一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒的制作方法

本发明涉及检验检疫技术领域，具体涉及一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒(asfv)检测中的应用及试剂盒，尤其涉及一种基于蜂巢芯片的非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟(africanswinefever,asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus,asfv)引起猪的一种急性、高度传染性和致死性的疾病，其特征是发病时间短，死亡率高达100％，临床表现为高热、腹泻、皮肤和内脏广泛性出血等(normile,d.,2018,science,361,741；ma,j.,etal.,2020,preventiveveterinarymedicine,175,104861；galindo,i.,&alonso,c,2017,viruses,9(5),103)。asf最早于1921年报道于非洲的肯尼亚地区，之后迅速扩散到欧洲、拉美和亚洲等60多个国家，给世界造成了巨大的经济损失(montgomery,r.e.,1921,journalofcomparativepathologyandtherapeutics,34,159-191；costard,s.,etal.,2013,virusresearch,173(1),191-197；deigiudici,s.,2019,archivesofvirology,164(3),739-745)。2018年8月，asf首次在中国辽宁沈阳爆发，随后迅速波及其他多个省份。截止2020年3月5日，中国已有32个省份共爆发了165起非洲猪瘟疫情，累计扑杀生猪1,193,000头，给中国乃至全世界的养猪业带来了巨大的威胁(http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/asf/situation_update.html)。根据世界动物卫生组织(oie)发布的2019版动物疫病通报名录，asf被列为必需通报的动物疫病。

asfv是一种呈二十面体对称的dsdna病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一已知的虫媒病毒。asfv的基因组巨大，长度约170～190kb，共编码150～200种蛋白质(alonso,c.,etal.,2018,journalofgeneralvirology,99(5),613-614；wang,n.,etal.,2019,science,366(6465),640-644)。由于asfv复杂的基因组成和高度变异性，已根据同源性较高的编码衣壳蛋白vp72的基因b646l被划分为24个基因型，也有结合其他基因如b602l被划分为更多亚型(quembocj.,etal.,2018,transboundemergdis,65(2):420–431)。目前，asf尚无有效的治疗方式和疫苗，扑杀和焚烧是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、准确地检测asfv至关重要。

现有的asfv检测方法可以分为两类：(1)免疫学检测方法，包括病毒分离法(rowlands,r.j.,etal.,2008,emerginginfectiousdiseases,14(12),1870)、红细胞吸附试验(rodríguez,j.m.,etal.,1993,journalofvirology,67(9),5312-5320)、酶联免疫吸附测定(cubillos,c.,etal.,2013,virusresearch,173(1),159-167)、荧光抗体检测(gallardo,c.,etal.,2015,journalofclinicalmicrobiology,53(8),2555-2565)等。虽然病毒分离法(vi)和红细胞吸附试验(had)非常可靠和有效，但耗时较长，操作繁琐，需要高质量的组织来培养细胞，不适合快速检测。酶联免疫吸附测定(elisa)和荧光抗体检测(fat)操作简便，可以准确识别asfv的抗体，但它们受限于检测灵敏度，在感染初期无法准确检测，猪在抗体阳性之前就可能因病毒感染而亡。因此，分子生物学检测因其操作简便快速、高灵敏度和高特异性而成为主流检测方法。(2)分子生物学检测方法，包括荧光定量pcr(m.,etal.,2003,journalofclinicalmicrobiology,41(9),4431-4434)、lamp(james,h.e.,etal.,2010,journalofvirologicalmethods,164(1-2),68-74)、rpa(wang,j.,etal.,2017,canadianjournalofveterinaryresearch,81(4),308-312)等。荧光定量pcr是被世界动物卫生组织(oie)认定的实验室检测asfv的金标准，但依赖于精密的热循环仪器和专业操作人员，不适用于资源有限地区的现场检测。等温扩增由于其操作简便、无需精密仪器、耗时短等优点，在分子检测领域发挥越来越重要的作用。近年来，许多研究人员将lamp或rpa与crispr系统和试纸条结合用于asfv的检测，既能提高灵敏度，又能实现现场快速检测(wangx.,etal.,2020,acsnano,14(2):2497–2508；yuan,c.q.,etal.,2019,analchem,92(5):4029–4037；wang,x.,etal.,2020,communicationsbiology,3(1):62；bai,j.,etal.,2019,frontiersinmicrobiology,10:2830)，但它们需要先通过等温扩增富集产物，再转移到检测体系中，扩增和检测相分离，开盖容易造成气溶胶污染，引起假阳性结果，并且增加了操作步骤。此外，以上提及的所有方法都只靶向asfv的单个基因，例如编码病毒衣壳蛋白vp72的基因b646l(wang,j.,etal.,2017,canadianjournalofveterinaryresearch,81(4),308-312)，编码拓扑异构酶ii的基因p1192r(james,h.e.,etal.,2010,journalofvirologicalmethods,164(1-2),68-74)，编码dna结合蛋白vp10的基因k78r(wang,d.,etal.,2020,journalofvirologicalmethods,276:113775)，很容易因为asfv庞大、复杂而多变的基因组特点，引起由单个基因突变带来的假阴性结果。

