帕金森病的诊断标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p，及其编码基因、生物学前体在制备帕金森诊疗试剂中的应用。
背景技术：
：帕金森病(parkinson′sdisease，pd)是一种发病率仅次于阿尔兹海默氏症的神经系统退行性疾病，以老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，目前无法治愈。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，da)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体da含量显著性减少而致病，在临床上的具体表现为运动性症状，如静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍以及非运动性症状，如便秘、睡眠障碍、精神行为异常等。由于我国人口老龄化的加速来临，截至2014年底，我国60岁以上老年人口已经达到2.12亿，占总人口的15.5％。其中，老年神经退行性疾病，包括阿尔兹海默氏病(老年痴呆)和帕金森病，将成为困扰中国医疗系统的重大难题。据统计，我国60岁及以上人群中，帕金森病的比例为1％，而65岁以上的人群中帕金森病的比例上升到1.7％(tianetal.，2011)。据此计算，我国仅帕金森病的患者就达到212万人，未来将达到400万人，是继肿瘤、心脑血管病之后中老年的“第三杀手”。目前，帕金森患者正趋于年轻化，青少年型帕金森病患者占总人数的10％。老年神经退行性疾病源于神经细胞的衰老退化，一般认为，帕金森病是由于病人中脑多巴胺能神经元显著丢失引起的。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴，但药物治疗存在副作用多和长期应用后药效衰减的缺点。长期用药后，脑内神经元对药物的敏感性变差，可能会出现″异动症″或是″药效波动″。除了药物的治疗之外，帕金森临床手术治疗方式主要有两种：立体定向靶点射频损毁术(细胞刀)和深部脑核团刺激术(dbs)(malek，2019)，但均不能达到很好的疗效。当前市场上尚无任何有效的药物可以逆转神经细胞的退化过程。因此，帕金森的治疗存在药物缺乏，治疗手段单一的问题，患者的预后较差，病情仍然会继续发展，严重影响其生活质量。目前帕金森病的发病机制还不清楚，相关的影响因子包括遗传因素、线粒体功能缺陷、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡、环境因素等(simonetal.，2020)。研究表明，约5-10％的患者为家族型pd患者，具有明显的遗传特性，剩下的大多数为散发性pd患者(dengetal.，2018)。当前的共识认为帕金森是环境因素和多个疾病相关基因共同作用的结果，而对帕金森致病基因及其调控机理的研究是帕金森发病机制研究的一大热点。迄今为止，研究发现与遗传性pd相关的基因包括snca，lrrk2，htra2，dj-1，pink-1，pla2g6等(vandervlagetal.，2020)。然而，针对这些帕金森病相关基因的研究还比较粗浅，无法全面揭示其致病机理，从而开发相应的治疗方案。因此，提前发现疾病，同时有针对性的按照患者自身情况制定个性化治疗方案，是帕金森临床上迫切需要解决的问题。提早发现筛查帕金森病可以最大限度提高患者的生存质量，减轻患者的痛苦，减少家庭和社会的经济负担。然而，提前诊断需要灵敏且准确的分子标记，以实现帕金森病的早期筛查和干预。另一方面，帕金森病标志物电可以作为潜在的药物研究位点，开发针对相关分子标记物的临床治疗药物。为筛选可能的帕金森病分子标记物，发明人通过对15例帕金森病患者及9例健康志愿者对照外周血的血浆样本进行小rna的高通量测序，测得的差异表达小rna再结合生物信息学方法进行比对筛选，挑选出5个帕金森病相关小rna，包括mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和mir-342-3p。进一步地，发明人通过实时定量pcr验证了上述小rna在大鼠帕金森疾病模型中的表达差异性，继而在帕金森病人和健康志愿者的血浆中逐一检测了上述小rna的表达量，从不同角度证实了其与帕金森病具有良好的相关性。因此，上述小rna不仅可用于制备帕金森病诊断制剂，而且是潜在的药物开发靶点，具有重要的临床应用价值。