备的生物活性物质的分子量。
(2)对比表2中实施例3和对比例2，以及实施例4和对比例3的生物活性物的分子量分布可知，实施例3和实施例4中的分子量小于3500da的分别占93.28％和92.68％，而比例2和对比例3分别为85.24％和81.72％，这说明复合蛋白酶中的胰蛋白酶和中性蛋白酶相互协同可以有效地降低生物活性物质的分子量。
(3)对比表2中实施例3和对比例4，以及对比例5的生物活性物的分子量分布可知，实施例3中的分子量组要集中在3500da以下，占总量的93.28％，而对比例4和5中分子量低于3500da以下分别为总量的73.66％和72.64％，这说明复合蛋白酶中的胰蛋白酶与中性蛋白酶相较于角蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶和木瓜蛋白酶与中线蛋白酶组成复合蛋白酶，更能有效地地降低生物活性物质的分子量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。