现有专利文献cn110373500a公开了一种双重荧光pcr检测试剂盒，选用了针对非洲猪瘟病毒的两个基因(b646l和b438l)的保守片段的引物和探针。另专利文献cn111020062a公开了一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒，针对非洲猪瘟病毒cd2v、vp72、mgf-36014l三个基因。但它们的不足之处在于pcr是变温反应，需要依赖精密的多通道荧光pcr仪，价格昂贵，体积庞大，不适合猪场的现场即时检测。同时，受限于同一个pcr管内多对pcr引物之间的竞争和干扰，检测重数不易提高，而非洲猪瘟作为一种病毒，基因可能不断变异，提高重数能更加保证准确性。

综上所述，非洲猪瘟检测领域急需开发一种靶向asfv多个基因的、简单快速、灵敏度高、无需开盖、适用于现场检测的多重核酸检测方法。

技术实现要素：

针对现有检测方法主要存在的两个技术问题：只针对asfv单基因检测、依赖于复杂精密的仪器，本发明提供一种非洲猪瘟病毒(asfv)多基因检测的lamp引物组及试剂盒。针对问题一，本发明根据asfv的5个基因设计和筛选lamp引物进行检测，能有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，提高阳性检出率；针对问题二，本发明结合蜂巢芯片实现了一次反应同时检测多个基因，结合lamp直扩法免去了核酸提取步骤，既能实现多重可视化检测，又不依赖精密仪器和专业操作，具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速等优点，适合口岸检验检疫和现场即时检测，具有良好的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种靶标基因组合在非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用，所述靶标基因组合包括b646l、b962l、c717r、d1133l和g1340l基因。

本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒多基因检测的lamp引物组，其特征在于，所述的引物组包含5套lamp引物，分别靶向非洲猪瘟病毒的5个基因：b646l、b962l、c717r、d1133l、g1340l，由seqidno.1～no.30所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒，所述的试剂盒包含前述的lamp引物组。

优选地，所述的试剂盒还包含蜂巢芯片、加样接头、样本裂解液、lamp反应液、阳性和阴性对照、封口膜、反应管。

优选地，所述的lamp引物组是经过pcr管内和芯片上的lamp反应层层筛选获得，分别被预固定在蜂巢芯片的相应位置上。

优选地，所述的蜂巢芯片是一种集成数根毛细管的微阵列，形似“蜂巢”，因此被命名为“蜂巢芯片”，该蜂巢芯片是经过疏水修饰和引物预固定后被固定于反应管中；

所述的加样接头可以与蜂巢芯片和反应管紧密结合，实现多根毛细管的同时进样；

所述的样本裂解液的主要成分是naoh，用于猪血样本的前处理，释放非洲猪瘟病毒的核酸。

优选地，所述的lamp反应液含有1×thermopol缓冲液，8.0mmmgso4，1.4mmdntps，0.8m甜菜碱，25μm钙黄绿素，0.5mmmncl2,0.32uμl^-1bstdna聚合酶。

优选地，所述的阳性对照为不含有非洲猪瘟病毒核酸序列的质粒，其对应的lamp引物被预先固定在蜂巢芯片上标有“pc”的毛细管内。

优选地，所述的阴性对照为在蜂巢芯片上标有“nc”的毛细管内不固定任何引物的对照。

所述的封口膜具有光学透性，既可以用于加样完成后封闭反应管，避免气溶胶污染，又不会影响结果的可视化检测。

本发明还提供了一种根据权利要求3所述的试剂盒进行非洲猪瘟病毒多基因检测的方法，包括猪血样本的采集和前处理、加样、孵育和检测的步骤，所述方法的总耗时少于70min。