1.tianyy，tangcj，wuj，zhoujs.parkinson′sdiseaseinchina.neurolsci.2011feb；32(1)：23-30.2.malekn.deepbrainstimulationinparkinson′sdisease.neurolindia.2019jul-aug；67(4)：968-978.3.simondk，tannercm，brundinp.parkinsondiseaseepidemiology，pathology，genetics，andpathophysiology.clingeriatrmed.2020feb；36(1)：1-12.4.dengh，wangp，jankovicj.thegeneticsofparkinsondisease.ageingresrev.2018mar；42：72-85.5.vandervlagm，havekesr，heckmanpra.thecontributionofparkin，pink1anddj-1genestoselectiveneuronaldegenerationinparkinson′sdisease.eurjneurosci.2020jan28.技术实现要素：本发明的目的在于筛选和开发一批具有潜在应用价值的分子标记物和治疗靶点，以供帕金森病临床诊断和制备制剂中的应用。为实现上述目的，本发明首先采集帕金森病人和健康志愿者的外周血，分离血浆。利用分子生物学的方法提取血浆中的小rna，并通过高通量rna测序结合生物信息学方法筛选到候选基因群体。随后，进一步通过生物信息学的方法筛选出一组调控帕金森病相关基因表达的小rna，并通过实时定量pcr在大鼠帕金森模型中验证了这一组小rna在大鼠血浆中的差异性表达，最终确定了mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和mir-342-3p等5个帕金森病相关的小rna。最后，发明人对上述5个小rna在帕金森病人和健康志愿者血浆中的表达量逐一进行检测，并验证了其与帕金森病具有良好的相关性，可作为帕金森病临床诊断的分子标记，也可作为治疗靶点用于治疗帕金森制剂的制备，具有重要的临床应用价值。本发明解决上述技术问题的示例性技术方案如下：1.收集帕金森病人和健康志愿者的外周血6ml，通过离心分离血浆。2.利用qiagenmirneasyserum/plasmakit(catno./id：217184)提取血浆中的小rna，测定rna的质量和浓度，确保浓度在10ng/ul以上。3.以总rna为实验材料，首先与3’端接头相连；随后再与5’接头相连；pcr扩增，富集两端都有接头的小rna；随后进行聚丙稀酰胺凝胶电泳，把小rna文库与其它rna的文库根据长度分离开，切割含有小rna文库的凝胶条带，最后回收小rna文库。4.库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illuminahiseqtm3000测序，并分析数据，获得差异表达的小rna。5.根据测得的差异表达小rna群体，用microrna.org(www.microrna.org)，mirbase(www.mirbase.org)等生物信息学工具筛选出有可能调控帕金森病相关基因的一组小rna。用于分析的帕金森病基因包括snca，lrrk2，htra2，uchl1，dj-1，pink-1，gak，pla2g6，atp13a2，gigyf2等。6.筛选出5个帕金森病相关基因，包括mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p等。7.在大鼠帕金森模型中通过定量pcr的方法验证上述5个小rna的表达量，以及与帕金森大鼠的病程相关性。8.通过定量pcr的方法在帕金森病患者和健康志愿者中逐一测定上述5个小rna的表达量，确定其与帕金森病的关联性。本发明的内容包括提供mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p及其编码基因，生物学前体在帕金森病临床诊断中的应用。所述的帕金森的诊断包括例如用荧光定量pcr方法或基因芯片方法检测外周血中mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p及其编码基因，生物学前体的表达量，以诊断帕金森病。荧光定量pcr法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记，以实现实时在线跟踪pcr反应中产物生成的过程，并通过相应的软件对产物的荧光值进行分析，从而推导出待测样品中靶标的初始浓度。通过荧光定量pcr的技术，可以对传统pcr中产物的生成过程实时监测，避免了pcr反应到达平台期后造成的结果准确性下降，同时还真正实现了绝对定量，可以测定样品中的模板拷贝数。目前，荧光定量pcr检测系统已经非常成熟，相对于传统pcr反应，其具有反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰等优点。基因芯片(genechip)又被称为dna微阵列(dnamicroarray)，一般分为三种主要类型：1)核酸探针或cdna片段通过物理作用固定在如尼龙膜和硝酸纤维膜等聚合物的表面上，然后通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射自显影技术进行检测。