双功能硫解酶基因MvaE、其表达载体、重组菌株及其应用的制作方法

双功能硫解酶基因mvae、其表达载体、重组菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及双功能硫解酶基因mvae、其表达载体、重组菌株及其应用。


背景技术：

2.脂肪酸是重要的平台化学品，可广泛应用于生物燃料、有机洗涤剂、橡胶复合物、塑料制品、纺织化学品和食品添加剂的合成。传统的脂肪酸获取途径包括直接从动植物细胞提取分离和以石油产品经化学法合成。这些方法存在着效率低、成本高、土地占用率高及环境不友好等缺点。相较于传统方法，脂肪酸的微生物合成法在成本、土地占用率及环保方面具有先天优势，被认为是能够替代传统方法的最具潜力的一种方法。然而目前制约脂肪酸的微生物合成效率的关键技术尚未得到彻底解决。微生物合成脂肪酸的产量及种类与脂肪酸代谢途径的优化及关键酶的催化性质密切相关。
3.脂肪酸的生物合成主要由两种代谢途径实现，即通过脂肪酸的正向合成和脂肪酸β
‑
氧化的逆循环实现。一些硫解酶可促使脂肪酸的β
‑
氧化的逆循环，使脂肪酸β
‑
氧化的产物乙酰辅酶a沿脂肪酸的β
‑
氧化途径逆向回流至脂肪酸形成。研究显示，不同类型硫解酶可影响脂肪酸合成的效率和碳链的延伸长度。将内源性硫解酶、脱氢酶以及一系列的外源硫酯酶在大肠杆菌中共表达，可促使脂肪酸β
‑
氧化的逆循环合成不同链长的脂肪酸和脂肪醇，多以短链的形式富集。合成型硫解酶与正向途径脂肪酸合成酶共表达增强β
‑
氧化逆循环中的还原反应，加速脂肪酸合成。脂肪酸的产量受多种因素的影响，其中关键酶的选择以及多种脂肪酸代谢相关基因的协同表达对于脂肪酸合成效率的提高及脂肪酸合成碳链长度的调控起到至关重要的作用。