优选地，所述方法的具体步骤如下：

猪血样本的采集：将猪血样本采集后需要储存在抗凝管中；

前处理：取储存在抗凝管中的猪血样本与样本裂解液按1:2的体积比充分混合，室温裂解3min，然后吸取裂解后的混合液与lamp反应液按1:24的体积比混合；

加样：吸取前处理获得的混合液插入加样接头，移至反应管进行加样，然后移除加样接头，并用封口膜密封反应管；

孵育和检测：63℃反应1h，并用紫外照射进行可视化检测。

优选地，所述紫外照射采用手持式紫外照射装置，所述孵育的温控和检测可集成于一个自动化装置，由软件程序控制其自动运行。

本发明既可以针对单个样本进行检测，也可以集成8连管针对多样本进行检测。

本发明所述lamp引物组制备得到的asfv多重核酸检测试剂盒，利用蜂巢芯片和lamp直扩法建立了整个检测流程。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、针对asfv基因组复杂多变、基因型众多的特点，选取多个基因的保守序列设计和筛选lamp引物，有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，提高阳性检出率；

2、结合蜂巢芯片，实现了快速加样、密封扩增和多重可视化检测。

3、结合lamp直扩法，简化样本前处理，无需核酸提取，大大提高了检测效率，并且lamp等温扩增的方式适用于偏远地区的现场检测。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1中pcr管内引物的有效性和特异性测试结果；

图2为本发明实施例2中蜂巢芯片上引物的特异性和灵敏度测试结果；

图3为本发明以实施例3为例的asfv检测流程图；

图4为本发明实施例3中猪血模拟样本的检测结果；

图5为本发明实施例3中oie(世界动物卫生组织)推荐的两对pcr引物与现有asfv菌株中目的序列的比对结果；

图6为本发明实施例4中作为性能对比的商业化试剂盒的灵敏度测试结果；

其中，芯片模式图中1-5分别表示b646l、b962l、c717r、d1133l、g1340l，pc表示阳性对照，nc表示阴性对照；

图7为本发明实施例5中非洲猪瘟病毒基因组dna样本的芯片检测结果；

图8为本发明实施例6中与其他三种猪病毒基因组dna的特异性测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：基于in-tubelamp测试引物的有效性和特异性

根据china/2018/anhuixcgq病毒株的基因组分析结果(bao,j.,etal.,2019,transboundaryandemergingdiseases,66(3),1167-1176)，将asfv的所有单基因名称逐一输入ncbi数据库中进行检索，下载所有检索到的序列并进行序列比对，最终选取5个具有1000bp左右保守序列的基因，利用primerexplorerv5软件进行lamp引物设计，每个基因设计4套引物，用含钙黄绿素染料的常规lamp反应对所有引物进行筛选验证，每种基因筛选出一套可以成功检出的lamp引物组，最终选择5种用于asfv检测的引物组(如表2所示)，分别靶向5个基因b646l、b962l、c717r、d1133l、g1340l，未选择的引物组如表3所示。

本实施例选取的1000bp左右的保守序列只是相对保守、剔除了某些突变菌株以后的序列，因为即使oie推荐的pcr引物，也不是完全保守，仍然有菌株出现突变(图5)，由此我们得到了5个基因。具体的选取过程和原则如下：(1)根据ii型非洲猪瘟病毒株(china/2018/anhuixcgq)与其他主要ii型病毒株(即pol/2015/podlaskie,estonia2014,russia/odintsovo_02/14/boar和georgia2007/1)的基因组比较揭示了在所有五个ii型非洲猪瘟病毒株中，有118个相同的开放阅读框，包括16种结构蛋白和参与形态发生的蛋白、25种参与核苷酸代谢、转录、复制和dna修复的蛋质、3种具有其他酶促活性的蛋白、4种参与宿主细胞的相互作用的蛋白、25个多基因家族(multigenefamily，mgf)的蛋白和47个功能未知的蛋白(bao,j.,etal.,2019,transboundaryandemergingdiseases,66(3),1167-1176)；(2)由于已知非洲猪瘟病毒基因组之间的大多数变异是由多基因家族成员的增加和缺失引起的，因此该家族的基因被排除在外；(3)靶基因应尽可能地从不同的基因功能类型中选择，目的是确保基因类型的多样性，避免某一类基因的突变；(4)靶基因的长度1000bp左右，目的是确保与genbank数据库中列出的已知菌株进行多序列比对，获得用于引物设计的保守序列。下表1是根据以上原则选择的基因信息。