2)在玻璃材料上用点样法固定核酸探针或cdna片段阵列，然后与荧光标记的靶基因杂交，通过荧光信号强度进行检测。3)在玻璃材料等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，然后与荧光标记的靶基因杂交，进行荧光信号的检测。近年来，基因芯片作为一种大规模、高通量的检测技术，已经广泛应用于临床疾病的诊断。综合而言，基因芯片作为一种新兴的检测技术，具有以下几个方面的优点：1.高度灵敏性和检测的准确性；2.方法快速简便；3.在一次检测中可同时检测多种疾病。所述的利用荧光定量pcr方法检测帕金森患者血浆中的mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和/或mir-342-3p等小rna的产品含有一对特异性扩增上述基因的引物；所述的基因芯片包括与上述小rna，及其编码基因，生物学前体等核酸序列杂交的探针。本发明的目的在于提供一种可用于临床诊断帕金森病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和/或mir-342-3p等小rna及其生物学前体的上游引物和下游，其中所述上游引物为通用引物(由mir-xtmmirnafirststrandsynthesiskit，takara，货号638313提供)，下游引物序列分别如seqidno：6-10所示。表1.用于定量pcr扩增5个小rna的下游引物。hsa-mir-23b-3patcacattgccagggattaccac(seqidno：6)hsa-mir-30b-5ptgtaaacatcctacactcagct(seqidno：7)hsa-mir-195-3pccaatattggctgtgctgctcc(seqidno：8)hsa-mir-195-5ptagcagcacagaaatattggc(seqidno：9)hsa-mir-342-3ptctcacacagaaatcgcacccgt(seqidno：10)本发明所述的试剂盒任选地还包含sybrgreen荧光染料。所述染料适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，具有灵敏度高，定量快速准确、性能稳定等特点，具有良好的市场前景。本发明所述试剂盒任选地还包含用于定量扩增mir-22-3p和mir-185-5p(用作阳性对照)的内参上游引物和内参下游引物，其中所述内参上游引物为通用引物，所述内参下游引物序列如seqidno：11-12所示。见表2。表2.用于扩增mir-22-3p和mir-185-5p的内参下游引物mir-22-3paagctgccagttgaagaactgt(seqidno：11)mir-185-5ptggagagaaaggcagttcctga(seqidno：12)关于用于扩增mrna的上游引物，即通用引物，本领域的普通技术人员可以理解目前商用的用于扩增mrna的试剂盒均会提供用于扩增mrna的通用引物。所述的试剂盒任选地还包含rna抽提试剂，利用试剂盒提供的优选抽提试剂进行血浆样本rna提取。本发明目的还包括提供一种检测帕金森病的基因芯片，所述的基因芯片中包括与mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和/或mir-342-3p等小rna及其编码基因，生物学前体等的核酸序列杂交的探针。本发明的目的在于提供一种潜在治疗帕金森病的制剂，所述帕金森临床治疗制剂可以改变帕金森病患者体内mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和/或mir-342-3p等小rna的表达。进一步地，所述的治疗帕金森病制剂中含有可以改变mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p和/或mir-342-3p等小rna基因表达的载体。本领域人员熟知改变(包括抑制或增加)基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：1.通过在基因组水平上调控基因表达：包括但不限于增加基因的拷贝数、转染含导致基因过表达的载体，以增强基因表达或在基因组中导入基因或启动子的突变等以抑制基因表达。2.通过在转录水平上调控基因表达：包括但不限于激活或抑制基因或基因的表达、激活或抑制调控基因表达的启动子、激活或抑制负调控基因表达的转录因子。3.采用rna干扰技术对抑制基因表达的抑制子进行干扰，以增强基因表达或利用rna干扰技术抑制目标基因的表达。rna干扰(rnai)是指外源性的人工合成双链rna在生物体内通过结合同源靶基因的mrna，特异性地导致其降解。rna干扰一般通过小干扰rna(smallinterferingrna；sirna)导致转录后基因的表达沉默，特异性地阻断生物体内某种特定基因的表达，促使mrna降解，使得细胞表现出特定基因缺失表型。sirna是一种人工设计的小rna分子，设计完成后可以采用直接合成法或者构建sirna表达载体来制备sirna。