技术实现要素：

4.发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种双功能硫解酶基因mvae。
5.本发明还要解决的技术问题是提供了一种双功能硫解酶。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组菌或细胞，其含有所述的双功能硫解酶基因mvae。
7.本发明还要解决的技术问题是提供了双功能硫解酶基因mvae、所述的双功能硫解酶、所述的表达盒、重组载体、重组菌或细胞在脂肪酸合成中的应用。
8.本发明最后要解决的技术问题是提供了一种生产脂肪酸的方法。
9.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种双功能硫解酶基因mvae，所述双功能硫解酶基因mvae的核苷酸序列为：
10.i)seq id no：1所示的核苷酸序列或seq id no：2所示的核苷酸序列；或
11.ii)seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或
12.iii)与i)、ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
13.本发明内容还包括一种双功能硫解酶，所述双功能硫解酶其氨基酸序列如seq id no：3所示。
14.本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组菌或细胞，其含有所述的双功能硫解酶基因mvae。
15.其中，所述重组载体是将的双功能硫解酶基因mvae导入载体质粒pstv28获得。
16.其中，所述重组菌是将双功能硫解酶基因mvae导入宿主菌，筛选鉴定后保留阳性菌株，即为含有可表达的mvae的重组菌株。
17.其中，所述宿主菌包括但不仅限于为大肠杆菌mg1655。
18.本发明内容还包括所述的双功能硫解酶基因mvae、所述的双功能硫解酶、所述的表达盒、重组载体、重组菌或细胞在脂肪酸合成中的应用。
19.本发明内容还包括一种生产脂肪酸的方法，将所述的重组菌接种到发酵培养基中进行发酵培养获得。
20.其中，所述发酵温度为25
‑
38℃；所述发酵体系的初始ph值为6.5
‑
7.5；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。
21.其中，所述发酵培养基包括甘油、蛋白胨、酵母粉及氯化钠溶解于ph7.0
‑
7.5的mops缓冲液中即得。
22.本发明所述的重组菌能够过表达双功能硫解酶基因mvae，从而可显著提高宿主菌中c
14：0
，c
16：0
和c
18：0
脂肪酸含量。
23.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明中过表达的人工设计的双功能硫解酶基因mvae在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖、甘油或其它碳源的丰富培养基为原料可提显著高宿主菌中c
14：0
，c
16：0
和c
18：0
脂肪酸含量，其增加幅度根据不同宿主菌株从27％到213％不等。
附图说明
24.图1为mvae对大肠杆菌mg1655菌落形态的影响；
25.图2为anthony氏荚膜染色实验；
26.图3为苏丹黑染色实验。
具体实施方式
27.下面将结合以大肠杆菌为宿主菌的实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
28.实施例1：基于大肠杆菌密码子偏好性进行的双功能硫解酶基因mvae的人工设计和合成
29.根据seq id no：1所示的mvae基因的dna序列对mvae基因密码子进行优化以利于其在大肠杆菌中表达。优化后的核酸序列添加核糖体结合位点序列后如seq no：2所示。该
密码子优化后的基因序列有生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成的基因序列的5’和3’末端分别带有bamh i和hind iii酶切位点。
30.实施例2：用于大肠杆表达mvae基因的表达载体pstmvae的构建
31.将有如seq no：2的dna序列构建于表达载体上，如pstv28载体。具体实施步骤如下：
32.将实施例1合成dna片段及载体质粒pstv28分别用bamh i和hind iii进行双酶切；琼脂糖电泳回收酶切dna片段及载体大片段，通过dna连接酶将酶切后的基因片段依次于16℃连接于pstv28的对应酶切产物形成pstmvae。用每次的连接反应产物转化大肠杆菌mg1655，然后涂于含30μg/ml cmp(氯霉素)的培养皿，37℃培养10
‑
12h。次日挑取单菌落采用上海生工质粒小量提取试剂盒提取质粒。获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。结果显示pstmvae质粒成功构建。
33.实施例3过表达双功能硫解酶基因mvae的大肠杆菌重组菌的构建
34.将实施例2中pstv28和pstmvae质粒分别电转化到大肠杆菌mg1655中，分别得到大肠杆菌工程菌株mg：pstv28和psmg：pstmvae。
35.实施例4：大肠杆菌重组菌的发酵培养
36.将实施例3获得的工程菌株mg：pstv28和psmg：pstmvae的阳性单菌落分别接种到含有30μg/ml氯霉素的5ml的lb试管培养基中37℃培养8小时，以1％(v/v)的接种量接种到含有30μg/ml氯霉素的50ml的发酵培养基中。
37.发酵培养基配方(1l)：将2g甘油、10g蛋白胨、10g酵母粉及5g氯化钠溶解于800ml ph 7.0
‑
7.5的10mm mops缓冲液中并最终用10mm mops定容到1000ml。
38.在30℃，250rpm摇床中将接种后的大肠杆菌工程菌mg：pstv28和psmg：pstmvae培养物发酵至od
600
为0.4
‑
0.6时加入终浓度为0.1mm的异丙基β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，并在该条件下培养24小时取样，用于后续细胞浓度及脂肪酸成分检测(具体脂肪酸成分的检测结果见实施例5)。
39.实施例5：过表达mvae对大肠杆菌mg1655菌落形态及中性油脂富集的影响
40.双功能硫解酶mvae的大肠杆菌重组表达菌株的菌落形态较未表达该酶的对照组发生了显著的变化，呈现为油滴状或者黏液状(图1a)表示点样结果；图1b表示划线结果。
41.对mvae重组表达菌株和对照组进行了anthony氏荚膜染色实验(图2)。具体实验步骤为：负染色法：(1)制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布；(2)干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干；(3)染色：在涂面上加复红染色液染色2
‑
3min；(4)水洗：用水洗去复红染液；(5)干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干；(6)涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干；(7)镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。
42.结果显示并没有发现荚膜的形成，从而排除了菌落的油化或黏液化是由荚膜形成引起的可能。
43.以苏丹黑b为染色剂，测定了酿酒酵母中性脂类的含量。诱导后的酵母细胞用0.1％苏丹黑b溶液在70％乙醇中制备10min，然后用70％乙醇冲洗3次以上，制成用于显微镜检测的样本玻片。脂溶性染料苏丹黑b染色的结果显示，mvae重组表达菌株的细胞内苏丹
黑富集量要显著强于对照组(图3)。
44.实施例6：过表达mvae对大肠杆菌mg1655的c
14：0
、c
16：0
和c
18：0
脂肪酸含量的气相色谱检测
45.大肠杆菌脂肪酸的提取和酯化方法：
46.(1)取4ml实施例4的发酵方法得到的液体发酵液，8000转/min离心15min后去掉上清，加1ml去离子水重新悬浮，加100μl乙酸酸化，(用15ml的塑料管)；
47.(2)取3ml氯仿
‑
甲醇(1∶1体积比)裂解，每隔10分钟震荡混匀，室温2小时。
48.室温静置2小时；
49.(3)取0.5ml的下层有机相于新的带盖子的1.5ml离心管，真空抽干(时间较长，可以过夜)；
50.(4)干燥后的有机相重新悬浮于300μl5％硫酸/甲醇(5％硫酸溶于甲醇；vol/vol)溶液。容器用带盖子的1.5ml离心管。60℃温浴4h(60℃烘箱)；
51.(5)向反应混合液中加入300μl 0.9％(wt/vol)nacl溶液，震荡混匀；
52.(6)用600μl的二氯甲烷提取脂肪酸甲脂(每隔10分钟震荡混匀，室温1小时)；
53.(7)300～400μl的下层二氯甲烷有机相转移至气相色谱玻璃瓶，用于气相色谱检测。
54.气相色谱仪操作方法：(1)程序升温，设定起始温度为40℃，保留时间为3min，以10℃/min的速率升温到120℃，再以20℃/min的速率升温到230℃，保留时间为2min。(2)然后设定进样口温度为250℃，fid检测器温度为280℃，进样体积为0.2μl，分流比为25∶1，设定完成后，将气象色谱柱按顺序摆放在气相色谱仪中，点击start开始运作。
55.气相色谱检测结果显示这c
14：0
，c
16：0
和c
18：0
脂肪酸的总含量比空质粒对照组高78％(表1)，进一步证实mvae过表达大肠杆菌中的c
14：0
，c
16：0
和c
18：0
脂肪酸含量有了不同程度的提高。
56.表1大肠杆菌三种主要脂肪酸胞内含量的气相色谱检测
a
[0057][0058]
a、各菌株均在lb液体培养基中未经诱导剂诱导(采用渗漏表达)培养24小时。
[0059]
b、脂肪酸。
[0060]
c、菌株mg：pstmvae比mg：pstv28脂肪酸含量的增加量。
[0061]
d、脂肪酸含量的增加比率；(δfa/mg：pstv28)*100。
[0062]
e、这里脂肪酸的总量表示的是c
14：0
，c
16：0
和c
18：0
脂肪酸含量的总和。