表1.用于非洲猪瘟病毒检测的靶标基因组合含有的基因信息

表2.选择的5种用于非洲猪瘟病毒检测的lamp引物组

表3.未选择的lamp引物组

将5个基因的质粒标准品作为模板，用含钙黄绿素荧光染料的常规lamp进行引物的有效性和特异性测试，具体反应体系如表4所示，反应产物通过紫外光照射和琼脂糖凝胶电泳两种方式检测。

图1a是5个基因的引物有效性测试结果，图1a的左侧图表示每个基因分别用4套lamp引物扩增后的荧光检测结果，右侧图表示将左侧对应管内的扩增产物进行凝胶电泳的结果；p表示加入质粒模板，n表示加入超纯水作为对照，1-4表示4套引物。通过比较n组和p组的荧光检测和凝胶电泳结果发现：基因b646l、b962l、d1133l、g1340l的4套引物都能成功检测靶基因，而基因c717r仅有2号引物组能成功检测，这也证明了设计多套引物以筛选最优引物的必要性。

基于引物有效性的测试结果，我们从每个基因中各选取了1套引物进行彼此间的特异性测试，即b646l-2，b962l-2，c717r-2，d1133l-3，g1340l-1，然后用这5套引物分别去扩增每个基因，看是否会产生非特异性扩增，测试结果如图1b所示。通过比较n组和p组的荧光检测和凝胶电泳结果发现，5套引物与模板之间无交叉反应，仅各自的基因模板和对应引物加入同一ep管内，才能成功检测到产物。

综上所述，通过in-tubelamp对引物的有效性和特异性测试，得到了5种能够用于asfv检测的引物组，且彼此之间无交叉反应。

表4.常规lamp反应体系

实施例2：基于on-chiplamp测试引物的特异性和灵敏度

利用蜂巢芯片进行引物的特异性和灵敏度测试，实施例1得到的5种lamp引物组和阳性对照的引物组已经被预固定在对应的毛细管位置上，芯片模式图中1-5分别表示b646l、b962l、c717r、d1133l、g1340l，pc表示阳性对照，nc表示阴性对照，具体反应体系如表5所示，反应产物通过紫外光照射进行检测。

图2a是5个基因的引物特异性测试结果，逐次地将单个基因的质粒模板和阳性对照质粒与lamp反应液混合，然后加载到芯片上，63℃反应1h，用手持式紫外照射装置进行可视化检测。结果表明，在5张asfv基因检测的芯片图中，除了阳性对照以外，仅各自的基因模板加入时，才能成功地在对应引物位置上检测到荧光。

图2b是5个基因的引物灵敏度测试结果，将5种基因的质粒模板和阳性对照质粒混合后逐级稀释，然后与lamp反应液混合后加载到芯片上，63℃反应1h，用手持式紫外照射装置进行可视化检测。结果表明，当模板浓度为880拷贝/微升、88拷贝/微升、30拷贝/微升时，5个基因靶标均能够被成功检测；而当模板浓度为15拷贝/微升时，仅有3(c717r)和4(d1133l)两个靶标检测到荧光，与预期信号不符，因而将最低检测限定义为30拷贝/微升，即48拷贝/毛细管。世界动物卫生组织(oie)推荐的pcr引物的灵敏度约600拷贝/反应(wilkinsonp.j.officeinternationaldesepizooties2000,pp.189-198；kingdp,,etal,2003,jvirolmethods,107(1):53-61；luoy.,etal.,2017,archvirol,162(1):191-199)，进一步表明我们筛选的引物灵敏度满足实际检测要求。

表5.芯片lamp反应体系

综上所述，通过on-chiplamp对引物的特异性和灵敏度测试，确认实施例1所选择的5种引物组具有高度特异性，并且整体灵敏度低至30拷贝/微升，个别靶标低于15拷贝/微升。

实施例3：基于蜂巢芯片对猪血模拟样本的多重核酸检测(含单基因突变检测结果)