制备好的sirna可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、deae-葡聚糖法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。4.通过转录后水平调控基因表达：包括但不限于抑制促进基因转录形成的mrna降解的小rna(microrna)转录表达或导入促进基因表达的microrna。具体地，本发明涉及以下几个方面：1.mirna分子或其前体，所述mirna序列分别如seqidno：1，2，3，4或5所示。2.项目1的mirna分子或其前体在制备诊断帕金森病的药物中的应用。3.项目2所述的应用，其中相比于健康受试者而言，seqidno：1，2或5在受试者外周血中的表达量下降指示所述受试者为帕金森患者，seqidno：3或4在受试者外周血中的表达量升高指示所述受试者为帕金森患者。4.提高seqidno：1，2或5在受试者外周血中含量的试剂在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用或在制备降低lrrk2和/或gak基因的表达量或升高atp13a2，snca和/或uchl1基因的表达量的药物中的应用，优选地，其中所述提高seqidno：1，2和/或5在受试者外周血中含量的试剂选自用于增加seqidno：1，2和/或5在受试者外周血中拷贝数的含有seqidno：1，2和/或5的过表达载体，调控seqidno：1，2和/或5基因表达的启动子，抑制负调控seqidno：1，2和/或5基因表达的转录因子的试剂，用于干扰抑制seqidno：1，2和/或5基因表达的抑制子的rnai；抑制促进seqidno：1，2和/或5mrna降解的microrna转录表达的试剂，或促进seqidno：1，2和/或5表达的microrna。5.降低seqidno：3或4在外周血中含量的试剂在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用或在制备升高lrrk2，uchl1和/或snca基因的表达量或降低gak，pink1和/或pla2g6基因的表达量的药物中的应用，优选地，所述降低seqidno：3或4在外周血中含量的试剂选自负调控seqidno：3和/或4基因表达的转录因子，促进seqidno：3和/或4mrna降解的microrna。6.试剂盒，其包含用于扩增seqidno：1、2、3、4、5或其前体的上游引物和下游引物，其中所述用于扩增seqidno：1、2、3、4、5或其前体的上游引物为用于扩增mrna通用引物，所述用于扩增seqidno：1、2、3、4、5或其前体的下游引物分别为seqidno：6、7、8、9或10所示的序列。7.项目6所述的试剂盒，其还包含用于扩增用作阳性对照的mir-22-3p和mir-185-5p的内参上游引物和内参下游引物，其中所述用于扩增用作阳性对照的mir-22-3p和mir-185-5p的内参上游引物为扩增mrna的通用引物，所述用于扩增用作阳性对照的mir-22-3p和mir-185-5p的内参下游引物的序列分别如seqidno：11或12所示。8.试剂盒或基因芯片，所述试剂盒包含一种或多种用于与seqidno：1-5或其前体分别杂交的探针，或所述基因芯片上固定一种或多种用于与seqidno：1-5或其前体分别杂交的探针。附图说明图1.在帕金森病人外周血及健康志愿者外周血中提取rna，并进行rna高通量测序的样本制备流程图。图2.在帕金森病人外周血及健康志愿者外周血中提取总rna用agilent2100生物分析仪进行样本质量分析的图片。图3.利用rna高通量测序后对获得数据进行分析的流程图。图4.利用rna高通量测序后对样本间差异表达的小rna进行火山图(volcanoplot)差异表达分析。图5.利用rna高通量测序后对样本间差异表达的小rna进行生物信息学分析的结果，通过对可能调控pd相关基因的小rna分析后，从高通量测序中筛选出9个可能与pd病程相关的小rna。图6.利用实时定量pcr技术对帕金森病人和健康志愿者(对照)中小rna的表达量进行逐一鉴定，进一步确认筛选出的小rna在不同个体中的表达差异性。图7.利用实时定量pcr技术对大鼠帕金森模型中的帕金森疾病组和假手术(mock)组大鼠血浆中的小rna表达量进行逐一鉴定，确认筛选出的小rna在帕金森病动物模型中的表达差异性。图8.microrna在pd病人外周血中表达量相对范围。利用实时定量pcr技术对帕金森病人和健康志愿者中小rna的表达量进行逐一鉴定，然后取志愿者的表达量平均数作为标准，计算帕金森病人外周血中小rna的相对表达倍数，并选择最高和最低的数值确定相对表达范围。图9.microrna对帕金森病相关基因的靶向调控作用分析。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。病人及健康志愿者均征得试验对象知情同意。实施例1在帕金森病人及健康志愿者外周血中提取rna，并进行rna高通量测序的样本制备用于高通量测序rna样品制备的具体实验流程如图1所示。通过静脉采血，分别收集15例帕金森病患者及9例健康志愿者外周血样本约6ml，利用qiagenmirneasyserum/plasmakit(catno./id：217184)试剂盒按照要求进行总的小rna提取。提取样品总rna后，对抽提的总rna样品的质量检测主要包括3种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染(2)nanodrop检测rna的纯度(od260/280比值)(3)1abchip精确检测rna的完整性(结果如图2所示)利用multiplexsmallrnalibraryprepsetfor(neb，usa)试剂盒提供的试剂及引物，按照说明书要求操作。以总rna为实验材料，首先与3’端接头相连；随后再与5’接头相连；pcr扩增，富集两端都有接头的小rna；随后进行聚丙稀酰胺凝胶电泳，把小rna文库与其它rna的文库根据长度分离开，切割含有小rna文库的凝胶条带，最后回收小rna文库。待文库构建完成后，先使用qubit3.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用qsep100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nm)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illuminahiseq测序。实施例2rna高通量测序后获得数据的分析mirna表达谱具有组织特异性和时空特异性，mirna的异常表达与多种疾病的发生与发展密切相关。因此研究不同组织或细胞环境中的mirna的差异表达情况有助于从分子水平揭示发育与疾病等生物学过程内在机制。illuminahiseqtm3000测序所得50nt原始序列(rawreads)集，通过去掉reads两端的接头、去掉低质量reads、去污染等过程完成数据初步过滤，得到干净序列(cleanreads)，并利用fastqc对cleanreads进行质控分析。利用mirdeep2软件对cleanreads进行去冗余，得到去冗余后的collaspedreads。再利用序列相似性利用cmscan软件将collaspedreads与rfam数据库进行比对，鉴定小rna种类。同时，mirdeep2可以获得样本中已知mirna表达量信息和预测未知mirna。随后对已知mirna进行差异表达分析，并预测差异mirna的靶基因信息。差异表达分析使用依赖于bayesian方法的gfold软件3。gfold通过bayesian方法计算出基因表达(rpm)差异倍数的后验分布(z)，我们规定一个概率c＝0.05，通过下面的公式得到gfold(0.05)，若gfold大于或小于0，则判断为差异表达基因；若gfold＝0，则不能判断为差异表达基因。最后，根据预测结果对靶基因进行功能注释以及富集分析。生物信息数据分析的流程如图3所示。分析过程中具体使用的数据库如下：mirna数据库来自mirbaseversion21(www.mirbase.org)；trna、rrna、snrna、snorna数据库来自rfamll.0(rfam.xfam.org)；将所有测序得到的srna与各类rna的比对、注释情况进行总结。将帕金森病患者和志愿者的差异表达mirna进行分析后，可以做出差异表达火山图(图4)。差异表达火山图中的每一个点表示一个基因，横坐标表示某一个基因在两样品中表达量差异倍数的对数值；纵坐标表示基因表达量变化的统计学显著性的负对数值。横坐标绝对值越大，说明表达量在两样品间的表达量倍数差异越大；纵坐标值越大，表明差异表达越显著，筛选得到的差异表达基因越可靠。图中蓝色的点(实心箭头所示)代表下调差异表达基因，红色的点(空心箭头所示)代表上调差异表达基因，灰色的点代表非差异表达基因。通过分析，最终分别选取20个上调或者下调表达量程度最高的mirna(共40个)进行后续的研究分析。实施例3差异化表达的mirna靶基因预测分析mirna是一类在动植物体内发挥重要调控作用的小分子rna，主要通过与靶标mrna的3′utr区域碱基序列完全或不完全的互补配对发挥功能，从而对靶标mrna的翻译进行转录后抑制。mirna的5′端被称为种子序列(seedregion)的第2-8号核苷酸在识别靶标基因的过程中发挥了最为重要的作用，也通常被用于对mirna的靶标基因进行预测。结合以上因素，目前的预测算法通过预测主要考虑以下几点：1)mirna种子序列完美互补配对的程度；2)mre(mirnarecognitionelements)序列保守性；3)mirna-mrna复合体的结合自由能(bindingfreeenergy，δgduplex)；4)靶标分子的序列特征。