利用蜂巢芯片进行猪血模拟样本的测试，引物预固定模式和反应体系同实施例2，整个反应流程如图3所示。

首先将5种基因的质粒模板混合后逐级稀释，然后取10μl混合质粒与90μl抗凝处理的猪血混合作为模拟样本；接着取10μl模拟样本与20μl的样本裂解液充分混合，室温裂解3min，然后吸取1μl裂解样本和1μl阳性对照与23μllamp反应液混合，加载到芯片上，63℃反应1h后检测荧光，结果如图4a所示。从芯片结果图可以得到两条结论：(1)采用lamp直扩法不会影响asfv基因的扩增及检测，并且猪血模拟样本的最低检测限是50拷贝/微升，即80拷贝/毛细管，与纯质粒样本相当，而世界动物卫生组织(oie)推荐的pcr引物的灵敏度约600拷贝/反应(wilkinsonp.j.officeinternationaldesepizooties2000,pp.189-198；kingdp,,etal,2003,jvirolmethods,107(1):53-61；luoy.,etal.,2017,archvirol,162(1):191-199)，这表明我们筛选的引物灵敏度满足实际检测要求；(2)仅加入阳性对照质粒的猪血模拟样本，除阳性对照孔外，未检测到其他荧光信号，表明猪血的复杂背景不会使引物产生非特异性扩增，也进一步验证了lamp引物的特异性。

为了进一步证明asfv多重检测的必要性，我们对genbank数据库中的已有菌株进行了序列比对，并将发现的点突变引入质粒模板中进行检测，观察是否会出现假阴性结果。以编码vp72的b646l基因为例，图4b展示了61个菌株的序列比对结果，深色标注的碱基表明虽然尽可能截取了保守序列进行引物设计，但在某些菌株中仍然存在点突变。因此，我们根据序列比对结果，将来自4个现有菌株(genbank：ef121429.1、mh025920.1、km111295.1、mh025919.1)的5个突变位点(c355a、c360t、c365g、c373a、a379g))引入b646l质粒中，进行芯片检测，结果如图4c所示。与预期一致，针对b646l基因检测的1号毛细管未检测到阳性信号，出现了假阴性结果；而其他4个基因显示阳性信号，此时就避免了漏检问题的发生。

此外，我们还将oie(世界动物卫生组织)推荐的p两对pcr引物(oie-f/oie-r和ppa-1/ppa-2)与靶向序列进行了序列比对，结果如图5所示。深色标注的碱基表明引物oie-f和ppa-1的识别位置存在很多点突变，并且有些突变位于引物的3’端，很可能引起假阴性结果，这也更加说明了asfv多重检测的必要性。

实施例4：蜂巢芯片与商业化试剂盒的检测能力对比

我们购买了中国动物疫病预防控制中心批准的非洲猪瘟检测pcr试剂盒和lamp试剂盒(广州悦洋生物技术有限公司)，将利用蜂巢芯片进行检测的样本同时用商业化试剂盒检测，结果如图6所示。除了阳性对照(pc)和阴性对照(nc)外，我们设置了5个浓度梯度，分别为10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝每反应。结果显示，当模板含量为10拷贝每反应时，ct值为0，表明这两种商业化试剂盒的灵敏度均为100拷贝/反应，低于蜂巢芯片的80拷贝/反应的灵敏度，这也进一步证明了我们平台的实用性。

实施例5：蜂巢芯片检测非洲猪瘟病毒的基因组dna(实际样本)

为了检测实际样本，我们从华南农业大学国家非洲猪瘟病毒区域实验室院获得了3份非洲猪瘟病毒的基因组dna样本，并用蜂巢芯片进行检测，结果如图7所示。芯片的可视化结果与荧光定量的结果一致，三份样本均可以被成功检出，从而验证了我们平台实际检测的可靠性。

实施例6：蜂巢芯片检测其他猪病毒的基因组dna的特异性测试(实际样本)

为了进一步证明筛选到的lamp引物组与其他常见猪病毒之间的特异性，我们又从华中农业大学获得了猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)和猪细小病毒(ppv)的基因组dna样本各3份，并用蜂巢芯片进行检测，结果如图8所示。芯片的可视化结果与荧光定量的结果一致，除了阳性对照(pc)外，其他毛细管均无扩增信号，从而证明了我们的lamp引物组具有高度特异性，与其他常见猪病毒无任何交叉反应。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>上海真测生物科技有限公司

<120>一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒

<130>dd10330

<160>120

<170>siposequencelisting1.0

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