采用starbase的tutorialapi进行已知mirna靶基因的查询，api可以返回7种mirna靶基因预测软件的结果，包括pita、rna22、mirmap、miranda、targetscan等款软件，最终仅展示预测结果较好的前50个靶基因进行后续研究分析。实施例4差异化表达的mirna对帕金森病程相关基因的预测分析首先，根据已知文献检索，并汇总与帕金森病程相关的基因，这些相关基因包括snca，lrrk2，htra2，uchl1，dj-1，pink-1，gak，pla2g6，atp13a2，gigyf2等。将这些相关基因用microrna.org(www.microrna.org)，mirbase(www.mirbase.org)等生物信息学在线工具中的targetmrna子选项进行分析。首先输入基因的名称，并选择种属(species)为人类，即可得出可能调控该基因的mirna列表。从列表中所有的mirna与实施例3中得到的20个上调或者下调表达量程度最高的mirna(共40个)进行比较，从而得到具备调控帕金森病相关基因的能力，同时在帕金森病患者血清中差异表达的一组mirna(亦即两者的交集)。最终，总共18个mirna通过上述分析被筛选出来供进一步研究，参见图5。实施例5帕金森患者及健康志愿者外周血mirna表达逐一定量分析为进一步验证实施例4中筛选出来的mirna是否在帕金森患者和健康志愿者的外周血中存在表达差异，我们利用荧光定量pcr方法对每一位病人(志愿者)的外周血样品进行mirna表达量进行检测，并通过studentt检验方法确认其差异性。在实施例4中筛选出的总共18个mirna中，首先针对其编码序列设计pcr引物，并在外周血样品中测试引物的稳定性，检验引物扩增效率。选定扩增引物后，通过荧光定量pcr法对所有外周血样品进行检测，并对结果进行统计分析。pcr试验结果表明此前筛选的18个mirna有部分在两组人群中未显示出统计学上的差异表达。同时，由于样品质量和技术因素的影响，部分mirna未获得高质量的pcr数据。因此，我们剔除了未表现出统计学差异的mirna，以及结果质量较低的mirna，最终选定了5个在帕金森患者及健康志愿者外周血具有差异表达的microrna分子，分别为mir-23b-3p(seqidno：1)，mir-30b-5p(seqidno：2)，mir-195-5p(seqidno：3)，mir-195-3p(seqidno：4)，mir-342-3p(seqidno：5)。hsa-mir-23b-3paucacauugccagggauuaccac(seqidno：1)hsa-mir-30b-5puguaaacauccuacacucagcu(seqidno：2)hsa-mir-195-3pccaauauuggcugugcugcucc(seqidno：3)hsa-mir-195-5puagcagcacagaaauauuggc(seqidno：4)hsa-mir-342-3pucucacacagaaaucgcacccgu(seqidno：5)5.1材料和方法5.1.1.材料收集的15例帕金森病患者及9例健康志愿者外周血样品。5.1.2.方法5.1.2.1帕金森患者及健康志愿者外周血总rna的提取采用qiagenmirneasyserum/plasmakit(catno./id：217184)进行样本rna提取，按照产品说明书进行操作。rna质量判定标准：rna样本的od260/od280值为1.7-2.2之间。5.1.2.2逆转录合成cdna采用标准mirna逆转录方法，简述如下：使用mirna专用逆转录试剂盒(mir-xtmmirnafirststrandsynthesiskit，takara，cat.no.638313)，取100-200ng总rna进行反转录合成cdna。反转录的引物采用试剂盒提供的针对小rna专用引物。5.1.2.3引物设计采用在线引物设计软件，引物设计后由北京擎科生物科技有限公司合成。具体引物序列见表1。5.1.3荧光定量pcr用powergreenpcrmastermix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，具体实验操作按照产品说明书进行。扩增程序为：95°10min，(95℃15sec，60℃60sec)×45个循环。取待测样品cdna2-5μl作模板，分别用目的mirna特异性引物和试剂盒提供的通用引物进行pcr扩增。准备好的样品用quantageneq325荧光定量pcr仪，采用2-δδct法进行数据的相对定量分析。5.2实验结果针对5个microrna分子(mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p)进行实时定量pcr反应。试验扩增曲线整体平滑，平台期曲线平直且无上扬，指数期曲线斜率较大，表明引物的扩增效率较高，且产物稳定。根据2-δδct法对样品逐一定量计算，并对所有帕金森病人和志愿者的pcr结果进行统计分析发现，以上5个microrna分子均表现出表达量的差异。具体而言，mir-23b-3p和mir-30b-5p的表达量在帕金森病人的外周血中显著下降，mir-195-5p和mir-195-3p的表达量在帕金森病人的外周血中显著上升，而mir-342-3p的表达量在帕金森病人中显示出下降趋势(图6)，验证了rna高通量测序中的结果。实施例6帕金森病大鼠模型中疾病组和假手术(mock)组外周血中mirna表达量分析为进一步证实实施例5中筛选得到的5个microrna分子是否和帕金森疾病相关，我们在大鼠的帕金森病模型(大鼠的帕金森疾病模型的建立参考文献为cerrietal.，2015；olssonetal.，1995；kimetal.，2018)中检测了这些microrna分子在疾病组和假手术组大鼠中的表达量。首先选取8周龄体重在200g-250g之间的雌性wistar大鼠(武汉枢密脑科学技术有限公司)80只。通过立体定位仪的引导，在大鼠纹状体注射24μg的6-ohda神经毒素(sigma-aldrich，h4381-100mg)。在注射后2w，3w，4w，分别取2只大鼠进行灌流切片及免疫组化分析，利用酪氨酸羟化酶(th)抗体(abcam，货号ab112)进行免疫荧光染色，随后观察th阳性细胞的数量和黑质中多巴胺(dopamine，da)能神经元的损毁程度，由图7a免疫组化结果可见6-ohda成功地对注射区域的多巴胺能神经元造成损毁。待注射3周后，进行行为学检测，并选取得分较高的大鼠作为造模成功的帕金森疾病鼠用于后续实验。行为学检测结果见图7b，cylindertest和steppingtest的结果均显示出造模大鼠的运动能力在多巴胺神经元损毁的对侧肢体上出现显著下降(6-ohda注射为右侧半脑，对应调控左侧肢体的运动能力)。同时，通过同样的方法将不含6-ohda神经毒素的溶液注射到大鼠纹状体中，待注射三周后进行行为学测试，并选取行为学表现正常的大鼠作为假手术组用于后续试验的对照组。帕金森病小鼠模型行为学检测参见以下参考文献：1.cerrietal.，2015；olssonetal.，1995；kimetal.，20182.cerris，grecor，levandisg，ghezzic，mangioneas，fuzzati-armenteromt，bonizzia，avanzinima，maccarior，blandinif.intracarotidinfusionofmesenchymalstemcellsinananimalmodelofparkinson′sdisease，focusingoncelldistributionandneuroprotectiveandbehavioraleffects.stemcellstranslmed.2015sep；4(9)：1073-85.3.olssonm，nikkhahg，bentlagec，a.forelimbakinesiaintheratparkinsonmodel：differentialeffectsofdopamineagonistsandnigraltransplantsasassessedbyanewsteppingtest.jneurosci.1995may；15(5pt2)：3863-75.4.hanwoolkim，hyun-seoblee，junmokang，sang-hunbae，chulkim，sang-hunlee，johannesschwarz，gijinkim，jin-sukim，donghyuncha，joopyungkim，sungwoonchang，taeheelee，andjisookmoon.dualeffectsofhumanplacenta-derivedneuralcellsonneuroprotectionandtheinhibitionofneuroinflammationinarodentmodelofparkinson’sdisease.celltransplant.2018may；27(5)：814-830.cylindertest：将被检测大鼠放于玻璃透明圆柱体缸中，分别记录并比较大鼠直立时左右上肢贴壁次数。实验连续进行3天，每天两次。steppingtest：被检测大鼠由实验者抱住成45倒立在桌面上，仅单侧上肢接触桌面。由实验者辅助在桌面上行进1m距离，分别记录并比较左右大鼠左右上肢接触桌面次数。随机选取假手术组中的大鼠3只，以及帕金森疾病组的大鼠4只，抽取大鼠外周血约0.5ml，并从外周血中抽提总rna样品，使用mirna专用逆转录试剂盒，取100-200ng总rna进行反转录合成cdna。采用和实施例5中同样的引物和反应条件，针对mir-23b-3p，mir-30b-5p，mir-195-5p，mir-195-3p，mir-342-3p等5个microrna分子进行实时定量pcr反应，并采集数据，对上述microrna的表达量进行统计分析。实时定量pcr反应的结果表明(参见图7c)，mir-23b-3p和mir-30b-5p的表达量在大鼠帕金森疾病组的外周血中显著下降，而mir-195-3p和mir-342-3p的表达量在帕金森疾病组的外周血中显著上升，此外，mir-195-5p的表达量在帕金森疾病组的外周血中也表现出上升的趋势(p＝0.06)。综上所述，筛选出的5个microrna分子在大鼠帕金森疾病模型外周血中的表达模式和帕金森病人的具有一致性，证实了以上microrna分子与帕金森疾病的相关性。实施例7.帕金森病患者和健康志愿者的外周血中mirna表达量分析根据实施例5.1.3，利用实时定量pcr技术对帕金森病人1-5(分别表示为pd1，pd2，pd3，pd4和pd5)和健康志愿者中小rna的表达量进行逐一鉴定，然后取志愿者的表达量平均数作为标准，计算帕金森病人外周血中小rna的相对表达倍数(见表3)，并选择最高和最低的数值确定相对表达范围。其中mir-22-3p和mir-185-5p用作内参校准mirna的表达量，扩增mir-22-3p和mir-185-5p的内参上游引物为通用引物，内参下游引物序列如seqidno：11-12所示。见表2。病人及健康志愿者的外周血样本定量pcr结果见图8a-e。相对于志愿者的平均表达量，mir-23b-3p在帕金森病人中的表达量为其0.0156-0.0256倍，mir-30b-5p的表达量为其0.046-0.188倍，mir-195-5p的表达量为其5.025-8.01倍，mir-195-3p的表达量为其2.007-8.467倍，而mir-342-3p的表达量为其0.1283-0.2312倍(仅显著差异部分)。表3.帕金森病人外周血中5个小rna的表达量mir-23b-3pmir-30b-5pmir-195-5pmir-195-3pmir-342-3pck11111pd-10.0149800870.0752453545.025125632.007360320.1399776pd-20.0536137320.0988723958.010050251.079959850.231243pd-30.0155942710.0465016295.23618091.403144860.1283595pd-40.0780462540.1884896115.296482418.467045830.9819429pd-50.025690850.0522202751.381909557.411174310.9882419注：ck代表对照组的表达量平均值，pd-1至pd-5代表不同帕金森病人相对对照组的表达量倍数。实施例8.microrna对帕金森病相关基因的表达调控作用分析利用microrna.org(www.microrna.org)生物信息学工具中的targetmrna子选项进行帕金森病相关基因的microrna调控分析，首先选择snca，lrrk2，htra2，uchl1，dj-1，pink-1，gak，pla2g6，atp13a2，gigyf2等相关基因输入，然后通过序列匹配鉴定出上述基因中的小rna调控位点。结果见图9a。分析显示，5个小rna对数个帕金森病相关基因的表达起到调控作用，包括mir-23b-3p调控snca基因的表达，mir-30b-5p调控lrrk2的表达，mir-195-5p和mir-195-3p调控pla2g6及atp13a2的表达，而mir-342-3p也对snca有表达调控作用。进一步地，用本发明的小rna类似物(mimic)或抑制物(inhibitor)对人源神经干细胞(武汉睿健医药科技有限公司nouvneutm人源神经干细胞，目录号rj1000)进行转染(其中所述类似物分别是人工合成的本发明的mirna，抑制物分别为本发明mirna的完全互补配对序列)，通过mimic对小rna超量表达，利用inhibitor对小rna进行抑制，然后检测帕金森病相关基因的表达变化。由图9b-d可见，mir-23b-3p(inhibitor)抑制物转染的神经干细胞中lrrk2，uchl1，snca基因的表达量显著上升，而gak，pink1，pla2g6基因的表达量显著下降；mir-30b-5p抑制物转染的神经干细胞中fbox7，gak，pink1，htra2基因的表达量显著下降；mir-195-3p的类似物(mimic)转染的神经干细胞中lrrk2，gak基因的表达量显著下降，而atp13a2，snca，uchl1基因的表达则显著上升。由此可知，本发明筛选到的小rna可以调节帕金森病相关基因的表达量，从而影响帕金森病的发病进程，与该疾病的发生有着直接联系。检测各基因表达所用的引物参见下表4。表4.扩增与怕基森病相关基因的引物本发明采用高通量rna测序技术在病人外周血中鉴定出与帕金森病程相关的microrna群体，结合生物信息学和分子生物学的方法筛选出5个与帕金森病程最相关的microrna分子作为疾病诊断的候选标志物，并最终在帕金森病人群体和大鼠疾病模型中验证了其与帕金森疾病的相关性，具有重要的作用。进一步地，本发明筛选出的microrna分子为帕金森临床治疗提供了新的靶标位点，具有良好的临床应用前景。当前第1页12